付敬杰,韋娜,史銀花,許晶晶

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科,河南 鄭州 450000)

隨著影像學(xué)檢查的普及,甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率越來越高[1]。術(shù)前病理診斷不僅決定是否需要手術(shù),還為手術(shù)范圍、手術(shù)策略的確定提供了可靠的依據(jù),因此在術(shù)前準(zhǔn)確篩選出甲狀腺惡性結(jié)節(jié)是非常重要的[2]。美國甲狀腺學(xué)會(American Thyroid Association,ATA )于2015年發(fā)布的《成人甲狀腺結(jié)節(jié)與分化型甲狀腺癌指南》[3]指出,超聲診斷為“高?！钡募谞钕俳Y(jié)節(jié)的惡性腫瘤發(fā)生率為70%～90%,此類結(jié)節(jié)應(yīng)在超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢[4]。然而,細(xì)針穿刺得到的標(biāo)本無法診斷或標(biāo)本不滿意,即細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類[5]的概率為10%～20%[6]。對于細(xì)胞學(xué)無法診斷的甲狀腺結(jié)節(jié),Bethesda指南給出的建議是3個月后重復(fù)細(xì)針穿刺,然而由于重復(fù)細(xì)針穿刺的費用較高,且時間間隔較長,有必要尋找一種特異性較高的檢測手段來提高此類結(jié)節(jié)的惡性檢出率。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,在甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷和預(yù)后評價中,大量的分子標(biāo)志物被引用進(jìn)來。BRAFV600E基因突變是甲狀腺惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要遺傳事件[7]。本文探討B(tài)RAFV600E基因檢測對超聲高危、細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷價值,以及與BRAFV600E突變相關(guān)的臨床超聲表現(xiàn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2018年3月至2019年6月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲檢查提示高危且細(xì)胞學(xué)判讀為Bethesda Ⅰ類(圖1)的患者共780例,其中70例接受BRAFV600E基因檢測和手術(shù)治療。將這70例患者納入研究,其中男12例(17.1%),女58例(82.9%)。經(jīng)組織病理證實的良性甲狀腺結(jié)節(jié)有17例(24.3%),其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫11例,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴纖維化、鈣化6例;惡性甲狀腺結(jié)節(jié)有53例,其中甲狀腺乳頭狀癌(圖2)50例,甲狀腺微小乳頭狀癌3例。

A為低倍鏡下可見大量囊性成分,未見甲狀腺濾泡細(xì)胞團(tuán)(HE染色,放大倍數(shù)4×10);B為高倍鏡下可見少許炎細(xì)胞,雜質(zhì)成分,未見甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞(HE染色,放大倍數(shù)10×10)。

A為低倍鏡下組織排列紊亂,局部形成分枝狀的乳頭結(jié)構(gòu)(HE染色,放大倍數(shù)10×10);B為高倍鏡下腫瘤細(xì)胞的極向紊亂,核增大,重疊,部分呈毛玻璃樣核,可見核溝(HE染色,放大倍數(shù)40×10)。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn):(1)超聲判讀為高危且細(xì)胞學(xué)判讀為Bethesda Ⅰ類的結(jié)節(jié);(2)接受BRAFV600E基因檢測和手術(shù)治療;(3)無頸部放射治療史;(4)具備完整的臨床病歷資料。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)無最終組織病理結(jié)果;(2)重要臨床資料缺如;(3)既往有其他腫瘤病史。具體流程如圖3。

圖3 納入流程圖

1.3 檢查方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1超聲 囑患者平躺于診療床上,選用多普勒超聲儀器,配置7.5～12 MHz的高頻線陣探頭進(jìn)行超聲檢查。高危結(jié)節(jié)[8]是指:(1)實性、低回聲結(jié)節(jié)。(2)同時滿足以下1項或多項可疑惡性超聲征象:①邊緣不規(guī)則;②微鈣化;③縱橫比>1;④邊緣鈣化中斷,低回聲突出鈣化外;⑤侵犯甲狀腺被膜。

1.3.2超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺及BRAFV600E基因檢測 (1)由同一位高級細(xì)胞技術(shù)醫(yī)生在超聲引導(dǎo)下將穿刺針進(jìn)入目標(biāo)結(jié)節(jié),拔出針芯,在結(jié)節(jié)內(nèi)反復(fù)提插穿刺針,充分取材后退出穿刺針;(2)每個穿刺部位應(yīng)至少穿刺2～3次,并將穿刺物放入30 mL清洗液的離心管內(nèi);(3)離心(1 200g離心5 min),去除上清液;(4)將樣本瓶靜置15 min后,使用T1200/T5000/T5000AL制片,并將剩余保存液用于BRAFV600E基因檢測。細(xì)針穿刺診斷標(biāo)準(zhǔn):按照細(xì)胞病理學(xué)Bethesda系統(tǒng)[5]將甲狀腺結(jié)節(jié)分為Bethesda Ⅰ～Ⅵ類;陽性代表BRAFV600E基因突變型,陰性代表野生型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件,計數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)(%)表示。以組織病理為金標(biāo)準(zhǔn),構(gòu)建受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析BRAFV600E基因檢測對超聲高危、細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷效能;應(yīng)用χ2檢驗分析與BRAFV600E基因突變相關(guān)的臨床超聲特征。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1BRAFV600E基因檢測診斷效能70例患者中,有50例(71.4%)BRAFV600E基因突變,20例(28.6%)BRAFV600E基因未突變。以石蠟切片組織病理為金標(biāo)準(zhǔn),BRAFV600E基因檢測診斷超聲高危、細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類甲狀腺結(jié)節(jié)的特異度為88.2%(15/17),敏感度為90.5%(48/53),陽性預(yù)測值為96.0%(48/50),陰性預(yù)測值為75.0%(15/20),陽性率為71.4%(50/70),曲線下面積為0.894。見表1。

表1 BRAF V600E基因檢測診斷效能

2.2BRAFV600E基因突變相關(guān)的臨床資料分析將納入研究的70例患者按照BRAFV600E基因檢測結(jié)果分為兩組,即突變組和未突變組。70例患者70個甲狀腺結(jié)節(jié),49個(70.0%)結(jié)節(jié)的縱橫比≥1;58個(82.9%)結(jié)節(jié)的邊緣不規(guī)則;53個(75.7%)結(jié)節(jié)合并微鈣化。相關(guān)臨床資料分析結(jié)果顯示:患者年齡、性別和結(jié)節(jié)縱橫比兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);結(jié)節(jié)邊緣不規(guī)則、微鈣化、≥2個可疑惡性超聲征象以及惡性組織病理兩組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 BRAF V600E基因突變相關(guān)的臨床資料分析

3 討論

甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查是術(shù)前評估甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的常用手段[9]。標(biāo)本滿意度評估是甲狀腺細(xì)針穿刺診斷不可或缺的一步,它決定了細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果正確與否。恰當(dāng)應(yīng)用滿意度評估標(biāo)準(zhǔn),可減少細(xì)針穿刺診斷的假陰性[10]。雖然大多數(shù)細(xì)胞學(xué)檢查可以獲得明確的診斷結(jié)果,但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)仍有10%～20%的甲狀腺結(jié)節(jié)被歸類為標(biāo)本無法診斷或標(biāo)本不滿意,即細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類[11]。主要包含以下情況[5]:(1)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞團(tuán)少于6團(tuán)、每團(tuán)少于10個濾泡上皮細(xì)胞;(2)制片原因引起的標(biāo)本雜質(zhì)較多、濾泡細(xì)胞被遮蓋或染色不良;(3)大量囊液成分,甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞極少。導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)無法診斷標(biāo)本的原因如下:(1)穿刺者操作不當(dāng),采樣有誤,制片效果不佳;(2)結(jié)節(jié)直徑較小、存在環(huán)狀鈣化,超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺的難度較高,細(xì)針穿刺難以獲得滿意標(biāo)本[12];(3)細(xì)針穿刺能獲取滿意的濾泡細(xì)胞數(shù)量在一定程度上還取決于病變的性質(zhì),結(jié)節(jié)的高囊性容量是導(dǎo)致標(biāo)本無法診斷或標(biāo)本不滿意細(xì)胞學(xué)結(jié)果的獨立危險因素[13]。對于此類結(jié)節(jié),目前采取的措施主要以重復(fù)細(xì)針穿刺為主[14]。然而Woo等[15]發(fā)現(xiàn),重復(fù)細(xì)針穿刺仍然有67.5%的概率再次得到不滿意標(biāo)本,并且Choi等[16]的數(shù)據(jù)分析得出重復(fù)細(xì)針穿刺是第二次得到無法診斷結(jié)果的獨立危險因素;其次,多項研究證明再次穿刺的最佳時間是3個月之后[12,17]。但是超聲判讀為高危的甲狀腺結(jié)節(jié)有著較高(70%～90%)的惡性風(fēng)險,應(yīng)當(dāng)盡早做出明確診斷,3個月的等待期可能會延誤治療,對患者造成心理負(fù)擔(dān)。因此,對于超聲高危、細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結(jié)節(jié),重復(fù)細(xì)針穿刺并非最佳選擇,需要尋找一種高效的檢測方法來區(qū)分這類結(jié)節(jié)的良惡性。甲狀腺濾泡起源的癌傾向為經(jīng)過多級協(xié)同分子事件后不斷進(jìn)展的一組腫瘤,其中BRAFV600E基因突變是最常見的早期驅(qū)動分子改變,其發(fā)生機(jī)制為BRAFV600E基因構(gòu)象改變,激活下游傳導(dǎo)通路,即RAS/RAF/MEK/ERK通路,最終導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)錄增殖失控,產(chǎn)生一系列臨床病理表現(xiàn)[18]。由此看來,對于超聲提示高危、細(xì)胞學(xué)無法診斷的甲狀腺結(jié)節(jié),BRAFV600E基因檢測或許有一定的輔助診斷價值。

本研究探討了BRAFV600E基因檢測對于超聲高危、細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結(jié)節(jié)的臨床價值。數(shù)據(jù)顯示,超聲高危、細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類共70例,以組織病理為“金標(biāo)準(zhǔn)”,53例經(jīng)最終組織病理證實為惡性,惡性率為75.7%。70例超聲高危、細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類甲狀腺結(jié)節(jié),50例發(fā)生BRAFV600E基因突變,基因突變率為71.4%。50例BRAFV600E基因突變的甲狀腺結(jié)節(jié),48例(96.0%)最終證實為惡性。甲狀腺細(xì)胞學(xué)的診斷依靠異型性的濾泡上皮細(xì)胞團(tuán),對于細(xì)針穿刺獲取的濾泡上皮細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量和數(shù)量不足的結(jié)節(jié),細(xì)胞學(xué)無法做出明確診斷,但是BRAFV600E基因檢測可識別出極少量惡性腫瘤細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示BRAFV600E基因檢測診斷超聲高危、細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類甲狀腺結(jié)節(jié)的靈敏度、陽性預(yù)測值都在90.0%以上,表明BRAFV600E基因檢測對于鑒別此類結(jié)節(jié)良惡性具有較好的臨床價值[19],可以降低此類結(jié)節(jié)的漏診率。因此,在臨床上,BRAFV600E基因檢測或可代替重復(fù)細(xì)針穿刺,以輔助診斷超聲高危、細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結(jié)節(jié)。國內(nèi)外研究表明BRAFV600E基因突變與甲狀腺乳頭狀癌的復(fù)發(fā)以及復(fù)發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌放射性碘治療效果欠佳相關(guān)[20-21]。一項大型meta數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,在甲狀腺乳頭狀癌患者中,BRAFV600E基因突變的患者淋巴結(jié)更易發(fā)生轉(zhuǎn)移[22]。由此可見,BRAFV600E基因檢測不僅可以協(xié)助診斷甲狀腺惡性腫瘤,而且對惡性結(jié)節(jié)治療方式的選擇及預(yù)后方面或有很大幫助。

BRAFV600E基因突變與臨床超聲特征的關(guān)系一直是近年來研究的熱點,大多數(shù)的研究方向主要集中在探討甲狀腺結(jié)節(jié)微鈣化、邊緣不規(guī)則以及結(jié)節(jié)縱橫比等[23],然而不同的研究結(jié)論各不相同。Helmi等[24]認(rèn)為BRAFV600E基因突變與低回聲、結(jié)節(jié)鈣化和邊緣不規(guī)則有關(guān),而與結(jié)節(jié)大小和結(jié)節(jié)內(nèi)部成分無關(guān)。本研究表明患者年齡、性別和結(jié)節(jié)縱橫比與BRAFV600E基因突變無關(guān);結(jié)節(jié)邊緣不規(guī)則、微鈣化、≥2個可疑惡性超聲征象以及惡性組織病理與BRAFV600E基因突變相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)2例BRAFV600E基因檢測假陽性的病例,即BRAFV600E基因突變,但細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)和組織病理均為良性。這2例的組織病理結(jié)果均為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。以往文獻(xiàn)也報道過這種假陽性的病例,這種情況主要是由于檢測方法的自身機(jī)制引起的。傳統(tǒng)的熒光PCR法可靠性高,但是不夠靈敏。因此人們開始探索如ARMS-qPCR測序法、dd-PCR測序法的新興檢測方法,這些方法能顯著提高基因檢測的靈敏度,但是會造成一定的假陽性[25]。Kim等[26]發(fā)現(xiàn) 5例BRAFV600E基因突變,手術(shù)證實為良性的基因突變假陽性病例。DiLorenzo等[27]報告1例BRAFV600E基因突變,最終經(jīng)手術(shù)證實為腺瘤樣結(jié)節(jié)甲狀腺腫的病例。然而Zhao等[28]證實ARMS-qPCR檢測雖然可造成假陽性病例,但是就總體而言,ARMS-qPCR檢測不會影響B(tài)RAFV600E突變分析對甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的附加診斷價值。本研究BRAFV600E基因檢測方法采用Sanger測序結(jié)合ARMS-qPCR方法。另外,本研究中有5例手術(shù)病理證實為甲狀腺乳頭狀癌,但是未檢測到BRAFV600E基因突變,這可能是不合并BRAFV600E基因突變的野生型甲狀腺乳頭狀癌病例。

本文的研究意義主要包括以下幾點:(1)以往大量文獻(xiàn)報道BRAFV600E基因檢測對于細(xì)胞學(xué)判讀為Bethesda Ⅲ～Ⅵ類的甲狀腺結(jié)節(jié)有著較高的靈敏度、特異度,但是很少有研究探討B(tài)RAFV600E基因檢測在細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類的診斷價值,本文發(fā)現(xiàn)BRAFV600E基因可將細(xì)胞學(xué)無法診斷的標(biāo)本中的惡性結(jié)節(jié)篩選出來,彌補(bǔ)了細(xì)胞學(xué)診斷上的不足;(2)近年來很多研究探討與BRAFV600E基因突變相關(guān)的超聲病理特征,但是很少有研究報道甲狀腺結(jié)節(jié)惡性超聲征象數(shù)量是否與BRAFV600E基因突變相關(guān),本文證實具有2個及2個以上的甲狀腺結(jié)節(jié)更易發(fā)生BRAFV600E基因突變。

綜上所述,BRAFV600E基因檢測對于鑒別細(xì)胞學(xué)Bethesda Ⅰ類、超聲高危的結(jié)節(jié)良惡性有較高的臨床價值,可以提高此類結(jié)節(jié)的惡性檢出率。甲狀腺結(jié)節(jié)微鈣化、邊緣不規(guī)則以及結(jié)節(jié)具有≥2個可疑惡性超聲征象與BRAFV600E基因突變相關(guān)。