李建超，鐘 穎，李榮榮，宋緒鈺，黃娜娜，孫 蓉, 3*

基于肝脂調(diào)控為核心的中藥調(diào)血脂活性和評價方法研究

李建超1, 2，鐘 穎2，李榮榮1, 2，宋緒鈺2，黃娜娜2，孫 蓉2, 3*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355 2. 山東大學(xué)第二醫(yī)院，山東 濟南 250033 3. 山東大學(xué)高等醫(yī)學(xué)研究院，山東 濟南 250012

構(gòu)建適宜于評價中藥以“肝脂調(diào)控”為核心的調(diào)血脂活性和評價的“多細(xì)胞來源”“穩(wěn)定性好”的非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）體外細(xì)胞模型，以利于精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)中藥脂代謝調(diào)控活性物質(zhì)并評價其調(diào)血脂藥理學(xué)作用特征。選擇人肝癌HepG2細(xì)胞系及小鼠肝實質(zhì)AML12細(xì)胞系，對造模試劑（油酸及棕櫚酸）、造模方法、作用濃度以及作用時間和溶媒選擇進行文獻和實驗研究，并以CCK-8及油紅O實驗確定最佳造模濃度，進而循形人體肝脂代謝輪廓，采用Western blotting法檢測細(xì)胞中脂代謝相關(guān)蛋白的表達情況，作為模型評價標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)文獻和實驗研究發(fā)現(xiàn)，10%無脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid free bovine serum albumin，BSA）為油酸溶媒，20% BSA為棕櫚酸溶媒穩(wěn)定性好；500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸（體積比2∶1）造模，作用24 h，可顯著增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累（＜0.001），且不影響細(xì)胞活性，證明造模成功；單獨使用棕櫚酸造模，對2種細(xì)胞損傷都較大，模型不適宜于調(diào)血脂物質(zhì)發(fā)現(xiàn)與評價；500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸造模后，脂肪從頭合成相關(guān)蛋白固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）及脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）的表達無顯著變化，脂肪分解相關(guān)蛋白三酰甘油脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）的表達顯著升高（＜0.05、0.001），激素敏感脂肪酶（hormone sensitive lipase，HSL）的磷酸化顯著降低（＜0.05、0.01），脂肪酸氧化相關(guān)蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）的表達無顯著差異，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A）的表達顯著增加（＜0.05）。500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸（體積比2∶1）造模24 h，均可顯著增加HepG2、AML12細(xì)胞中的脂質(zhì)積累，成功構(gòu)建NAFLD體外細(xì)胞模型，且具有穩(wěn)定、經(jīng)濟、高效的特點。

肝脂代謝；體外模型；非酒精性脂肪性肝?。挥坞x脂肪酸；油酸；棕櫚酸

脂代謝功能紊亂是指長期能量攝入與代謝失衡導(dǎo)致大量脂質(zhì)堆積，引起內(nèi)分泌環(huán)境紊亂和異位脂質(zhì)積累，導(dǎo)致脂毒性代謝應(yīng)激，進而促進肝臟、脂肪組織和骨骼肌等靶器官的代謝功能失調(diào)與慢性炎癥[1]。肝臟是參與脂肪代謝的主要器官，作為脂質(zhì)平衡的中心調(diào)節(jié)器，是脂蛋白攝取、形成、輸出和循環(huán)的主要加工中心[2-3]。非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD）是指5%～10%的肝細(xì)胞出現(xiàn)大泡狀脂肪變性，或肝內(nèi)三酰甘油（triglyceride，TG）質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過5.5%[4]。NAFLD已經(jīng)發(fā)展成為全球最常見的慢性肝病，且增長迅速，約25%的人口患有NAFLD[5-6]。近年來，我國的NAFLD發(fā)病率明顯上升，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。高發(fā)病率的NAFLD嚴(yán)重影響了人類的生活健康，給社會造成沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此，有效調(diào)控肝脂代謝穩(wěn)態(tài)的治療手段在當(dāng)下社會顯得愈發(fā)重要[6]。

中醫(yī)本無NAFLD的病名，其最早記載于《難經(jīng)》中，屬于中醫(yī)“肝癖”“痰證”“脅痛”“積聚”等范疇，調(diào)肝化濁、健脾利濕、養(yǎng)血柔肝等是其有效治法[7-10]。鑒于目前西醫(yī)臨床針對NAFLD尚缺乏特效治療策略，亟需在中醫(yī)藥臨床豐富的有效經(jīng)驗中發(fā)現(xiàn)并開發(fā)創(chuàng)新中藥。目前NAFLD動物模型制備存在造模時間長、價格昂貴現(xiàn)象，不適宜于中藥調(diào)控肝脂代謝的活性成分高效篩選，體外細(xì)胞模型構(gòu)建方法統(tǒng)一性較差，如細(xì)胞系選擇、油酸及棕櫚酸造模濃度、單用還是合用、溶媒選擇、造模時間及評價指標(biāo)等方面，文獻各不相同，差異較大。因此，亟需建立與臨床發(fā)病機制相吻合、適宜于以“肝脂調(diào)控”為核心的中藥調(diào)血脂活性和評價方法研究，且不同細(xì)胞來源的穩(wěn)定、經(jīng)濟、高效的NAFLD體外細(xì)胞模型，以更好地適應(yīng)創(chuàng)新中藥發(fā)現(xiàn)、不同藥理學(xué)特征的評價研究，也為建立統(tǒng)一的模型標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 細(xì)胞系

小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞AML12細(xì)胞系購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫，人肝癌HepG2細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 藥品與試劑

油酸（批號30138518）、棕櫚酸（批號30139518）購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；青霉素-鏈霉素（批號S110JV）、DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基（批號L310KJ）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑（批號S450J7）購自上海源培生物科技股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號C11995500BT）、胎牛血清（批號A3160801）購自美國Gibco公司；地塞米松（批號D1756）、油紅O（批號O0625）購自美國Sigma公司；無脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid free bovine serum albumin，BSA，批號ST025）、蛋白酶抑制劑混合物（批號P1050-1）、磷酸酶抑制劑混合物（批號P1050-2）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒（A311-02）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號E112-01）、高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（批號E412-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；TG測定試劑盒（批號A110-1-1）購自南京建成生物工程研究所；酮體含量檢測試劑盒（批號BC5065）購自北京索萊寶科技有限公司；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1）一抗（批號ab28481）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）一抗（批號ab126285）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A）一抗（批號ab234111）購自英國Abcam公司；乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）一抗（批號3676S）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）一抗（批號3180S）、三酰甘油脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）一抗（批號2138S）、激素敏感脂肪酶（hormone sensitive lipase，HSL）一抗（批號4107S）、磷酸化HSL（phosphorylated HSL，p-HSL）一抗（批號45804S）購自美國CST公司；β-肌動蛋白（β-actin）一抗（批號20536-1-AP）購自美國Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號GB23303）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；CKX53型倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）；HH-S型恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；5200型全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Multiskan Go-1510型全波長酶標(biāo)儀、3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SDS PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 文獻檢索

檢索中國知網(wǎng)（CNKI）中以HepG2為細(xì)胞模型，研究中藥調(diào)血脂活性的期刊文獻，以“NAFLD”“HepG2”為主題詞，時間為2018年1月1日至2023年2月4日；以“NAFLD”“HepG2”“Traditional Chinese Medicine”為主題詞在PubMed數(shù)據(jù)庫中搜索近5年文獻，通過閱讀標(biāo)題與摘要首先排除與中藥、中藥方劑及中藥活性成分研究無關(guān)的文獻；然后進行全文閱讀，篩選出明確標(biāo)識造模方法的文獻納入統(tǒng)計。

2.2 油酸、棕櫚酸儲存液的配制

將油酸加入到0.1 mol/L NaOH溶液中，置于75 ℃水浴鍋中皂化30 min，得20 mmol/L油酸溶液，之后加入到等體積的20% BSA溶液中充分混勻，得10 mmol/L油酸儲存液（含10% BSA）。

將棕櫚酸加入到0.1 mol/L NaOH溶液中，置于75 ℃水浴鍋中皂化30 min，得40 mmol/L棕櫚酸溶液，之后加入到等體積的40% BSA溶液中充分混勻，得20 mmol/L棕櫚酸儲存液（含20% BSA）。

將儲存液于超凈臺中過0.22 μm微孔濾膜，置于4 ℃冰箱保存。使用時用相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，油酸＋棕櫚酸組為油酸與棕櫚酸體積比2∶1配制。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

AML12細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑、1%青霉素-鏈霉素、40 ng/mL地塞米松的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

2.4 CCK-8實驗

細(xì)胞以1×106個/mL接種于96孔板中，貼壁生長24 h，設(shè)置對照組、油酸組、棕櫚酸組和油酸＋棕櫚酸組，對照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組分別加入125、250、500、800、1000 μmol/L相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞活力。

2.5 油紅O實驗

細(xì)胞以1×106個/mL接種于12孔板中，貼壁生長24 h，設(shè)置對照組、油酸組和油酸＋棕櫚酸組，對照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組分別加入125、250、500、800、1000 μmol/L相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛固定30 min，在60%異丙醇中孵育2 min。然后在37 ℃下用60%油紅O染色20 min，60%異丙醇脫色15 s后，在磷酸鹽緩沖液中漂洗3次。采用倒置生物顯微鏡拍攝圖片。染色后的樣品在100%異丙醇中室溫?fù)u晃30 min，提取油紅O，在510 nm處測定吸光度（）值。

2.6 TG及酮體含量檢測

細(xì)胞以1×106個/mL接種于6孔板中，貼壁生長24 h，設(shè)置對照組、油酸組和油酸＋棕櫚酸組，對照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組分別加入500 μmol/L相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按說明書要求，收取培養(yǎng)基上清液檢測酮體含量，收集細(xì)胞勻漿檢測細(xì)胞內(nèi)TG含量。

2.7 Western blotting檢測脂代謝相關(guān)蛋白表達

細(xì)胞以1×106個/mL接種于6孔板中，貼壁生長24 h，設(shè)置對照組、油酸組和油酸＋棕櫚酸組，對照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組分別加入500 μmol/L相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，加入RIPA緩沖液裂解，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉，封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，4 ℃孵育1.5 h；最后使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，在全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中顯影[11]。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 利用HepG2細(xì)胞建立NAFLD模型的應(yīng)用現(xiàn)狀

HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞，保留了正常肝細(xì)胞的糖脂代謝功能，是應(yīng)用最廣泛的NAFLD體外模型之一[12]。利用CNKI數(shù)據(jù)庫，以“NAFLD”“HepG2”為主題詞搜索最近5年期刊文獻106條，篩選出與中藥脂代謝研究相關(guān)且明確標(biāo)識造模方法的文章49篇，利用PubMed數(shù)據(jù)庫，搜索最近5年期刊文獻64條，篩選出有效文章38篇。其中單獨使用油酸造模的24篇，占28%；單獨使用棕櫚酸造模的20篇，占23%；使用油酸＋棕櫚酸造模的43篇，占49%。造模所用濃度從100～1000 μmol/L不等。造模或造模同時給藥作用時間多為24 h，約占91%。

3.2 不同濃度脂肪酸對肝細(xì)胞活性的影響

3.2.1 對HepG2細(xì)胞活性的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、棕櫚酸、油酸＋棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞，作用24 h，可見不同濃度的脂肪酸均可濃度相關(guān)性地降低HepG2細(xì)胞活力。油酸濃度達到800 μmol/L時，細(xì)胞活性顯著降低（＜0.001）。棕櫚酸濃度達到125 μmol/L時，細(xì)胞活性顯著降低（＜0.01），說明棕櫚酸對細(xì)胞的損傷更大。油酸＋棕櫚酸濃度達到1000 μmol/L時，細(xì)胞活性才出現(xiàn)顯著降低（＜0.001），說明油酸可一定程度抑制棕櫚酸對細(xì)胞的傷害（圖1-A）。

3.2.2 對AML12細(xì)胞活性的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、棕櫚酸、油酸＋棕櫚酸處理AML12細(xì)胞，作用24 h，可見油酸濃度達到800 μmol/L時，細(xì)胞活性出現(xiàn)顯著降低（＜0.01）。棕櫚酸濃度達到500 μmol/L時，細(xì)胞活性顯著降低（＜0.001）。油酸＋棕櫚酸濃度達到1000 μmol/L時，細(xì)胞活性仍沒有表現(xiàn)出顯著降低（圖1-B）。相較于HepG2細(xì)胞來說，脂肪酸對AML12細(xì)胞的傷害更小。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.3 不同濃度脂肪酸對肝細(xì)胞脂肪超載的影響

3.3.1 對HepG2細(xì)胞脂肪超載的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、油酸＋棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞24 h，細(xì)胞固定后，進行油紅O染色，可見油酸、油酸＋棕櫚酸均呈濃度相關(guān)性地增加HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)積累（＜0.05、0.01，圖2-A）。結(jié)合CCK-8實驗結(jié)果，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸在未導(dǎo)致HepG2細(xì)胞活力明顯下降的情況下，成功誘導(dǎo)了NAFLD細(xì)胞模型。接著檢測干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)TG的含量，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸均可顯著增加HepG2細(xì)胞內(nèi)TG積累（＜0.001，圖2-B）。

3.3.2 對AML12細(xì)胞脂肪超載的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、油酸＋棕櫚酸處理AML12細(xì)胞24 h，細(xì)胞固定后，進行油紅O染色，可見油酸、油酸＋棕櫚酸均呈濃度相關(guān)性地增加AML12細(xì)胞的脂質(zhì)積累（＜0.01、0.001，圖2-C）。結(jié)合CCK-8實驗結(jié)果，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸在不影響AML12細(xì)胞活力的情況下，成功誘導(dǎo)了NAFLD細(xì)胞模型。同樣的，如圖2-D所示，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸可顯著增加AML12細(xì)胞中TG含量（＜0.001）。

由于棕櫚酸對2種細(xì)胞的損傷都較大，且低劑量的棕櫚酸并不足以誘導(dǎo)2種細(xì)胞產(chǎn)生顯著的脂質(zhì)堆積。所以按照當(dāng)前棕櫚酸配制方法，并不推薦單獨使用棕櫚酸構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型。

3.4 不同濃度脂肪酸對脂代謝的影響

3.4.1 對脂肪從頭合成（De novo lipogenesis，DNL）的影響 如圖3-A所示，與對照組比較，500 μmol/L油酸組和500 μmol/L油酸＋棕櫚酸組的HepG2細(xì)胞中SREBP-1、ACC及FASN的蛋白表達沒有出現(xiàn)顯著升高。同樣的，在AML12細(xì)胞中也未觀察到顯著差異。表明在此模型中，脂肪酸的引入并沒有顯著激活肝臟DNL的生理過程。

3.4.2 對脂肪分解的影響 接著對調(diào)控肝細(xì)胞脂肪分解速率的蛋白進行了檢測，結(jié)果表明，在2種細(xì)胞系的細(xì)胞模型中，ATGL蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.001），而HSL的磷酸化水平顯著降低（＜0.05、0.01，圖3-B）。說明肝細(xì)胞中脂肪超載激活TG第一步水解的同時抑制了脂肪酸的進一步生成，HSL活性的降低促使肝細(xì)胞中脂質(zhì)的進一步積累。

圖2 不同濃度脂肪酸對HepG2細(xì)胞(A、B) 及AML12細(xì)胞(C、D) 油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)TG累積的影響(, n = 3)

A-脂肪從頭合成相關(guān)蛋白表達 B-脂肪分解相關(guān)蛋白表達 C-脂肪酸氧化相關(guān)蛋白表達 D-酮體含量

3.4.3 對脂肪酸氧化的影響 如圖3-C所示，在HepG2細(xì)胞模型中，與對照組比較，油酸組和油酸＋棕櫚酸組的PPARα蛋白表達水平雖然存在降低趨勢但未出現(xiàn)顯著差異，CPT1A蛋白表達水平顯著升高（＜0.05），表明過量的脂肪酸促進了肝細(xì)胞中脂肪酸的氧化。在AML12細(xì)胞模型中觀察到同樣的現(xiàn)象。為了進一步說明脂肪酸氧化的變化，檢測了細(xì)胞培養(yǎng)基中酮體含量的變化情況，發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞和AML12細(xì)胞中，500 μmol/L油酸和500 μmol/L油酸＋棕櫚酸均顯著升高了酮體的含量（＜0.001，圖3-D）。

4 討論

NAFLD是指除酒精外和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[13]。游離脂肪酸可用于肝臟攝取和再酯化為TG，是肝中TG庫的主要來源，在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[14]。棕櫚酸和油酸是最豐富的游離脂肪酸，與正常人群相比，NAFLD患者血漿中棕櫚酸和油酸的含量顯著增加[15]。研究表明棕櫚酸對肝細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)，通過聯(lián)合油酸可減輕細(xì)胞損傷[16]。

文獻研究發(fā)現(xiàn)，目前在以肝脂調(diào)控為核心的中藥調(diào)血脂活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)和評價中所使用的模型較為多樣，統(tǒng)一性較差。HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞，具有生長速度快、易于培養(yǎng)、脂滴形態(tài)學(xué)變化明顯等特點，被廣泛用于肝脂代謝的研究中[12]。AML12細(xì)胞是小鼠正常肝細(xì)胞，屬于永生化細(xì)胞，具有穩(wěn)定的表型，存在過氧化物酶體和膽小管樣結(jié)構(gòu)，更容易標(biāo)準(zhǔn)化，適用于多種肝臟疾病的研究[17]。本研究利用油酸、棕櫚酸在體外分別誘導(dǎo)人源HepG2細(xì)胞及鼠源AML12細(xì)胞脂肪變性，并通過檢測脂代謝相關(guān)蛋白的表達闡釋模型特點。

在造模時間的選擇上，根據(jù)不同的實驗?zāi)康?，多選擇1～48 h，其中應(yīng)用最多的為24 h（占94%）[18-21]。根據(jù)中藥的作用特點、細(xì)胞生長周期及前期實驗結(jié)果，選擇24 h作為本研究中2種細(xì)胞模型的造模時間。另外，目前可供選擇的脂肪酸溶媒也較多，文獻中多存在對溶媒表述不清的現(xiàn)象。常使用的包括甲醇、乙醇、二甲亞砜等有機溶劑，但都對細(xì)胞有較大的毒性作用，且溶解不充分，導(dǎo)致模型穩(wěn)定性差。本研究選擇毒性較小的BSA作為溶媒，可與游離脂肪酸穩(wěn)定結(jié)合，同時更加符合脂肪酸在體內(nèi)的運輸特點[22]。實驗結(jié)果表明，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸干預(yù)細(xì)胞24 h后，在不影響細(xì)胞活性的情況下能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累。雖然在800 μmol/L甚至更高濃度的油酸＋棕櫚酸組中HepG2細(xì)胞及AML12細(xì)胞的活力仍未下降，但綜合考慮藥效驗證敏感性，選擇500 μmol/L作為構(gòu)建NAFLD體外模型的最佳劑量，在此濃度下，繼續(xù)驗證了脂代謝相關(guān)蛋白的表達情況。

DNL主要發(fā)生在肝臟中[23]。乙酰輔酶A在ACC的作用下轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，繼而通過FASN轉(zhuǎn)化為脂肪酸主要為棕櫚酸，最終經(jīng)過延長、酯化等步驟形成TG[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者的DNL速率顯著增加，是導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積的主要因素之一[25]?；颊吒闻K脂肪中15%～38%的棕櫚酸酯來自DNL，顯著高于正常群體[26]。一方面大量棕櫚酸的產(chǎn)生可引發(fā)炎癥和細(xì)胞凋亡；另一方面DNL的上調(diào)促使細(xì)胞轉(zhuǎn)向合成代謝而不是分解代謝，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)堆積[4]。SREBP-1是DNL速率的主要調(diào)控因子，在NAFLD患者中表達增強，同時促進ACC及FASN的表達[23]。在本研究的模型中，SREBP-1、ACC及FASN的表達并未出現(xiàn)顯著升高。培養(yǎng)基中添加大量的游離脂肪酸使得DNL進程并未激活。

脂肪分解是TG分解為非酯化游離脂肪酸及甘油進入體循環(huán)的生理過程[4]。其中，ATGL是水解TG的第一步，也是限速步驟，生成甘油二酯和脂肪酸[27]。研究表明，肝臟中ATGL的缺失可以減輕肝臟炎癥及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減緩病程的發(fā)展[19]。HSL是一種多功能的酶，主要調(diào)控二酰甘油酯的分解，其蛋白磷酸化可顯著激活蛋白活性，促進脂解速率[28-29]。最后，單甘酯脂肪酶（monoglyceride lipase，MGL）將單酰甘油水解為甘油和脂肪酸。ATGL、HSL和MGL的生理活性受不同蛋白質(zhì)和輔助激活劑的相互調(diào)節(jié)，共同確保脂解速率以適應(yīng)代謝需要[30]。在本研究的模型中，過量TG的積累顯著促進了肝細(xì)胞中ATGL的表達，以激活TG水解的第一步。然而，過量的游離脂肪酸負(fù)向調(diào)控了進一步的脂解過程，抑制HSL的磷酸化。

氧化供能是肝內(nèi)脂肪酸代謝的主要途徑。脂肪酸的氧化由PPARα調(diào)節(jié)，長鏈脂肪酸依賴位于外膜的CPT1進入線粒體中[1,31]。PPARα的激活誘導(dǎo)了線粒體、過氧化物酶體和細(xì)胞色素中脂肪酸氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[32]。然而，這些過程會產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的活性氧、氧化應(yīng)激和有毒的二元酸，進一步促進炎癥產(chǎn)生[33]。丙酮是肝臟中脂肪酸氧化的中間產(chǎn)物，包括乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮。在2種模型中，酮體的含量顯著升高，PPARα的表達呈降低趨勢，但未出現(xiàn)顯著差異，CPT1A的表達呈現(xiàn)不同程度的顯著增加，說明細(xì)胞中多余的脂肪酸大量進入線粒體中，易造成線粒體DNA的氧化損傷，加劇線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激。

從上述結(jié)果可以看出，人源肝癌細(xì)胞HepG2與鼠源正常肝細(xì)胞AML12所建立的模型差異并不明顯，在不超生理濃度的情況下，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累均隨脂肪酸濃度的增加而增加；但與HepG2細(xì)胞相比，AML12細(xì)胞對脂肪酸引起的細(xì)胞毒性耐受力更強，尤其是單獨使用棕櫚酸時，在濃度達到250 μmol/L時，細(xì)胞活性仍未出現(xiàn)顯著差異。從TG檢測可以看出，在相同的作用條件下AML12的脂質(zhì)積累更加嚴(yán)重，說明AML12細(xì)胞對脂肪酸變化更加敏感。

本實驗選用的脂肪酸濃度相對較低，對細(xì)胞傷害較小。因此，更加適宜于反映NAFLD疾病初期病理特征，對于后續(xù)疾病出現(xiàn)的炎癥及細(xì)胞損傷，可采用更高劑量的脂肪酸進行誘導(dǎo)；另外，實驗采用單一因素即脂肪酸濃度增加作為造模條件，不能全面反映NAFLD臨床中復(fù)雜的多重致病因素[34]，因此，在藥物發(fā)現(xiàn)或藥效評價中可根據(jù)需求，注意結(jié)合其他體外模型進行交互驗證。

綜上，500 μmol/L油酸、500 μmol/L油酸＋棕櫚酸（體積比2∶1）作用于HepG2細(xì)胞及AML12細(xì)胞可成功誘導(dǎo)NAFLD體外細(xì)胞模型，影響肝細(xì)胞脂肪分解和脂肪酸氧化相關(guān)蛋白的表達，具有脂質(zhì)堆積穩(wěn)定、成模周期較短、經(jīng)濟高效的特點。適用于中藥及中藥方劑中調(diào)血脂活性物質(zhì)的廣泛篩選，為有效治療NAFLD的創(chuàng)新中藥發(fā)現(xiàn)及不同藥理學(xué)特征的評價研究提供模型參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Lipid-regulating activity and evaluation method of traditional Chinese medicine based on liver lipid regulation

LI Jian-chao1, 2, ZHONG Ying2, LI Rong-rong1, 2, SONG Xu-yu2, HUANG Na-na2, SUN Rong2, 3

1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. The Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, China 3. Shandong University, Institute of Advanced Medical Sciences, Jinan 250012, China

To construct ancell model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) with “multi-cell origin” and “good stability”, which is suitable for lipid-regulating activity and evaluation with “l(fā)iver lipid regulation” as the core of traditional Chinese medicine, so as to facilitate the accurate discovery of lipid-regulating active substances of traditional Chinese medicine and evaluate their pharmacological effects of lipid regulation.HepG2 cell line of human hepatocellular carcinoma and AML12 cell line of mouse liver parenchyma were selected, modeling reagents (oleic acid and palmitic acid), modeling methods, action concentration, action time and solvent selection were studied by literature and experiments. CCK-8 and oil red O experiments were used to determine the optimal modeling concentration, and then the contour of human liver lipid metabolism was followed. The expressions of lipid metabolism-related proteins in cells was detected by Western blotting as a model evaluation standard.It was found that 10% fatty acid free bovine serum albumin (BSA) was oleic acid solvent and 20% BSA was palmitic acid solvent with good stability. 500 μmol/L oleic acid and 500 μmol/L oleic acid + palmitic acid (volume ratio 2∶1) treated for 24 h could significantly increase the intracellular lipid accumulation (< 0.001) without affecting the cell activity, which proves that the modeling is successful. Palmitic acid modeling alone caused great damage to both kinds of cells, so the model was not suitable for the discovery and evaluation of lipid-lowering substances. After modeling with 500 μmol/L oleic acid and 500 μmol/L oleic acid + palmitic acid, expressions of de novo lipogenesis synthesis related proteins sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1), acetyl-CoA carboxylase (ACC) and fatty acid synthase (FASN) were not significantly increased, but the expression of lipolysis related protein adipose triglyceride lipase (ATGL) was significantly increased (< 0.05, 0.001), and phosphorylation of hormone sensitive lipase (HSL) was significantly decreased (< 0.05, 0.01), and the expression of peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), a protein related to fatty acid oxidation, had no significant difference, while the expression of carnitine palmitoyl transferase 1A (CPT1A) was significantly increased (< 0.05).500 μmol/L oleic acid and 500 μmol/L oleic acid + palmitic acid (volume ratio of 2∶1) can significantly increase the lipid accumulation in HepG2 and AML12 cells, and successfully construct the cell model of NAFLD, which is stable, economical and efficient.

liver lipid metabolism;model; non-alcoholic fatty liver disease; free fatty acid; oleic acid; palmitic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2023)10 - 3158 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.013

2023-02-07

國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFC3502100）；國家自然科學(xué)基金面上項目（82274197）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81773997）；濟南市科研帶頭人工作室項目（202228099）

李建超，碩士研究生，研究方向為中藥藥理學(xué)與毒理學(xué)。E-mail: lijianchao0117@163.com

孫 蓉，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。E-mail: sunrong107@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]