龔蘭 許婉華 謝貝 楊瑜 吳玲 王楠 劉志輝 李華 孟繁榮 董海平

1廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所，廣州 510095；2廣州市胸科醫(yī)院 呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510095；3廣州市結(jié)核病防治所二分所，廣州 510095；4廣州市胸科醫(yī)院重癥結(jié)核科，廣州 510095

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性呼吸道傳染病，是人類(lèi)十大死因之一。盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)出諸多有效的抗結(jié)核藥物，但結(jié)核病仍是世界上許多地區(qū)負(fù)擔(dān)最重的傳染病［1］。宿主T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在結(jié)核發(fā)病機(jī)制中起重要作用［2-3］。結(jié)核分枝桿菌抗原激活免疫系統(tǒng)的程度與細(xì)胞因子水平升高有關(guān)。雖然在臨床上已將一些炎癥標(biāo)志物與胸部影像和病原學(xué)培養(yǎng)聯(lián)合使用來(lái)監(jiān)測(cè)結(jié)核病活動(dòng)度［4］，但是其特異度較低，且容易受到患者健康狀況和炎癥的影響。研究表明，干擾素-γ（IFN-γ）水平可部分反映患者和健康個(gè)體體內(nèi)免疫激活的狀態(tài)，然而這些方法的適用條件及應(yīng)用價(jià)值仍然存在爭(zhēng)議［5-10］。在這項(xiàng)研究中，筆者檢測(cè)了肺結(jié)核患者治療過(guò)程中血清中IFN-γ的表達(dá)水平及變化，并結(jié)合其細(xì)菌負(fù)荷、胸部影像學(xué)結(jié)果、病程及基礎(chǔ)疾病等，分析其在監(jiān)測(cè)結(jié)核病活動(dòng)度和抗結(jié)核治療效果時(shí)的應(yīng)用條件及應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

1.患者納入標(biāo)準(zhǔn)

選取2020年9月至2022年12月在廣州市胸科醫(yī)院?？崎T(mén)診就診的56例肺結(jié)核患者，患者經(jīng)過(guò)臨床確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴既往結(jié)核病史；⑵耐藥結(jié)核??；⑶肺部其他疾病；⑷其他感染性疾?。虎筛文I等臟器存在器質(zhì)性病變、血液病、惡性腫瘤等；⑹自身免疫性疾病（如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）；⑺近3個(gè)月內(nèi)服用免疫抑制劑、激素類(lèi)藥物；⑻妊娠期或哺乳期婦女；⑼臨床資料不全者。

本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)廣州市胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［胸醫(yī)倫理（2020）61號(hào)］。

2.患者診療信息及血清標(biāo)本收集

跟蹤隨訪患者，收集其性別、年齡、基礎(chǔ)疾病等信息。治療前、強(qiáng)化期治療2個(gè)月、治療6個(gè)月及治療結(jié)束時(shí)，行肺部X線胸片檢查，同時(shí)收集患者痰液進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)（痰涂片、痰培養(yǎng)及相關(guān)分子檢測(cè)）。收集患者治療前、治療2個(gè)月、治療6個(gè)月時(shí)靜脈血，分離血清后分裝于凍存管-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.患者治療期間血清中IFN-γ濃度測(cè)定

按照賽基生物細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中IFN-γ濃度，具體如下：按順序在流式細(xì)胞管中加入捕獲微球混合液、標(biāo)準(zhǔn)品或血清、熒光檢測(cè)試劑各25 μl，渦旋混勻；室溫避光孵育2.5 h，經(jīng)1 ml PBS洗滌，傾倒后加入200 μl PBS懸浮，上機(jī)檢測(cè)（流式細(xì)胞儀，BD，F(xiàn)ACSAriaTM）。利用試劑盒自帶軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析血清中的IFN-γ濃度。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis和Mann-whitney檢驗(yàn)，配對(duì)樣本使用Friedman檢驗(yàn)；P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）探索檢測(cè)指標(biāo)的界值及其檢驗(yàn)效能。二元logistic回歸分析肺結(jié)核患者在治療期間血清中IFN-γ水平下降的影響因素。

結(jié) 果

1.肺結(jié)核患者血清中IFN-γ表達(dá)水平在治療期間的變化情況

肺結(jié)核患者血清中IFN-γ濃度在治療過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，治療前、治療2個(gè)月、治療6個(gè)月分別為2.310（1.750，3.490）ng/L、2.045（1.425，3.180）ng/L和1.865（1.425，2.880）ng/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（3個(gè)時(shí)間點(diǎn)間P=0.004，治療前與治療2個(gè)月P=0.023，治療前與治療6個(gè)月P=0.001）。

2.肺結(jié)核患者血清中IFN-γ表達(dá)水平影響因素分析

按照患者的基本信息（年齡、性別）、基礎(chǔ)疾?。ㄌ悄虿。?、治療前及治療過(guò)程中影像學(xué)特征（是否有肺部空洞及好轉(zhuǎn)情況）、治療周期、病原學(xué)特征對(duì)患者進(jìn)行分組，分別分析肺結(jié)核患者在治療前、強(qiáng)化期（治療2個(gè)月）、治療6個(gè)月時(shí)血清中IFN-γ的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，具有肺部空洞的肺結(jié)核患者治療前血清中IFN-γ的濃度高于無(wú)肺部空洞的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 不同特征肺結(jié)核患者治療過(guò)程中血清干擾素-γ表達(dá)水平分析[ng/L，M（P25，P75）]

3.肺結(jié)核患者治療期間血清中IFN-γ水平對(duì)治療效果評(píng)估的效能分析

ROC分析顯示，血清中IFN-γ的濃度在區(qū)分肺結(jié)核治療前與治療2個(gè)月、治療前與治療6個(gè)月、治療2個(gè)月和治療6個(gè)月時(shí)線下面積分別為0.582、0.646和0.560，界值分別為1.520、2.345和1.610 ng/L，見(jiàn)表2。二元logistic回歸分析表明治療2個(gè)月后血清中IFN-γ濃度是否降到1.520 ng/L以下與患者是否合并糖尿病有關(guān)，見(jiàn)表3。

表2 56例肺結(jié)核患者血清中干擾素-γ在治療前、治療2個(gè)月、治療6個(gè)月表達(dá)水平差異的受試者工作特征曲線分析

表3 治療2個(gè)月后56例肺結(jié)核患者血清中干擾素-γ表達(dá)水平影響因素的二元logistics回歸分析

4.病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核患者血清中IFN-γ表達(dá)水平對(duì)治療效果評(píng)估的效能分析

為了進(jìn)一步優(yōu)化IFN-γ表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核治療效果的評(píng)估效能，將入組患者按照性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、影像學(xué)、治療周期等特征分組后進(jìn)行ROC分析，結(jié)果表明：當(dāng)將入組患者限制到治療前病原學(xué)陽(yáng)性時(shí)，血清中IFN-γ濃度區(qū)分治療前與治療2個(gè)月、治療前與治療6個(gè)月的線下面積分別為0.762和0.770，界值分別為1.725和1.705 ng/L，靈敏度均為93.75%，特異度均為50.00%，見(jiàn)表4。

表4 治療前56例細(xì)菌學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核患者血清中干擾素-γ在治療前、治療2個(gè)月、治療個(gè)6月表達(dá)水平差異的受試者工作特征曲線分析

討 論

肺結(jié)核是一種慢性炎癥性疾病。結(jié)核病的進(jìn)展主要取決于宿主免疫反應(yīng)的激活程度［11］。這期間細(xì)胞因子充當(dāng)信使角色，幫助機(jī)體協(xié)調(diào)各種免疫細(xì)胞的激活［12］。IFN-γ是用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的潛在免疫診斷標(biāo)志物，它由活化的CD4+T細(xì)胞釋放，是保護(hù)性抗結(jié)核免疫應(yīng)答的關(guān)鍵組成部分［13］。雖然部分研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者血清中IFN-γ濃度升高，其濃度可能與肺部病原菌負(fù)荷直接相關(guān)，有用于區(qū)分肺結(jié)核活動(dòng)性的潛力，然而也有研究結(jié)果與之矛盾［9，14-15］。為了進(jìn)一步精細(xì)化分析肺結(jié)核患者血清中IFN-γ濃度在抗結(jié)核治療過(guò)程中的變化趨勢(shì)，并評(píng)估其反映抗結(jié)核治療效果方面的潛力，筆者對(duì)56例肺結(jié)核患者治療前、治療2個(gè)月和治療6個(gè)月時(shí)血清中IFN-γ表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)治療期間肺結(jié)核患者血清中IFN-γ濃度整體呈下降趨勢(shì)，這與前人研究結(jié)果一致［16-18］，即血清IFN-γ水平可作為監(jiān)測(cè)抗結(jié)核治療效果生物標(biāo)志物。

當(dāng)按照患者的基本信息（年齡、性別）、基礎(chǔ)疾病（糖尿?。⒅委熐凹爸委熯^(guò)程中影像學(xué)特征（是否有肺部空洞及好轉(zhuǎn)情況）、治療周期、病原學(xué)特征對(duì)患者進(jìn)行分組時(shí)，發(fā)現(xiàn)具有肺部空洞的肺結(jié)核患者治療前血清中IFN-γ濃度高于無(wú)肺部空洞的患者。6例空洞型肺結(jié)核患者中有3例肺部有2個(gè)空洞，其治療前IFN-γ濃度分別為1.97、2.14、5.02 ng/L；另外3例肺部有1個(gè)空洞的患者治療前IFN-γ濃度分別為10.85、4.66、16.00 ng/L，從現(xiàn)有數(shù)據(jù)觀察肺部1個(gè)空洞的患者治療前IFN-γ濃度略高于肺部2個(gè)空洞的患者，但仍需要擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。進(jìn)一步的ROC分析顯示，血清中IFN-γ濃度在區(qū)分肺結(jié)核治療前與治療2個(gè)月時(shí)，靈敏度較高91.10%，而特異度僅為32.10%。二元logistic回歸分析表明，治療2個(gè)月血清中IFN-γ濃度是否降到1.520 ng/L以下與患者是否合并糖尿病有關(guān)：糖尿病組治療前、治療2個(gè)月、治療6個(gè)月血清中IFN-γ濃度中位數(shù)分別為2.14、1.47、1.53 ng/L，而無(wú)糖尿病組分別為2.35、2.14、2.03 ng/L。已有報(bào)道表明，糖尿病合并結(jié)核病患者血清中IFN-γ水平高于非糖尿病患者［19-20］，與本研究結(jié)果不符，原因可能為人種不同或納入研究的合并糖尿病患者數(shù)量較少（7例）。為了進(jìn)一步優(yōu)化IFN-γ表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核治療效果的評(píng)估效能，將入組患者按照性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、影像學(xué)、治療周期等特征分組后進(jìn)行ROC分析，僅當(dāng)將入組病例限制到治療前病原學(xué)陽(yáng)性時(shí)，血清中IFN-γ濃度區(qū)分治療前與治療2個(gè)月、治療前與治療6個(gè)月的靈敏度均為93.75%，特異度均為50.00%，較未限制時(shí)大幅提高。即對(duì)于治療前病原學(xué)為陽(yáng)性的肺結(jié)核患者，血清中IFN-γ水平變化具有更高的治療效果評(píng)估潛力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明肺結(jié)核治療前血清IFN-γ的濃度與患者肺部有無(wú)空洞有關(guān)，治療期間，肺結(jié)核患者血清中IFN-γ水平是否下降與患者是否合并糖尿病相關(guān)。對(duì)治療前病原學(xué)陽(yáng)性的肺結(jié)核患者來(lái)說(shuō)，治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)血清IFN-γ濃度具有更大的臨床治療管理應(yīng)用價(jià)值。鑒于本研究納入的病例數(shù)有限，雖然分析發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核治療期間血清IFN-γ濃度變化的部分影響因素，但是更確切的結(jié)果仍然需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究，以更精確地指導(dǎo)臨床抗結(jié)核治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明龔蘭：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，采集、分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析；許婉華、謝貝、楊瑜：實(shí)施研究；吳玲、王楠：采集數(shù)據(jù)；劉志輝：指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)；李華：統(tǒng)計(jì)分析；孟繁榮：分析/解釋數(shù)據(jù)；董海平：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)