許文慧，張志超，黃遠(yuǎn)英，殷光玲

廣東佰悅網(wǎng)絡(luò)科技有限公司（廣州 510663）

兒童時(shí)期是認(rèn)知發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，研究表明改善營(yíng)養(yǎng)和最佳大腦功能之間存在聯(lián)系，營(yíng)養(yǎng)素在細(xì)胞增殖、DNA合成、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和激素代謝中起關(guān)鍵作用，在大腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期缺乏營(yíng)養(yǎng)將會(huì)對(duì)智力發(fā)展產(chǎn)生持久的影響[1-3]。與營(yíng)養(yǎng)不均衡的學(xué)生相比，營(yíng)養(yǎng)均衡的學(xué)生在考試中表現(xiàn)得更好[4]。

牛磺酸可以促進(jìn)人腦神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化和成熟[5]。研究表明，補(bǔ)充牛磺酸可以改善學(xué)習(xí)和記憶能力[6-7]。磷脂酰絲氨酸（PS）在人體具有很高的生物利用度，可以通過(guò)血腦屏障[8]。膳食補(bǔ)充PS可以影響人們的記憶力和注意力，從而影響學(xué)習(xí)能力[9]。α-亞麻酸（ALA）是一種人體不能合成的必需脂肪酸，膳食中缺乏ALA會(huì)導(dǎo)致大腦中DHA的水平有所下降，影響相關(guān)腦功能[10]。有證據(jù)表明從ALA合成的DHA足以維持大腦功能[11]。兒童補(bǔ)充B族維生素如維生素B1和維生素B6可以改善認(rèn)知能力[12]。

中國(guó)4~12歲兒童的父母中有52%會(huì)購(gòu)買對(duì)兒童智力發(fā)展有益的產(chǎn)品[13]。開(kāi)發(fā)復(fù)配磷脂酰絲氨酸、牛磺酸和α-亞麻酸的保健食品可能對(duì)改善少年兒童的學(xué)習(xí)記憶具有重大意義。此次研究擬通過(guò)動(dòng)物試食試驗(yàn)，探究磷脂酰絲氨酸?；撬釓?fù)合物產(chǎn)品輔助改善記憶的功能效果，為其合理利用及功能因子的有效用量提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 受試樣品及試驗(yàn)動(dòng)物

磷脂酰絲氨酸牛磺酸復(fù)合物（磷脂酰絲氨酸30 mg/d、?；撬?34 mg/d、α-亞麻酸254.4 mg/d，湯臣倍健股份有限公司）；植物油（遼寧晟麥實(shí)業(yè)股份有限公司）。

試驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，共240只，體重為18~22 g[長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2009-0012]；飼料（長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司）。試驗(yàn)條件為屏障環(huán)境，溫度22~24 ℃，濕度52%~56%。

1.2 儀器與設(shè)備

ZH-1小鼠水迷宮儀、ZH-600小鼠避暗儀、YLS-3TB小鼠跳臺(tái)儀（安徽正華生物設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 劑量選擇與受試物給予方式

每個(gè)試驗(yàn)中，分別將試驗(yàn)小鼠按體重隨機(jī)分成3個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組，每組10只。兒童體重按30 kg計(jì)算，磷脂酰絲氨酸?；撬釓?fù)合物折合劑量為0.033 3 g/（kg·bw），參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗(yàn)方法中關(guān)于受試樣品劑量的要求[14]，按人體推薦用量的5，10和30倍確定小鼠受試樣品的低、中、高劑量，分別為0.167，0.333和1.000 g/（kg·bw），3個(gè)劑量組受試液配制時(shí)分別取磷脂酰絲氨酸牛磺酸復(fù)合物1.67，3.33和10.00 g加植物油至100 mL，對(duì)照組給予等體積的植物油，每天對(duì)小鼠灌胃一次，灌胃體積為0.1 mL/（10 g·bw），連續(xù)灌胃30 d。

2.2 試驗(yàn)方法

2.3 跳臺(tái)試驗(yàn)

分別設(shè)低劑量組[0.167 g/（kg·bw）]、中劑量組[0.333 g/（kg·bw）]、高劑量組[1.000 g/（kg·bw）]和對(duì)照組，每組10只小鼠，對(duì)其連續(xù)灌胃30 d后進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方法參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗(yàn)方法[14]。

2.4 避暗試驗(yàn)

小鼠的選擇、分組、給受試物的劑量、方式和時(shí)間均同跳臺(tái)試驗(yàn)，對(duì)小鼠連續(xù)灌胃30 d后開(kāi)始避暗試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方法參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗(yàn)方法[14]。

2.5 水迷宮試驗(yàn)

小鼠的選擇、分組、給受試物的劑量、方式和時(shí)間均同跳臺(tái)試驗(yàn)，對(duì)小鼠連續(xù)灌胃30 d后開(kāi)始水迷宮試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方法參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗(yàn)方法[14]。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

跳臺(tái)試驗(yàn)中的潛伏期、避暗試驗(yàn)中的潛伏期、水迷宮試驗(yàn)中到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間均屬計(jì)量資料，對(duì)其進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異用Dunnett法進(jìn)行多個(gè)劑量組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較；若方差不齊，則對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差齊性檢驗(yàn)后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。跳臺(tái)試驗(yàn)中的錯(cuò)誤次數(shù)和跳下平臺(tái)的動(dòng)物數(shù)、避暗試驗(yàn)中的錯(cuò)誤次數(shù)和錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)、水迷宮試驗(yàn)中錯(cuò)誤次數(shù)和到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)均為計(jì)數(shù)資料，用χ2檢驗(yàn)，四格表總例數(shù)小于40，或總例數(shù)大于或等于40但出現(xiàn)理論數(shù)小于或等于1時(shí)，改用確切概率法。P＜0.05表示與對(duì)照組比較有顯著性差異，P＜0.01表示與對(duì)照組比較有極顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 磷脂酰絲氨酸?；撬釓?fù)合物對(duì)小鼠體重的影響試驗(yàn)

期間，分別給予小鼠不同劑量的受試物，經(jīng)口連續(xù)灌胃30 d，各組小鼠無(wú)異常表現(xiàn)，且初始體重與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），末期體重與對(duì)照組比較也無(wú)顯著性差異（P＞0.05），兩次試驗(yàn)結(jié)論一致，說(shuō)明食用受試物不會(huì)對(duì)小鼠體重產(chǎn)生不良影響，具體見(jiàn)表1。

表1 磷脂酰絲氨酸?；撬釓?fù)合物對(duì)小鼠體重的影響

3.2 磷脂酰絲氨酸復(fù)合物對(duì)小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響

從表2可見(jiàn)，兩次試驗(yàn)中，潛伏期隨受試物劑量的增加而增加，高劑量組[1.000 g/（kg·bw）]的潛伏期最長(zhǎng)，且與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。兩次試驗(yàn)中，各劑量組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)隨受試物劑量的增加而減少，高劑量組的錯(cuò)誤次數(shù)最少，且與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。兩次試驗(yàn)中，各劑量組小鼠跳下平臺(tái)的動(dòng)物數(shù)與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)隨劑量的增加而減少，高劑量組錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)最少。結(jié)果表明，高劑量組的小鼠，學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，兩次跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性。

表2 小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果

從表3可見(jiàn)，兩次跳臺(tái)消退試驗(yàn)中，各劑量組小鼠跳下平臺(tái)的潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)、跳下平臺(tái)的動(dòng)物數(shù)與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但高劑量組的潛伏期最長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)最少，且錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)最少，消退試驗(yàn)對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響隨劑量的增加而減小，兩次消退試驗(yàn)結(jié)論一致。

表3 小鼠跳臺(tái)消退試驗(yàn)結(jié)果

3.3 磷脂酰絲氨酸?；撬釓?fù)合物對(duì)小鼠避暗試驗(yàn)的影響

從表4可見(jiàn)，兩次試驗(yàn)中，各劑量組小鼠進(jìn)入暗室潛伏期與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但隨受試物劑量的增加而延長(zhǎng)，且高劑量組的潛伏期是最長(zhǎng)的。兩次試驗(yàn)中，各劑量組錯(cuò)誤次數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但隨劑量的增加而減少，且高劑量組的錯(cuò)誤次數(shù)最少。兩次試驗(yàn)中，各劑量組進(jìn)入暗室的動(dòng)物數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)隨受試物劑量的增加而減少，且高劑量組的錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)最少。兩次避暗試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，但從試驗(yàn)數(shù)據(jù)隨受試物劑量增加而發(fā)生的規(guī)律變化來(lái)看，仍能在一定程度上解釋受試物對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善。

表4 小鼠避暗試驗(yàn)結(jié)果

從表5可見(jiàn)，兩次避暗消退試驗(yàn)中，各劑量組小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)、進(jìn)入暗室的動(dòng)物數(shù)與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但高劑量組的潛伏期最長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)最少，且進(jìn)入暗室的動(dòng)物數(shù)最少，消退試驗(yàn)對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響隨受試物劑量的增加而減小，兩次消退試驗(yàn)結(jié)論一致。

表5 小鼠避暗消退試驗(yàn)結(jié)果

3.4 磷脂酰絲氨酸?；撬釓?fù)合物對(duì)小鼠水迷宮試驗(yàn)的影響

從表6可見(jiàn)，兩次試驗(yàn)中，到達(dá)終點(diǎn)時(shí)間隨劑量的增加而減少，高劑量組[1.000 g/（kg·bw）]小鼠到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間最短，且與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。兩次試驗(yàn)中，到達(dá)終點(diǎn)前錯(cuò)誤次數(shù)隨受試物劑量的增加而減少，高劑量組小鼠到達(dá)終點(diǎn)前的錯(cuò)誤次數(shù)最少，且與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。兩次試驗(yàn)中，高劑量組2 min內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)隨受試物劑量的增加而增加，高劑量組小鼠2 min內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)最多，且與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明，高劑量組的小鼠，學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，兩次水迷宮試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性。

表6 小鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

從表7可見(jiàn)，兩次水迷宮消退試驗(yàn)中，各劑量組小鼠到達(dá)終點(diǎn)時(shí)間、到達(dá)終點(diǎn)前的錯(cuò)誤次數(shù)和2 min內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)動(dòng)物數(shù)與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但高劑量組到達(dá)終點(diǎn)時(shí)間最短，到達(dá)終點(diǎn)前錯(cuò)誤次數(shù)最少，且2 min內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)最多，消退試驗(yàn)對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響隨受試物劑量的增加而減小，兩次消退試驗(yàn)結(jié)論一致。

表7 小鼠水迷宮消退試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

在此研究中，以?；撬?、磷脂酰絲氨酸和亞麻籽油制備得到的磷脂酰絲氨酸牛磺酸復(fù)合物為受試樣品，開(kāi)展小鼠試驗(yàn)，驗(yàn)證其輔助改善記憶的功能。以低劑量組[0.167 g/（kg·bw）]、中劑量組[0.333 g/（kg·bw）]、高劑量組[1.000 g/（kg·bw）]的受試樣品連續(xù)給小鼠灌胃30 d，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，經(jīng)跳臺(tái)試驗(yàn)、避暗試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)三項(xiàng)試驗(yàn)，其中水迷宮和跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，且重復(fù)試驗(yàn)結(jié)論一致。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗(yàn)方法的要求，為輔助改善記憶功能而開(kāi)展的動(dòng)物試驗(yàn)中需滿足任二項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，且重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，可以判定該受試樣品具有輔助改善記憶的功能[14]。由此判定此試驗(yàn)中使用的受試物磷脂酰絲氨酸?；撬釓?fù)合物具有輔助改善記憶的功能。磷脂酰絲氨酸?；撬釓?fù)合物推薦人體日服劑量1 g/d，相當(dāng)于攝入磷脂酰絲氨酸30 mg/d、?；撬?34 mg/d、α-亞麻酸254.4 mg/d。

2022年3月，教育部發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)處于幼兒園、小學(xué)及中學(xué)階段的在校學(xué)齡兒童人數(shù)規(guī)模近2.5億，2021年“三孩”政策正式出臺(tái)助力生育率提升，學(xué)習(xí)是兒童日常生活中非常重要的一部分，在兒童的學(xué)習(xí)狀態(tài)方面，專注力差和記憶力差等問(wèn)題往往是家長(zhǎng)的教育痛點(diǎn)所在，因此有輔助改善記憶功能的營(yíng)養(yǎng)保健食品需求極大。現(xiàn)已確認(rèn)，牛磺酸對(duì)人腦細(xì)胞具有促增殖的作用，可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化與成熟[15]。神經(jīng)元細(xì)胞膜內(nèi)高濃度的PS對(duì)促進(jìn)神經(jīng)元存活具有重要作用，有研究認(rèn)為PS可能是通過(guò)促進(jìn)乙酰膽堿的釋放和增加腦內(nèi)DHA的含量來(lái)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力[16]。ALA作為DHA的前體物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)過(guò)增長(zhǎng)碳鏈和去飽和可以轉(zhuǎn)化成DHA，DHA有助于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，嬰幼兒時(shí)期如果缺乏DHA就會(huì)抑制腦細(xì)胞的充分生長(zhǎng)和樹(shù)突的形成，表現(xiàn)為幼兒的智力低下，足量的DHA有助于提高學(xué)習(xí)記憶能力[8]。相較魚(yú)油來(lái)源的DHA來(lái)說(shuō)，其前體ALA的補(bǔ)充更為安全[17]。此研究所用的牛磺酸、磷脂酰絲氨酸和α-亞麻酸已經(jīng)被廣泛動(dòng)物及臨床研究證實(shí)，可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，有助于提高學(xué)習(xí)記憶能力，因此三者的組合物產(chǎn)品具有良好的發(fā)展前景。相信隨著科研水平的不斷進(jìn)步，未來(lái)會(huì)有更多輔助改善記憶功能的原料和產(chǎn)品被開(kāi)發(fā)，為消費(fèi)者提供更多選擇。