擁青她姆，王珍珍，丁平田

（1. 沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 本溪 117004；2.江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，江蘇 連云港 222000）

苯甲酸阿格列汀二甲雙胍片是用于治療 2 型糖尿病的一種復(fù)方制劑，由 Takeda（武田）公司開發(fā)，最初于 2013 年 1 月獲得 FDA 批準(zhǔn)上市（KAZANO）。該復(fù)方制劑采用兩種不同作用機制的降糖藥物聯(lián)合治療，可通過“降糖和抑糖”的原理，直擊疾病的 3 大缺陷——胰島素分泌缺陷、胰島素抵抗和肝糖原過度輸出。通過具有互補機制的兩種藥物聯(lián)合治療，能夠有效提高患者的治療效果，延緩疾病的進展，并且還能減少不良反應(yīng)的發(fā)生[1-3]。

復(fù)方制劑與單組分制劑相比在技術(shù)上的要求更多，尤其是兩種活性物質(zhì)及輔料之間的相互作用及質(zhì)量控制[4]。目前，苯甲酸阿格列汀二甲雙胍片（以下“復(fù)方片”）在各國藥典中尚未收錄，有部分文獻分析了阿格列汀原料或片劑中的雜質(zhì)[5-8]，但對該復(fù)方片中雜質(zhì)研究的文獻較少。根據(jù)苯甲酸阿格列汀的合成路徑及可能的降解途徑，分析了苯甲酸阿格列汀相關(guān)的可能存在的 10 種雜質(zhì)來源（見圖 1），筆者重點對其中 8 種雜質(zhì)進行了檢測方法開發(fā)和驗證，最終結(jié)合參比制劑和自制制劑穩(wěn)定性結(jié)果重點對 5 種已知雜質(zhì)（雜質(zhì) D、E、F、I 和 J）進行質(zhì)量控制，其中 2 種雜質(zhì)（雜質(zhì) E 和 F）未見文獻報道（見表 1）。

1 材料及儀器

1.1 材料

原料藥：苯甲酸阿格列汀原料藥（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司自制，批號：AL-131001），鹽酸二甲雙胍（山東科源制藥有限公司，批號：P031-1309012）。

Fig.1 Analysis of sources of impurities related to Alogliptin benzoate in alogliptin benzoate and metforminhydrochloride tablet 圖 1 苯甲酸阿格列汀二甲雙胍片中苯甲酸阿格列汀部分雜質(zhì)來源分析

Table 1 Summary of impurity information表1 雜質(zhì)信息匯總

對照品：苯甲酸阿格列汀對照品（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司自制，批號：RS20140102，純度 99.8%），鹽酸二甲雙胍對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：RS20131118，純度 99.9%），苯甲酸阿格列汀有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性對照品（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司自制，批號：20150505，主要含苯甲酸阿格列汀。按面積歸一化法計算（扣除苯甲酸峰），含阿格列汀不得少于 90.0 %，含雜質(zhì) D、E、F、I 與 J 均不得低于 0.2 %，各雜質(zhì)在研究過程均采用 1H-NMR 和 ESI/MS 進行了結(jié)構(gòu)確證）。

試劑：三氟乙酸（色譜純，TEDIA 公司），乙腈（色譜純，MERCK 公司），純化水（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司自制），鹽酸（AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），過氧化氫（AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

輔料：甘露醇（廣西南寧化學(xué)制藥有限責(zé)任公司），微晶纖維素（Asahi Kasei Corporation），聚維酮 K30（BASF Corporation），交聚維酮（BASF SE），硬脂酸鎂（遼寧奧達制藥有限公司），薄膜包衣預(yù)混劑（胃溶型，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司）。

制劑樣品：苯甲酸阿格列汀二甲雙胍片（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，批號：ZS0402、ZS0604、ZS0605、ZS0606），KAZANO（日本武田藥品株式會社，批號：C19819，規(guī)格：12.5mg∶500 mg；批號：C19973，規(guī)格：12.5 mg∶1 000 mg）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Agilent Technologies 公司），XS105DU 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），藥品強光照射試驗箱（重慶永生實驗儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

取本品細粉適量（約相當(dāng)于阿格列汀 25 mg），精密稱定，置 50 mL 量瓶中，以水-乙腈（90∶10）為稀釋液，加稀釋液約 10 mL，超聲 5～10 分鐘，使阿格列汀溶解。再用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取 1 mL，置 200 mL 量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.2 空白輔料配制

復(fù)方片處方含有甘露醇、微晶纖維素、聚維酮 K30、交聯(lián)聚維酮、硬脂酸鎂及薄膜包衣預(yù)混劑。空白輔料處方參考復(fù)方片處方進行配制，配制工藝采用粉末直接過篩混合，混合過程按照“等量遞加稀釋法”進行。

2.3 有關(guān)物質(zhì)方法確定

2.3.1 色譜條件的選擇

（1）流動相與檢測波長選擇

參考參比制劑專利[9]中的色譜條件，流動相 A：純化水∶乙腈∶三氟乙酸=1900∶100∶1（V/V）；流動相B：純化水∶乙腈∶三氟乙酸=100∶1900∶1（V/V），采用反相色譜法，以氰基硅烷鍵合硅膠為填充劑，二極管陣列檢測器（DAD：190～400 nm）上對樣品進行掃描，選取280 nm 作為苯甲酸阿格列汀的檢測波長（見圖 2）。

Fig.2 Sample scanning results of diode array detector (DAD: 190～400 nm)圖2 二極管陣列檢測器樣品掃描結(jié)果（DAD：190～400 nm）

以280 nm 為檢測波長，流速每分鐘 1.0 mL，柱溫 25 ℃，以 0.05 % 三氟乙酸-水為流動相A（V/V），以 0.05 % 三氟乙酸-乙腈為流動相 B（V/V），以不同的梯度程序?qū)Ρ郊姿岚⒏窳型∵M行檢測分析，進行方法學(xué)研究。

（2）梯度選擇

在上述流動相體系下考察不同梯度對苯甲酸阿格列汀及可能存在的雜質(zhì)（雜質(zhì) A、C、D、E、F、G、I 和 J）的分離情況的影響。結(jié)果顯示，在 Ⅲ 梯度條件下，主成分保留時間合適、峰形較好、各雜質(zhì)間分離度符合要求。故選擇此梯度進行下步實驗（見表 2）。

Table 2 Selection of mobile phase gradient表2 流動相梯度的選擇

（3）柱溫選擇

選用上述確定的色譜條件，考察不同柱溫對阿格列汀、苯甲酸、雜質(zhì) A、C、D、E、F、G、I 和 J 的分離效果的影響。結(jié)果顯示，在 25～40 ℃ 之間，隨著柱溫的升高，主峰保留時間逐漸提前，相鄰雜質(zhì)間的最小分離情況變好。綜合考慮，選用 35 ℃ 作為檢測溫度（見表 3）。

Table 3 Selection of Column temperature表3 柱溫選擇

根據(jù)以上實驗結(jié)果確定色譜條件為：照高效液相色譜法（《中國藥典》2020 年版四部通則0512）測定，以氰基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent SB CN,250 × 4.6 mm,5 μm 或效能相當(dāng)?shù)纳V柱），以 0.05 % 三氟乙酸-水（取三氟乙酸 0.5 mL，加水 1 000 mL 溶解）為流動相 A，以0.05 % 三氟乙酸-乙腈（取三氟乙酸 0.5 mL，加乙腈 1 000 mL 溶解）為流動相 B，流速為每分鐘 1 mL，柱溫為 35 ℃，按表 4 進行線性梯度洗脫，檢測波長為 280 nm。

Table 4 Elution procedure表4 洗脫程序

2.3.2 方法驗證

（1）系統(tǒng)專屬性試驗

為確定在上述色譜條件下，合成中的起始原料 A（雜質(zhì) A）、主要中間體（雜質(zhì) C）、已知雜質(zhì)（雜質(zhì) D、E、F、G、I 和 J）以及空白輔料（包括鹽酸二甲雙胍）能夠被明確的區(qū)分，進行方法的專屬性考察。

結(jié)果顯示，在該色譜條件下，鹽酸二甲雙胍和空白輔料對本品雜質(zhì)的檢測沒有影響（見圖 3）。苯甲酸阿格列汀與其他可能存在的起始原料、中間體及各已知雜質(zhì)等的分離度均符合規(guī)定（見表5 及圖 4）。所以，在確定的色譜條件下能準(zhǔn)確的檢測樣品的雜質(zhì)，方法專屬性較好。

Table 5 The specificity and system suitability表5 專屬性與系統(tǒng)適用性

Fig 3 Chromatogram of blank excipients (containing metformin hydrochloride)圖3 空白輔料（含鹽酸二甲雙胍）的色譜圖

Fig.4 Separation degree of alogliptin from benzoic acid and impurities圖4 阿格列汀與苯甲酸及雜質(zhì)的分離度

（2）破壞性試驗

取鹽酸二甲雙胍+空白全輔料，分別進行強酸（0.1 mol·L-1）、強堿（0.1 mol·L-1）、氧化（10% H2O2）、熱解（90 ℃）、高溫（105 ℃）和光照（光強度 4 500 lx ± 500 lx）破壞試驗。24小時后，用稀釋液配制成含鹽酸二甲雙胍 20 mg·mL-1的溶液。復(fù)方片適量，同上述破壞試驗條件，24 小時后，配制成含阿格列汀 0.5 mg·mL-1的溶液。上述溶液分別進樣，考察在該色譜條件下復(fù)方片的有關(guān)物質(zhì)與降解雜質(zhì)的分離和檢測能力，以及鹽酸二甲雙胍+空白全輔料對復(fù)方片中苯甲酸阿格列汀有關(guān)物質(zhì)檢測的影響。由表 6 可以看出，在本色譜條件下，各強降解條件下峰純度結(jié)果均符合規(guī)定，破壞試驗所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物能夠被很好地分離、檢測，空白全輔料+鹽酸二甲雙胍及其破壞試驗所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物不干擾苯甲酸阿格列汀有關(guān)物質(zhì)的檢測。復(fù)方片在熱解條件下嚴(yán)重降解，主要降解雜質(zhì)為 RRT 1.42、RRT 1.44（分子量均為 382）；氧化條件下有降解，主要降解雜質(zhì)為 RRT 0.59（分子量約為 357）；堿條件下有降解，主要降解雜質(zhì)為 RRT 0.36（雜質(zhì) E）、RRT 0.59（分子量約為 357）；高溫條件有降解，降解產(chǎn)物主要 RRT=1.44,1.53,1.59,2.27,雜質(zhì) C（見表6）。

Table 6 Summary of degradation products of alogliptin benzoate and metformin hydrochloride tablets表6 苯甲酸阿格列汀二甲雙胍片強制降解試驗

本品在穩(wěn)定性放樣過程中未發(fā)現(xiàn)有明顯的未知降解雜質(zhì)產(chǎn)生。因此，我們暫未對破壞實驗產(chǎn)生的雜質(zhì)進一步研究。

綜合上述破壞試驗結(jié)果可知，采用上述色譜條件可以測定本品中的苯甲酸阿格列汀有關(guān)物質(zhì)及其降解產(chǎn)物。

（3）檢測波長的確定

在二極管陣列檢測器（DAD）上提取到苯甲酸阿格列汀及主要雜質(zhì)的光譜圖（見圖 5）。根據(jù)各已知雜質(zhì)的光譜圖，分別于 220 nm 和 280 nm 處比較成品及強降解實驗中雜質(zhì)的檢測能力。

A: The spectrum of alogliptin benzoate;B: The spectrum of Impurity E;C: The spectrum of Impurity F;D: The spectrum of Impurity J;E: The spectrum of ImpurityD;F: The spectrum of Impurity A;G: The spectrum of Impurity G;H: The spectrum of Impurity I;I: The spectrum of Impurity CFig 5 The spectrum of alogliptin benzoate and the main impurities extracted on the diode array detector (DAD)A：苯甲酸阿格列汀光譜圖；B：雜質(zhì) E 的光譜圖；C：雜質(zhì) F 的光譜圖；D：雜質(zhì) J 的光譜圖；E：雜質(zhì) D 的光譜圖；F：雜質(zhì)A 的光譜圖；G：雜質(zhì) G 的光譜圖；H：雜質(zhì) I 的光譜圖；I：雜質(zhì) C 的光譜圖圖5 在二極管陣列檢測器（DAD）上提取到的苯甲酸阿格列汀及主要雜質(zhì)的光譜圖

從對成品及強降解實驗樣品的檢測結(jié)果可以看出，各條件下，280 nm 檢出雜質(zhì)的個數(shù)高于220 nm，兩者檢出的未知雜質(zhì)總量相當(dāng)（見表 7）。綜合考慮，選 280 nm 作為檢測波長。nm

Table 7 The ability of different wavelengths to detect impurities in finished products and strong degradation experiments表7 不同波長對成品、強降解實驗中雜質(zhì)的檢出能力

（4）檢測限與定量限

在本試驗條件下，配制不同濃度的樣品溶液，分別進樣確定本品與各雜質(zhì)的檢測限和定量限。數(shù)據(jù)結(jié)果見表 8。

Table 8 Validation data for the limit of detection and limit of quantification表8 檢測限和定量限的驗證數(shù)據(jù)

（5）線性范圍和相對校正因子

為了消除波長對雜質(zhì)檢測的差異性，進行相對校正因子的測定。分別精密稱取苯甲酸阿格列汀、雜質(zhì) E、F、J、D、A、G、I 及 C 約 25 mg，加乙腈溶解稀釋，配制成約 5 μg·mL-1的溶液，作為雜質(zhì)儲備液。分別精密量取上述雜質(zhì)儲備液 1、2.5、5、10 和 20 mL 分別置 50 mL 量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，作為雜質(zhì)限度 0.02%、0.05%、0.1%、0.2% 和 0.4% 的供試品溶液。精密量取上述溶液各 20 μL，分別注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，量取峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸，以阿格列汀檢測濃度（0.5 mg·mL-1）為 100% 的相對濃度，實驗結(jié)果見表9。苯甲酸阿格列汀各雜質(zhì)在 0.03～2.21 μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，雜質(zhì) J、D、A、G 和 C在選定色譜條件下的吸收強度與苯甲酸阿格列汀相當(dāng)。

Table 9 Validation data for the linearity and relative response factor表9 線性和相對響應(yīng)因子的驗證數(shù)據(jù)

同時，根據(jù)各雜質(zhì)與阿格列汀的斜率，采取以下公式計算相對校正因子：

雜質(zhì) F 的相對校正因子為 1.5，不在 0.8～1.2 范圍內(nèi)，雜質(zhì) F 在結(jié)果中乘以相對校正因子后得最終結(jié)果，可以準(zhǔn)確反映樣品雜質(zhì)的質(zhì)量情況。

雜質(zhì) E 和雜質(zhì) I 的相對校正因子為 0.6 和 0.63，不在 0.8～1.2 范圍內(nèi)，為了更好的控制本品的質(zhì)量，計算均不作修正。

（6）溶液穩(wěn)定性

供試品溶液在室溫條件下放置 24 小時，在有關(guān)物質(zhì)方法下于不同時間測定，雜質(zhì) E、F、A、G、I 和 C 均未檢出；雜質(zhì) J 的平均值為 0.01 %，SD=0；雜質(zhì) D 的平均值為 0.05 %，SD=0；最大未知單雜平均值為 0.04 %，SD=0.005 %；總雜平均值為 0.22 %，SD=0.005 %。

苯甲酸阿格列汀有關(guān)物質(zhì)測定溶液在室溫條件下放置 24 小時穩(wěn)定。

（7）雜質(zhì)回收率

精密稱取復(fù)方片適量，用稀釋溶液溶解并定量稀釋制成每 1 mL 約含阿格列汀 0.5 mg 的溶液，作為回收率基質(zhì)樣品。分別精密稱取雜質(zhì) E、F、J、D、A、G、I 及 C，用乙腈超聲溶解，配制成 0.5 μg·mL-1的溶液，作為雜質(zhì)對照品溶液，平行配制 2 份。分別精密稱取雜質(zhì) E、F、J、D、A、G、I 及 C 各適量至 250 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取 10 mL至 200 mL 量瓶中，用稀釋溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為母液備用。分別精密量取上述母液 1、2.5、5、10、20 mL 至含基質(zhì)樣品的 50 mL 量瓶中，用稀釋溶液稀釋至刻度，搖勻，作為回收率 0.02 %、0.05 %、0.1 %、0.2 %、0.4 % 的供試品溶液，平行配制 3 份。精密量取上述溶液各 20 μL，分別注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，量取峰面積。按外標(biāo)法以峰面積計算各雜質(zhì)的回收率。

結(jié)果顯示，在 0.02 %～0.40 % 濃度范圍內(nèi)，雜質(zhì)平均回收率分別為 99.7 %、98.5 %、100.7 %、98.4 %、98.7 %、99.6 %、98.5 % 和 100.0 %，RSD 分別為 1.7 %、2.5 %、1.3 %、1.8 %、1.7 %、1.2 %、0.78 % 和 2.0 %（n=15），表明該方法檢測各雜質(zhì)準(zhǔn)確、可靠。

（8）有關(guān)物質(zhì)重復(fù)性試驗

取成品，按照有關(guān)物質(zhì)測定的方法重復(fù)測定 6 次，雜質(zhì) J 的平均值為 0.01 %，SD=0；雜質(zhì) D 的平均值為 0.04 %，SD=0；其他已知雜質(zhì)均未檢出；最大未知單雜平均值為 0.03 %，SD=0.004 %；總雜平均值為 0.16 %，SD=0.004 %。因此，說明本方法重復(fù)性很好。

（9）方法的耐用性

在本色譜條件下，微調(diào)柱溫、流動相中三氟乙酸濃度以及更換不同批次的色譜柱（Agilent SB CN,250 × 4.6 mm,5.0 μm），檢測系統(tǒng)適用性溶液和成品考察方法的耐用性，試驗設(shè)計見表 10。由結(jié)果可知，各個已知雜質(zhì)與主峰分離度、雜質(zhì)間的分離度均較好。故本方法在色譜條件有微小變化時的耐用性良好。

Table 10 Results of robustness表10 方法耐用性

（10）中間精密度試驗

取成品由人員 A、B、C 在不同時間分別用不同儀器（Agilent 1260 系列 1 和 Agilent 1200 系列）所測得的 6 個樣品中，雜質(zhì) E、F、A、G、I 和 C 均未檢出；雜質(zhì) J 的平均值為 0.02 %，SD=0.005 %；雜質(zhì) D 的平均值為 0.04 %，SD=0.004 %；最大未知單雜平均值為 0.03 %，SD=0；總雜平均值為 0.16 %，SD=0.01 %。

本方法通用性很好，不同儀器、不同時間及不同人員的差異很小。

2.4 樣品測定

采用上述有關(guān)物質(zhì)檢測條件進行 4 批自制制劑與 2 批參比制劑檢測，結(jié)果如表 11 所示。雜質(zhì) E、F 和 I 均未檢出，雜質(zhì) J 在自制制劑中有檢出，雜質(zhì) D 為降解雜質(zhì)，在自制和參比制劑樣品中均有檢出。

Table 11 Determination results of related substances of alogliptin benzoate and metformin hydrochloride表11 苯甲酸阿格列汀二甲雙胍片有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

2.5 限度制定考慮

結(jié)合表 10 自制制劑和參比制劑檢測結(jié)果以及產(chǎn)品穩(wěn)定性研究結(jié)果（未發(fā)表數(shù)據(jù)），對于已知雜質(zhì)只檢出了雜質(zhì) J 和 D。其中雜質(zhì) D 為潛在的降解雜質(zhì)，同時結(jié)合 ICH Q3B[10]，規(guī)定其限度為 0.5 %，規(guī)定雜質(zhì) J 的限度為 0.2 %。

其他已知雜質(zhì)均未檢出，其中雜質(zhì) E 為潛在的降解雜質(zhì)（制劑中堿破壞條件降解），雜質(zhì) F為主峰后雜，雜質(zhì) I 為原料藥中較難去除的雜質(zhì)。因此，將雜質(zhì) E、F 和 I 訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，限度均為 0.2 %。

按一般制劑對雜質(zhì)控制的限度要求，同時結(jié)合各批樣品的檢測結(jié)果，規(guī)定其它單個未知雜質(zhì)的限度均為 0.2 %，總雜限度為 2.0 %。

3 討論

本研究結(jié)合原料藥的合成路徑以及復(fù)方片可能存在的降解途徑，充分的分析了相關(guān)雜質(zhì)的來源，結(jié)合《中國藥典》、ICH Q2[11]系列雜質(zhì)研究的相關(guān)指導(dǎo)原則，對復(fù)方片中的雜質(zhì)檢測方法進行了充分的驗證，最終結(jié)合自制制劑和參比制劑的檢測結(jié)果合理提出雜質(zhì)控制限度。該方法已成功應(yīng)用于本品后續(xù)的穩(wěn)定性檢測、生產(chǎn)質(zhì)量控制中。

同時，糖尿病治療的臨床用藥便捷性的需求在不斷增加[12-13]，復(fù)方制劑是未來的發(fā)展方向之一。本品雜質(zhì)控制方法的研究，也為后續(xù)含有苯甲酸阿格列汀的復(fù)方產(chǎn)品質(zhì)量控制提供一種樣品處理便捷、重復(fù)性好、精密度高的檢測方法。