趙 欣，左 琳，白英漢，劉博文，楊 強(qiáng)

（沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司，遼寧 沈陽(yáng)，110164）

溶菌酶，又稱胞壁質(zhì)酶，是由 Fleming 于 1922 年首次發(fā)現(xiàn)的一種能夠有效地溶解細(xì)菌的成分，廣泛分布于眼淚、唾液、乳汁、心臟、腎臟等多種體液及器官組織中[1-3]。外眼直接暴露在含有各種病原微生物的環(huán)境中，淚液作為最外層屏障發(fā)揮著重要的抗感染防御作用。淚液中含有多種抗微生物的物質(zhì)，例如溶菌酶、乳鐵蛋白、β-溶素、免疫球蛋白、補(bǔ)體等。其中，含量最豐富的是溶菌酶，占淚液中蛋白質(zhì)成分的 20%～40%[4]。淚液中溶菌酶的來源主要是淚腺細(xì)胞，含量約為 1～3 mg·mL-1，是血清中的上千倍[5]。已有研究表明，各種眼病患者淚液中溶菌酶水平會(huì)發(fā)生顯著變化，如干燥性角結(jié)膜炎及干燥綜合征可導(dǎo)致患者淚液中溶菌酶含量顯著降低[6-7]；在煙霧、化學(xué)氣體等污染環(huán)境中淚液中溶菌酶含量也有下降[8-9]；佩戴角膜接觸鏡人群淚液中溶菌酶含量也會(huì)顯著降低[10]。淚液中溶菌酶的改變不僅對(duì)眼部疾病的診斷和治療具有重要意義，也為補(bǔ)充溶菌酶進(jìn)行治療提供依據(jù)。

溶菌酶滴眼液早在上世紀(jì)八十年代就已上市，具有抗菌抗炎作用，主要用于治療慢性結(jié)膜炎。溶菌酶的作用機(jī)制：首先，通過水解β-1,4 糖苷鍵有效清除細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)胞壁不穩(wěn)定；其次，通過其陽(yáng)離子性質(zhì)的機(jī)制，不依賴肽聚糖水解殺死細(xì)菌；同時(shí)，溶菌酶具有良好的生物相容性，不易產(chǎn)生耐藥性[11-12]。不僅如此，近期研究表明，溶菌酶作為一種眼表宿主防御肽，除能保持眼部健康外，還可在疾病治療中發(fā)揮巨大潛力[13]。如溶菌酶能減少角膜接觸鏡上白蛋白沉淀物，降低細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)[14]；溶菌酶滴眼液不僅能有效緩解和改善干眼癥，同時(shí)，能促進(jìn)眼表?yè)p傷修復(fù)和抑制炎性反應(yīng)，且效果優(yōu)于玻璃酸鈉滴眼液[15]。以上研究為溶菌酶滴眼液開拓新型適應(yīng)癥提供了基礎(chǔ)。然而，關(guān)于溶菌酶滴眼液在眼內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究鮮有報(bào)道，藥品說明書也缺少藥代動(dòng)力學(xué)研究的相關(guān)數(shù)據(jù)。相對(duì)于化學(xué)藥而言，溶菌酶有分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、內(nèi)源性物質(zhì)干擾強(qiáng)等特點(diǎn)，故藥代動(dòng)力學(xué)研究需要靈敏度更高且特異性更強(qiáng)的定量檢測(cè)方法。目前，測(cè)定溶菌酶常用的方法包括比濁法和平板擴(kuò)散法。然而，這兩種定量方法干擾因素較多，且重復(fù)性和靈敏度較差[16-17]。史瑾等人[18]分別采用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、免疫印跡法和反相高效液相色譜法測(cè)定兔眼房水中溶菌酶的濃度。但受這些檢測(cè)方法靈敏度的限制，18 個(gè)樣品中僅有 2 個(gè)被檢出。本次研究建立靈敏度高且專屬性強(qiáng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法檢測(cè)溶菌酶的濃度，并應(yīng)用于研究溶菌酶滴眼液在單多次給藥后兔眼組織和血清的藥代動(dòng)力學(xué)研究中，揭示溶菌酶滴眼液局部給藥后眼內(nèi)動(dòng)力學(xué)特征，為臨床用藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Multiskin Sky 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo 公司），XS105 型分析天平（瑞士 Metter-Toledo公司），AllegraTMX-22R 型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó) Beckman 公司），手持裂隙燈（日本 Kowa公司），淚液微量采集器（廣州盛澤康華生物醫(yī)藥有限公司），組織勻漿機(jī)（法國(guó) Bertin technologies公司），微量加樣器（美國(guó) Eppendorf 公司）。

1.2 試劑與藥品

ELISA 試劑盒（雞溶菌酶試劑盒，批號(hào) NBP2-60088，美國(guó) NOVUS 公司），溶菌酶對(duì)照品（上海中華藥業(yè)有限公司），溶菌酶滴眼液（沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司），純化水（自制）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭兔，46 只，體重 2.0～2.5 kg，雌雄各半（青島康大愛博生物科技有限公司，質(zhì)量合格證明號(hào)：No.37082321100065548）。所有動(dòng)物均在環(huán)境技術(shù)指標(biāo)符合的條件下飼養(yǎng)，溫度為 16～26 °C，濕度保持在 40%～70%，給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期（12 h 小時(shí)照明/ 12 h 黑暗明暗交替）?？勺杂蓴z入食物和水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)前，將所有兔左眼進(jìn)行熒光素鈉染色，在裂隙燈下觀察，角膜沒有損傷的兔可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 給藥和淚液采集

12 只新西蘭兔，雌雄各半。精密吸取 50 μL 溶菌酶滴眼液，6 只左眼單次給予溶菌酶滴眼液，于給藥后 0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、24 h 采用淚液采集器收集淚液；6 只左眼多次給予溶菌酶滴眼液，每天 4 次，間隔 3 h，連續(xù)用藥 7 天。于 4、5、6 天首次給藥后的 0.5 h以及 7 天給藥前和首次給藥后 0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、24 h 采用淚液采集器收集淚液。所有淚液樣品于 -80 °C 保存待測(cè)。

2.2 角膜去上皮處理和眼組織采集

12 只采用 10% 水合氯醛耳緣靜脈注射進(jìn)行全身麻醉，左眼采用 0.5% 丙美卡因滴眼液眼局部麻醉后，將直徑為 6 mm 的圓形濾紙片浸潤(rùn) 75% 酒精，立即放于角膜中央 30 s，用尖刀刮除角膜上皮，并采用熒光素鈉染色證實(shí)角膜上皮缺損，如圖 1 所示。

Fig.1 Fluorescein sodium staining of rabbit cornea(A: normal cornea;B: de-epithelized cornea)圖1 兔角膜熒光素鈉染色檢查圖（A：正常角膜；B：去上皮角膜）

2.3 生物樣品采集和處理

12 只正常和 12 只去角膜上皮兔左眼分別單次給予 50 μL 溶菌酶滴眼液，于給藥后 0.5、1、4 和 8 h 取血后處死，分別取角膜、結(jié)膜、房水。全血放入無抗凝劑采血管中離心取上清，制備血清；角膜、結(jié)膜組織經(jīng)蒸餾水清洗三遍后，用濾紙吸干并稱重，按1∶10（g·mL-1）的比例加入蒸餾水并在 4 °C 條件下進(jìn)行勻漿處理。

2.4 ELISA 法測(cè)定生物樣品中溶菌酶濃度的原理和方法

ELISA 試劑盒基于競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫法定量檢測(cè)生物樣品中溶菌酶的濃度。在預(yù)包被抗溶菌酶抗體的 96 孔微孔板上，加入含有溶菌酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液或生物樣品以及生物素標(biāo)記的溶菌酶，標(biāo)準(zhǔn)溶液或生物樣品中的溶菌酶和生物素標(biāo)記溶菌酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合預(yù)包被抗體。洗去未結(jié)合物質(zhì)后，加入親和素或鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）。洗滌后加入 HRP底物四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine,TMB）顯色，終止酶反應(yīng)后，測(cè)定 450 nm處的吸光度。吸光強(qiáng)度與樣品中所含溶菌酶的濃度成反比。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值（Mean）± 標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，通過 Graph Pad Prism 6.0 軟件進(jìn)行圖的處理，采用Winnonlin 軟件對(duì)檢測(cè)濃度進(jìn)行藥代參數(shù)計(jì)算；采用 Excel 2021 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，雙側(cè)t檢驗(yàn)比較組間差異，P＜ 0.05 判定兩組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ELISA 法測(cè)定兔淚液中溶菌酶濃度的方法學(xué)驗(yàn)證

1）選擇性

采用 10 個(gè)不同來源的兔空白淚液配制最低定量濃度（Lower limit of quantification,LLOQ）和最高定量濃度（Upper limit of quantification,ULOQ）的樣品。按照 ELISA 試劑盒方法測(cè)定吸光度值，分別考察不同來源的空白樣品、LLOQ 和 ULOQ 質(zhì)控樣品，結(jié)果見表 1。10 個(gè)不同來源的空白樣品響應(yīng)均低于 LLOQ 的響應(yīng)，LLOQ 和 ULOQ 的準(zhǔn)確度在標(biāo)示值的 ±25% 之內(nèi)。

Table 1 Selectivity for lysozyme in rabbit tears (n=10)表1 ELISA 法測(cè)定淚液中溶菌酶的選擇性（n=10）

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限

采用兔空白淚液配制溶菌酶校正標(biāo)樣，濃度分別為 62.50、125.0、250.0、500.0、1000、2000、4000 ng·mL-1。按照 ELISA 試劑盒方法測(cè)定吸光度值，每個(gè)濃度雙樣本，取其平均值。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，經(jīng)四參數(shù) Logistic 模型擬合成 Sigmoidal 型曲線，權(quán)重為 1/x2，典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2 所示。相關(guān)系數(shù)r＞ 0.99，線性范圍為 62.50～4 000 ng·mL-1，定量下限為62.50 ng·mL-1。

Fig.2 Typical standard curve of lysozyme in tears圖2 淚液中溶菌酶的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3）精密度和準(zhǔn)確度

采用兔空白淚液分別配制定量下限、低、中、高和定量上限濃度的質(zhì)控（Quality control,QC）樣品，即 62.50、160.0、800.0、3 200、4 000 ng·mL-1。每一個(gè)質(zhì)控樣品在同一批中重復(fù) 3 次測(cè)定，考察批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度；以連續(xù) 6 個(gè)分析批測(cè)定每一濃度質(zhì)控樣品的吸光度值，考察批間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表 2。溶菌酶的各濃度 QC 樣品的精密度和準(zhǔn)確度均在 ±20% 以內(nèi)。

Table 2 Precision and accuracy for lysozyme in rabbit tears表2 ELISA 法測(cè)定淚液中溶菌酶的精密度和準(zhǔn)確度

4）穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用兔空白淚液分別配制溶菌酶 160、3200 ng·mL-1兩個(gè)濃度 QC 樣品，考察其在室溫放置4 h、-80 °C 放置 20 d、4 °C 放置 1 d 和經(jīng)歷三次凍融循環(huán)等不同條件下保存穩(wěn)定性（結(jié)果見表3）。溶菌酶在上述 4 種條件下測(cè)定的 RE 均在 ±20% 以內(nèi)，對(duì)測(cè)定結(jié)果均沒有明顯影響。

Table 3 Stability for lysozyme under various storage conditions in rabbit tears表3 采用 ELISA 法測(cè)定不同存放條件下淚液中溶菌酶的穩(wěn)定性

5）稀釋線性試驗(yàn)

制備含溶菌酶高濃度的淚液樣品，逐級(jí)稀釋，計(jì)算回算濃度的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，當(dāng)稀釋度不大于 1∶2 000 時(shí)，樣品稀釋后再測(cè)定對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度影響不大，其 RSD 值均小于 20%，RE 均在 ±20% 以內(nèi)。

3.2 兔淚液中溶菌酶藥代動(dòng)力學(xué)研究

兔眼給予 0.5% 的溶菌酶滴眼液后淚液中不同時(shí)間平均濃度—時(shí)間曲線見圖 3。采用Winnonlin 藥動(dòng)學(xué)計(jì)算軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表 4。結(jié)果表明，單次給藥后淚液中溶菌酶濃度迅速達(dá)到峰濃度，Cmax為 (219.5 ± 41.72) μg·mL-1。隨后緩慢消除，24 h 仍能檢測(cè)到溶菌酶的濃度為 1.96 μg·mL-1，約為 Cmax的 0.9%，AUC0-24h為 (572.5 ± 100.9) h·μg·mL-1。溶菌酶滴眼液以每天 4 次進(jìn)行多次給藥，比較第 4、5、6 天首次給藥后 0.5 h 淚液中溶菌酶的濃度，差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示連續(xù)給藥 3 天后淚液中溶菌酶達(dá)到穩(wěn)態(tài)。與單次給藥相比，連續(xù)給藥后淚液中溶菌酶的含量顯著增加，Cmax為 (714.6 ± 191.0) μg·mL-1，約是單次給藥的 3.3 倍，AUC0-24h約是單次給藥的 6.1 倍，且t1/2也從單次給藥的 6.91 h 延長(zhǎng)到 10.6 h。

Fig.3 Plots of mean concentration versus time for lysozyme in tears after a single and repeated administration of 0.5% lysozyme eye drops to rabbits (n =6)圖3 兔眼單多次給予 0.5% 溶菌酶滴眼液后淚液中溶菌酶的平均藥物濃度-時(shí)間曲線（n=6）

Table 4 Summary of pharmacokinetic parameters after ocular instillation of lysozyme eye drops to rabbit eyes (n=6)表4 兔眼單多次給予 0.5% 溶菌酶滴眼液淚液中溶菌酶的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)（n=6）

3.3 兔眼組織和血清中溶菌酶分布

分別采用兔空白眼組織液（房水和角膜、結(jié)膜勻漿液）和空白血清配制溶菌酶校正標(biāo)樣，濃度分別為 62.50、125.0、250.0、500.0、1000、2000、4000 ng·mL-1。按“標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限”項(xiàng)下操作，所得溶菌酶在各眼組織和血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表 5 所示，結(jié)果表明，所建立的方法線性關(guān)系良好。

Table 5 Standard curves of lysozyme in biological matrix表5 生物基質(zhì)中溶菌酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線

正常組和去角膜上皮組兔左眼給予溶菌酶滴眼液后各時(shí)間點(diǎn)在眼組織的分布如圖 4 所示。結(jié)果表明，溶菌酶局部給藥后在正常組兔角膜、結(jié)膜均有分布，達(dá)峰時(shí)間均為1 h，含量分別為948.4 ng·g-1和 523.8 ng· g-1，隨后緩慢消除，給藥后8 h在角膜、結(jié)膜中溶菌酶的量分別為 Cmax的 49.8% 和 68.8%；房水中僅有兩只兔被檢出，其余均低于檢測(cè)定量下限（62.50 ng·mL-1）。去角膜上皮后溶菌酶在角膜分布的 Cmax為 38 288 ng·g-1，Tmax為 1 h，各時(shí)間點(diǎn)溶菌酶的含量與正常組相比均顯著增大（P＜ 0.05），約是 34～56 倍；去角膜上皮后各時(shí)間點(diǎn)溶菌酶在房水中均可被檢出，且與正常組相比分布亦顯著增大，其中 Cmax為 13 030 ng·mL-1，Tmax為 1 h；各時(shí)間點(diǎn)溶菌酶在結(jié)膜分布與正常組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組動(dòng)物血清中均未檢測(cè)到溶菌酶的量。

Fig.4 The concentration of lysozyme in normal and de-epithelized rabbits after a single administration of 0.5%lysozyme eye drops (n=3)(Compared with the control group，*P <0.05，**P <0.01)圖4 正常和去上皮角膜兔眼單次給予0.5%溶菌酶滴眼液后各眼組織中溶菌酶的量（n=3）（與正常組相比，*P ＜ 0.05，**P＜ 0.01）

4 討論

溶菌酶是一種糖苷水解酶，具有 4 個(gè) S-S 鍵，分子量約為 14 KD，普遍存在于人和動(dòng)物的多種組織中，可以溶解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁，對(duì)其具有殺滅作用。雞和人溶菌酶的第 56 位和第 67 位兩個(gè)殘基位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)上高度保守，與其他動(dòng)物相比兩者結(jié)構(gòu)相似度最高，故目前臨床上使用最廣泛的是雞蛋清溶菌酶[19]。本次研究給予的溶菌酶滴眼液也是以雞蛋清溶菌酶為原料，給予兔眼后采用雞源溶菌酶 ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)分析。該試劑盒的原理是間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)生物樣品中的溶菌酶，在微孔板上預(yù)包被抗溶菌酶抗體，所檢測(cè)的生物樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的溶菌酶、生物素標(biāo)記溶菌酶在微孔板上競(jìng)爭(zhēng)抗溶菌酶抗體，導(dǎo)致樣本吸光度值與所含溶菌酶的量負(fù)相關(guān)。本次研究分別用空白房水、血清以及角膜和結(jié)膜勻漿液上清制備溶菌酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線；由于淚液采集量?jī)H為 2 μL，淚液樣品需稀釋后測(cè)定。為確保樣品濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性，本次研究對(duì)生物樣品中溶菌酶進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明所建立的測(cè)定方法符合藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)要求[20]，且該方法的定量下限可達(dá)到 62.50 ng·mL-1，并將該方法成功用于溶菌酶滴眼液?jiǎn)?、多次給藥兔淚液的藥動(dòng)學(xué)研究。結(jié)果表明溶菌酶滴眼液連續(xù)用藥的 3 天后達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度，多次給藥不僅增加眼組織中藥物濃度，而且增加藥物的作用時(shí)間。

眼表相關(guān)疾病導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)可直接損害眼表上皮細(xì)胞。角膜上皮是外界環(huán)境與角膜基質(zhì)間的屏障，其依靠角膜上皮間緊密連接形成較高的抵抗能力[21]。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的角膜是由上皮層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層構(gòu)成。本次研究采用去角膜上皮模擬受損角膜，通過與正常角膜對(duì)比分析溶菌酶分布差異。溶菌酶屬于大分子藥物，試驗(yàn)表明局部使用后幾乎無法穿過正常的角膜進(jìn)入房水。但是，當(dāng)角膜上皮細(xì)胞受到破壞后，其在角膜和房水的分布量均顯著升高。進(jìn)一步證明角膜對(duì)大分子藥物的屏障主要是通過上皮層發(fā)揮作用，與文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致。

眼表是一個(gè)精細(xì)又復(fù)雜的體系，不僅包括角膜、結(jié)膜、瞼板腺、淚腺、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)，還有免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、激素甚至微生物群等共同維持眼表的穩(wěn)態(tài)。長(zhǎng)期使用抗生素眼藥水，不僅容易產(chǎn)生耐藥性，還會(huì)導(dǎo)致眼表穩(wěn)態(tài)的失調(diào)。溶菌酶主要作用于菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的相關(guān)化學(xué)鍵，故對(duì)人和動(dòng)物是安全的。它是正常淚液的重要組成成分，不易產(chǎn)生耐藥性，不僅對(duì)組織無刺激性和毒性，還可為眼表提供額外的抗感染作用。劉慧等人[23]研究溶菌酶對(duì)幾種菌的抑菌試驗(yàn)表明，溶菌酶濃度在 2.5 μg·mL-1以上對(duì)溶壁微球菌具有殺菌作用；濃度在 1～3 mg·mL-1對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有殺菌作用；Yeon 等人[6]研究發(fā)現(xiàn) 30 名 Sj?gren's syndrome 患者與 30 名非干眼患者相比，淚液中溶菌酶的含量下降約 700 μg·mL-1。依本次研究可知，如以 0.5% 溶菌酶滴眼液每天 4 次連續(xù)給藥后，淚液中溶菌酶的量可達(dá)到 (714.6 ± 191.0) μg·mL-1，可有效補(bǔ)充淚液中溶菌酶的量。近年來，多名學(xué)者對(duì)溶菌酶的抑菌活性做了深入研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和部分革蘭氏陰性菌及真菌等都有一定的抑菌作用，部分抑菌效果與常用抗生素如青霉素鈉及硫酸卡胺那霉素等相同[24-25]。

5 結(jié)論

本次研究建立了 ELISA 法測(cè)定眼組織中的溶菌酶，并將該方法用于溶菌酶滴眼液?jiǎn)味啻谓o藥兔眼組織的藥代動(dòng)力學(xué)研究。溶菌酶滴眼液多次給藥后在淚液的分布增加，且作用時(shí)間延長(zhǎng)。鑒于它的天然、安全、高效、廣譜，溶菌酶滴眼液有望成為一種眼表保護(hù)劑。