吳秀麗,徐 琴,胡 爽,劉 相,諶 芬,彭亞軍

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科,湖南 長沙 410007)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropath, DPN)發(fā)病率約占糖尿病所致慢性并發(fā)癥的50%,可引起患者周圍神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛損傷［1]。目前研究表明［2-3],高糖環(huán)境下氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress, ERS)能夠進一步介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)組織損傷,導(dǎo)致DPN發(fā)病。其中蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)的活化可直接誘發(fā)蛋白質(zhì)合成抑制,長時間的蛋白合成抑制則通過一些致凋亡基因如CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)的表達活化ERS凋亡途徑的發(fā)生,與DPN的發(fā)生密切相關(guān)［4]。枸杞多糖是從傳統(tǒng)藥材枸杞中提取的主要藥效成分,具有降血糖、抑制凋亡和抗氧化等藥理作用,對糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥具有良好的改善效果［5]。有研究表明［6],枸杞多糖可通過抗氧化途徑保護DPN大鼠周圍神經(jīng)功能,然而其神經(jīng)保護作用是否與ERS信號通路相關(guān)尚不明晰。本研究在此基礎(chǔ)上,觀察枸杞多糖對DPN模型大鼠神經(jīng)損傷的治療作用,以及枸杞多糖通過調(diào)節(jié)PERK-CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡途徑改善DPN的潛在機制,為枸杞多糖的進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠共50只,SPF級,體質(zhì)量180～220 g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供,動物使用許可證號:SYXK(湘)2020-0010。飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房中,室內(nèi)12 h光照與黑暗交替。

1.2 實驗藥物及試劑 枸杞多糖(500 mg)購自上海源葉生物科技有限公司,純度為98%,為茄科植物寧夏枸杞(lyciumbarbarumL.)果實的提取物;鏈脲佐菌素(STZ)購自美國 Sigma 公司、α-硫辛酸購自美國Puritan’s Pride公司;PERK、CHOP、磷酸化PERK(p-PERK)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose regulated protein 78, GRP78)、B細(xì)胞淋巴瘤2(b-cell lymphoma-2, BCL-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(recombinant Bcl-2 associated X protein, BAX)一抗購自美國CST公司;Trizol總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自購自日本TaKaRa公司。

1.3 模型建立與給藥 50只SD大鼠中隨機選擇10只作為空白組,其余大鼠均給予高脂高糖飼料+鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射制備DPN大鼠模型,實驗前大鼠空腹血糖均<5.8 mmol/L,平均為(5.30±0.49)mmol/L。造模方法［7]:大鼠高脂高糖飼料持續(xù)喂養(yǎng)8周后,禁食(不禁水)12 h,給予2%STZ(臨用前溶解于0.1 mol/L,pH 4.5的預(yù)冷枸櫞酸緩沖液中)一次性腹腔注射,給藥劑量為35 mg/kg,空白組給予等體積枸櫞酸緩沖液腹腔注射;于造模1周后檢測大鼠空腹血糖,以血糖水平>16.7 mmol /L,且血糖穩(wěn)定3 d為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。將造模成功大鼠按體質(zhì)量隨機分為模型組、α-硫辛酸組、枸杞多糖低劑量組、枸杞多糖高劑量組,每組各10只。α-硫辛酸組給予腹腔注射(100 mg/kg)治療,枸杞多糖低劑量、高劑量組分別給予250、1 000 mg/kg灌胃給藥,空白組及模型組給予等量生理鹽水灌胃處理,每日1次,持續(xù)干預(yù)10周,給藥期間均給予常規(guī)飼料,自由飲食飲水。STZ、α-硫辛酸給藥濃度分別參考以下文獻［6-8]。

1.4 大鼠體質(zhì)量及血糖水平檢測 于治療前和治療后4、6、8、10周分別稱取各組大鼠體質(zhì)量,尾尖取血,血糖儀測定血糖水平。

1.5 大鼠坐骨神經(jīng)組織病理學(xué)觀察 各組大鼠于末次給藥1 h后腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,取大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng),將右側(cè)部分坐骨神經(jīng)組織置于4%多聚甲醛溶液中,固定48 h后,經(jīng)梯度酒精依次脫水,二甲苯透明,石蠟包埋處理后作5 μm厚切片。石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、蘇木素染色、70%鹽酸酒精分化、伊紅染色、梯度酒精脫水及二甲苯透明,用中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)組織病理形態(tài)改變并拍照。

1.6 大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)觀察 取大鼠右側(cè)坐骨切跡至遠(yuǎn)端約0.1 cm的坐骨神經(jīng)組織,切取約1 mm3大小的組織塊,置于4%預(yù)冷戊二醛中前固定2 h,隨后置于1%鋨酸中后固定1 h,丙酮梯度脫水后,浸泡于丙酮與環(huán)氧樹脂包埋劑(1∶1)2 h,再在包埋劑中浸泡2 h,超薄切片機切為50 nm厚切片,用醋酸鈾(30 min)和檸檬酸鉛(15 min)雙重染色,透射電子顯微鏡下觀察各組大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)改變并拍照。

1.7 坐骨神經(jīng)組織蛋白表達檢測 取大鼠左側(cè)部分坐骨神經(jīng)組織,用RAPI裂解液裂解,冰上勻漿,4 ℃ 離心機12 000 r/min 離心20 min后提取坐骨神經(jīng)組織總蛋白。采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度,加入10 μL蛋白樣品,SDS-PAGE濃縮膠電泳分離,冰上轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,TBST洗膜3次后,加入稀釋的一抗(1∶1 000)4 ℃冰箱孵育過夜,TBST室溫洗膜3次,再加入稀釋的二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h,TBST洗膜3次后,加入ECL顯像,凝膠成像分析系統(tǒng)曝光,用Image J軟件分析各組條帶灰度值并計算GRP78、PERK、p-PERK、CHOP及Bax、Bcl-2的表達水平。

1.8 坐骨神經(jīng)組織mRNA表達檢測 取大鼠左側(cè)部分坐骨神經(jīng)組織充分研磨,Trizol法提取坐骨神經(jīng)組織總RNA,按紫外分光光度法測定總RNA的濃度,將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,以cDNA 為模板,按PCR試劑盒操作步驟進行擴增反應(yīng),擴增條件為95℃變性 10 s,60℃退火 30 s,40個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參,將空白組目的mRNA表達設(shè)定為1,用2-△△Ct法計算坐骨神經(jīng)組織GRP78、PERK、CHOP的mRNA相對表達量。各基因的引物序列如表1所示。

表1 各基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量和血糖水平 各組大鼠造模成功后體質(zhì)量均明顯低于空白組,血糖均顯著高于空白組(P<0.05);治療開始4周后,α-硫辛酸組、枸杞多糖高劑量組體質(zhì)量較模型組有明顯增高,血糖水平與模型組相比降低明顯(P<0.05);治療開始8周后,枸杞多糖低劑量組體質(zhì)量較模型組明顯增高,6周后血糖水平較模型組明顯降低(P<0.05,表2～3)。

表2 各組大鼠治療前后體質(zhì)量變化

表3 各組大鼠治療前后血糖水平變化

2.2 大鼠坐骨神經(jīng)病理形態(tài)觀察 HE染色顯示,空白組坐骨神經(jīng)組織神經(jīng)纖維髓鞘均勻分布,軸索完整清晰;模型組坐骨神經(jīng)組織損傷明顯,有髓神經(jīng)纖維分布松散稀疏,間隙增大,髓鞘腫脹,厚度不均,軸索結(jié)構(gòu)不清,可見神經(jīng)纖維空泡化缺損(圖1B);α-硫辛酸和枸杞多糖低劑量、高劑量治療組大鼠坐骨神經(jīng)纖維排列整齊,稍有松散,枸杞多糖高劑量組髓鞘和軸索結(jié)構(gòu)基本恢復(fù),髓鞘腫脹明顯改善(圖1)。

A:空白組;B:模型組;C:α-硫辛酸組;D:枸杞多糖低劑量組;E:枸杞多糖高劑量組;HE,×400。

2.3 大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)觀察 坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)顯示,空白組神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)正常,厚度均勻;模型組髓鞘細(xì)胞腫脹,軸突收縮、變形,雪旺細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,可見空泡變性,無髓神經(jīng)細(xì)胞腫脹,細(xì)胞間隙增大;α-硫辛酸和枸杞多糖低劑量、高劑量治療后,大鼠髓鞘和軸突病理結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善,枸杞多糖高劑量組整體空泡樣變性明顯減少,軸突變性不明顯,雪旺細(xì)胞空泡變性明顯減輕圖2。

A:空白組;B:模型組;C:α-硫辛酸組;D:枸杞多糖低劑量組;E:枸杞多糖高劑量組(×1 000,長箭頭指示:髓鞘,黑三角指示:軸突)。

2.4 大鼠坐骨神經(jīng)PERK-CHOP通路蛋白表達水平 模型組大鼠坐骨神經(jīng)GRP78、p-PERK及CHOP的表達水平較空白組明顯升高(P<0.05);與空白組比較,各組PERK的表達未見明顯差異(P>0.05);枸杞多糖低劑量和高劑量組治療后,大鼠坐骨神經(jīng)GRP78、p-PERK、CHOP的蛋白表達較模型組顯著降低(P<0.05),高劑量組對GRP78、p-PERK、CHOP表達的下調(diào)較低劑量組更為明顯(P<0.05,圖3)。

A:空白組;B:模型組;C:α-硫辛酸組;D:枸杞多糖低劑量組;E:枸杞多糖高劑量組;*:與空白組比較,P<0.05;#:與模型組比較,P<0.05;△:與枸杞多糖低劑量組比較,P<0.05。

2.5 大鼠坐骨神經(jīng)PERK-CHOP通路的mRNA表達水平 模型組大鼠坐骨神經(jīng)GRP78、PERK、CHOP的mRNA表達與空白組相比均明顯升高(P<0.05),枸杞多糖低劑量、高劑量組明顯下調(diào)了GRP78、PERK和CHOP mRNA表達的升高(P<0.05),高劑量組對GRP78、PERK和CHOP mRNA表達的下調(diào)較低劑量組更為明顯(P<0.05,表4)。

表4 各組大鼠坐骨神經(jīng)PERK-CHOP通路mRNA表達

2.6 大鼠坐骨神經(jīng)Bax、Bcl-2的蛋白表達水平 與空白組比較,模型組坐骨神經(jīng)中Bax的表達水平顯著升高,Bcl-2的表達和Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05);枸杞多糖低劑量組、高劑量組與模型組相比,均明顯下調(diào)了Bax的表達,上調(diào)了Bcl-2的表達及Bcl-2/Bax比值(P<0.05),高劑量組對Bax、Bcl-2表達及Bcl-2/Bax比值的改善較低劑量組更為明顯(P<0.05,圖4)。

A:空白組;B:模型組;C:α-硫辛酸組;D:枸杞多糖低劑量組;E:枸杞多糖高劑量組;*:與空白組比較,P<0.05;#:與模型組比較,P<0.05;△:與枸杞多糖低劑量組比較,P<0.05。

3 討論

我國是糖尿病大國,患病人數(shù)約1.14億,已高居全球首位,隨著社會經(jīng)濟的加速增長和生活質(zhì)量的提高,每年新增病例仍不斷攀升,預(yù)計2028年患病總數(shù)將達到1.49億［9]。糖尿病患者機體長期的高糖狀態(tài)可導(dǎo)致多種慢性并發(fā)癥的發(fā)生,其中以DPN最為常見。DPN能夠引起周圍神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛損傷,在糖尿病患者中發(fā)生率接近50%,有10%～20%的患者在確診糖尿病時已合并DPN,是導(dǎo)致患者殘疾和死亡的主要因素［10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于該病主要以控制飲食及血糖水平為主,同時配合抗氧化劑、改善微循環(huán)及神經(jīng)營養(yǎng)藥物,可使其臨床癥狀得到有效改善。但西藥副作用較多,長期用藥所造成的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和藥物耐藥性也成為DPN治療急需解決的問題［11]。

DPN的發(fā)病機制尚未完全闡明,慢性高血糖所引發(fā)的氧化應(yīng)激常被認(rèn)為是促使其發(fā)生的關(guān)鍵因素［12]。近年研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ERS及其介導(dǎo)的凋亡途徑與DPN發(fā)病密切相關(guān)［2]。PERK是ERS啟動的3條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,在ERS凋亡途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3]。高糖環(huán)境下,氧化損傷可進一步引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊和錯誤折疊蛋白的蓄積,使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78與PERK解離進而激活其所介導(dǎo)的促凋亡信號通路,造成周圍神經(jīng)細(xì)胞損傷［13]。

枸杞味甘而性平,是一種藥食兩用的傳統(tǒng)中藥,具有補腎益精、滋肝明目的功效［14]。枸杞多糖是從枸杞中提取的主要藥效成分,現(xiàn)代藥理研究證明［4],其具有降糖、降脂、抑制凋亡、抗氧化等多種藥理活性。在小鼠和大鼠糖尿病模型中,枸杞多糖干預(yù)均具有明確的降糖作用,且作用效果表現(xiàn)出劑量相關(guān)性［15-16]。在糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等多種并發(fā)癥的防治中也體現(xiàn)出較好的效果［17-18]。有研究報道［5],枸杞多糖對DNP大鼠神經(jīng)血管功能具有明顯的改善作用,并可有效降低坐骨神經(jīng)中丙二醇(MDA)含量,提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性,提示其能夠通過抗氧化作用保護大鼠周圍神經(jīng)功能,延緩DPN病變。然而其保護效應(yīng)是否與ERS信號通路相關(guān)尚未明晰。α-硫辛酸是一種很強的抗氧化劑,能夠保護患者的血管內(nèi)皮功能,有助于消除體內(nèi)自由基,防止炎性反應(yīng)的發(fā)生,廣泛應(yīng)用于DNP的臨床治療［19],故本研究選其作為陽性對照藥。

本研究采用高脂高糖飼料結(jié)合STZ腹腔注射建立DPN大鼠模型,觀察不同劑量枸杞多糖對DPN周圍神經(jīng)損傷的治療效果,并通過PERK-CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡通路探討其潛在的作用機制。實驗結(jié)果顯示,枸杞多糖干預(yù)可有效降低DPN大鼠血糖水平,增高大鼠體質(zhì)量。光鏡及透射電鏡下,模型大鼠坐骨神經(jīng)組織出現(xiàn)神經(jīng)纖維脫失,髓鞘腫脹,軸索變性,雪旺細(xì)胞損傷等DPN特征性改變,經(jīng)枸杞多糖治療后,大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)異常明顯改善。提示枸杞多糖能夠減輕DPN周圍神經(jīng)損傷,改善大鼠健康狀況。在分子水平,當(dāng)ERS發(fā)生后,PERK與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)鍵分子蛋白GRP78解離并進行自身磷酸化,磷酸化的PERK可促使其下游基因CHOP活化,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,引發(fā)DPN［20-21]。本研究中,模型組坐骨神經(jīng)GRP78、p-PERK和CHOP的表達水平均明顯上調(diào),枸杞多糖干預(yù)后抑制了其水平的升高,提示高脂高糖飼料和STZ所誘導(dǎo)的DPN大鼠坐骨神經(jīng)存在ERS,枸杞多糖可能通過抑制PERK-CHOP途徑達到防治DPN的作用。各治療組大鼠坐骨神經(jīng)PERK 的mRNA表達較模型組顯著降低,而蛋白水平未見明顯變化,可能與ERS激活后 PERK 蛋白發(fā)生磷酸化相關(guān)。

Bcl-2家族是目前公認(rèn)調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白,其中Bcl-2和Bax分別為最具代表性的抗凋亡和促凋亡蛋白。Bcl-2能夠阻斷氧自由基產(chǎn)生來發(fā)揮抑制凋亡作用,而Bax可通過與Bcl-2結(jié)合,形成二聚體以拮抗其抗凋亡功能的發(fā)揮［22]。CHOP在ERS誘導(dǎo)的凋亡途徑中起到重要作用,其活化能夠下調(diào)Bcl-2,同時促進Bax從細(xì)胞質(zhì)向線粒體易位而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［23]。本研究顯示,與模型組比較,枸杞多糖干預(yù)后大鼠坐骨神經(jīng)Bcl-2的表達及Bcl-2/Bax比值均明顯上調(diào),Bax的表達水平顯著降低。提示枸杞多糖可通過抑制CHOP的表達,改善ERS所致的DPN細(xì)胞凋亡狀態(tài),從而發(fā)揮了對坐骨神經(jīng)損傷的保護作用。

綜上所述,本研究從ERS介導(dǎo)坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡角度探究了枸杞多糖對DPN大鼠的治療作用,在一定程度上揭示了PERK-CHOP信號通路在其發(fā)揮DPN保護效應(yīng)中的作用,為枸杞多糖在DPN的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù),但還不足以說明其保護DPN ERS及細(xì)胞凋亡的全部作用機制。PERK-CHOP通路并不是造成DPN ERS的唯一通路,枸杞多糖干預(yù)是抑制PERK-CHOP通路激活的直接原因,或是通過其他因素或與其他因素協(xié)同作用,間接導(dǎo)致其活性抑制有待進一步明確。