吳逐宇,何志旭

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 組織損傷修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,貴州 遵義 563099)

EVs是細(xì)胞膜衍生而成的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體［1],在20世紀(jì)50年代被首次發(fā)現(xiàn),當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是一種源自血漿中血小板的顆粒［2]。EVs由真核、原核生物的細(xì)胞膜脫落或者由細(xì)胞主動(dòng)分泌產(chǎn)生,是非復(fù)制性的膜封閉結(jié)構(gòu)的異質(zhì)囊泡群體［3-4],幾乎所有(正常和病變)細(xì)胞類型都會(huì)釋放［5-6]。EVs的分泌量受多種因素的影響,如微環(huán)境、葡萄糖和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平等,幾乎在所有體液成分中都可檢測到它的存在,包括血液、尿液、汗液,甚至人的母乳［7]。

細(xì)胞間信息交流在人體的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持以及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞之間的信息交流可以是局部的,也可以是遠(yuǎn)距離的,細(xì)胞的局部交流通過細(xì)胞之間的直接接觸,如相鄰細(xì)胞的間隙連接,使得信號分子在細(xì)胞之間傳遞;遠(yuǎn)距離的細(xì)胞通訊可以由激素等分子通過血液循環(huán)系統(tǒng)將信號分子傳遞到機(jī)體的其他細(xì)胞,EVs也可以介導(dǎo)遠(yuǎn)距離細(xì)胞信號傳導(dǎo),EVs作為載體將各種類型的細(xì)胞信號物質(zhì)(如脂質(zhì)、mRNA、miRNAs、蛋白質(zhì)等效應(yīng)分子)運(yùn)送到受體細(xì)胞［8]。

EVs是一種天然的細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸工具,具有作為單藥或聯(lián)合治療藥物載體的潛力,特別是溶瘤病毒和化療藥物的聯(lián)合給藥［9-10]。EVs具有細(xì)胞靶向特性,它的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)(如四倍體蛋白和整合素)可以引導(dǎo)EVs被特定的細(xì)胞攝取,并保護(hù)EVs包載的治療藥物不受機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)理作用和吞噬細(xì)胞識別,使藥物具有更長的半衰期、減少對健康細(xì)胞和組織的毒副作用［11]。腫瘤來源的EVs具有包載藥物能力強(qiáng)、半衰期長、副作用小、無免疫原性反應(yīng)等特性是一種理想的藥物載體［12-13],經(jīng)過特殊處理的腫瘤源性的EVs,能夠有機(jī)的與常規(guī)化療藥物以及溶瘤病毒等結(jié)合,形成以囊泡為載體的載藥微顆粒［14-15]。靶向性EVs受到了廣泛的關(guān)注,因其具有刺激機(jī)體再生以及可以通過機(jī)體生物屏障運(yùn)載藥物到病變部位的能力,使得其有望成為治療各種疾病的新型策略［16-17]。

1 EVs的分離提取

由于EVs具有體積小、密度低等特性,導(dǎo)致其分離、提純難度較大,目前分離、提純EVs的方法很多,傳統(tǒng)的分離方法大多基于EVs的體積大小和密度。目前常用技術(shù)有超速離心法［18]、流式細(xì)胞術(shù)［19]、密度梯度超離心法［20]、超濾法［21]、尺寸排阻色譜法和PEG沉淀法等。超速離心法被認(rèn)為是EVs分離的金標(biāo)準(zhǔn),可用于從大量樣品中分離EVs,具有試劑用量少、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),但得到的EVs純度不高,并且較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力,對人員和設(shè)備要求很高,常適用于基礎(chǔ)研究,不適用于臨床;適用于臨床檢測的分離檢測方法有:微流控技術(shù)、免疫生物芯片法、納米流式法等［22]。密度梯度超離心法提高了EVs分離效率和純度,但設(shè)備昂貴、時(shí)間長、人工量大,因此其臨床應(yīng)用受到限制。超濾法是一種常用的節(jié)省時(shí)間、節(jié)約花費(fèi)的方法,但分離得到的EVs數(shù)量有限且純度低,超濾法與超速離心法適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合使用,能夠有效地分離EVs的不同亞群,具有廣闊的應(yīng)用前景［23]。

2 EVs的鑒定

根據(jù)EVs的形態(tài)學(xué)特征、體積大小、表面標(biāo)志物等特征,目前對EVs的鑒定主要有以下方法:①基于EVs形態(tài)和粒徑:可以通過透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、電子冷凍顯微鏡、原子力顯微鏡［24]和結(jié)構(gòu)照明超高分辨率熒光顯微鏡［25]檢測EVs的形態(tài)結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)EVs粒徑檢測方法主要包括動(dòng)態(tài)光散射［26]、納米粒子跟蹤分析技術(shù)(NTA)、可調(diào)諧電阻脈沖傳感(TRPS)等［27],新興的EVs粒徑檢測技術(shù)包括表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)(SERS)和納米流式細(xì)胞術(shù)(nFCM)［28],這些技術(shù)通常用于快速全面地測定EVs粒徑和濃度。②基于EVs表面蛋白質(zhì):傳統(tǒng)方法包括Western blotting,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)［29],液相色譜和質(zhì)譜［30]。新興的EVs蛋白分析方法主要基于微流控芯片技術(shù)(包括微流控微核磁共振、納米等離子體外泌體傳感、集成磁電化學(xué)外泌體傳感［31]、熱泳熱感應(yīng)［32]等)。③基于EVs核酸:傳統(tǒng)的EVs核酸檢測技術(shù)主要包括PCR擴(kuò)增和高通量測序,新興的EVs核酸檢測技術(shù)包括液滴數(shù)字PCR、微流控芯片技術(shù)［33]、離子交換納米探測器和局部表面等離子體共振檢測［34]。④基于EVs脂類:主要使用的分析技術(shù)是色譜-質(zhì)譜、核磁共振等,由于核磁共振法受到樣本量以及靈敏度等因素的影響,所以更多應(yīng)用的是色譜-質(zhì)譜技術(shù)。在EVs脂質(zhì)組學(xué)分析中,應(yīng)用最廣泛的液相色譜和質(zhì)譜分析技術(shù)是反相色譜-質(zhì)譜［35]。

3 EVs作為藥物載體應(yīng)用于抗腫瘤研究

越來越多研究證實(shí)可以利用EVs作為藥物的遞送載體,應(yīng)用于疾病治療。EVs作為載體工具具備以下優(yōu)點(diǎn):包載藥物能力好、靶向性強(qiáng)、半衰期長、副作用小、免疫原性低等,并且EVs能夠與抗腫瘤藥物、溶瘤病毒等抗腫瘤物質(zhì)很好的結(jié)合,是一種很有前景的抗腫瘤載體工具［36-38]。

3.1 EVs運(yùn)載抗腫瘤分子 受到EVs介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊的啟示,Silva等［39]利用人巨噬細(xì)胞包裹氧化鐵納米顆粒和不同的治療藥物(包括一種化療藥物(阿霉素),組織纖溶酶原激活劑和2種光敏劑),所得到的雜交細(xì)胞EVs具有磁響應(yīng)性,易于被磁力和MRI檢測到,通過利用囊泡中包載的光敏劑發(fā)現(xiàn)在磁場當(dāng)中癌細(xì)胞對微囊泡的吸收可以被動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié),并且磁性增強(qiáng)了EVs對癌細(xì)胞的靶向殺傷。Tian等［40]發(fā)現(xiàn)靶向配體修飾的外泌體可用于將阿霉素(Dox)遞送至腫瘤組織,具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。研究者使用免疫原性低的小鼠未成熟樹突狀細(xì)胞(imDCs)來源的外泌體,通過將 imDCs 改造為與av整合素特異性iRGD肽結(jié)合的外泌體膜蛋白,從而增強(qiáng)了腫瘤靶向性,imDCs通過電穿孔技術(shù)包載Dox。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):iRGD 外泌體對av整合素陽性乳腺癌細(xì)胞具有高靶向性,可以將Dox高效的遞送至腫瘤組織,抑制腫瘤生長,并且無明顯毒副作用。

已有多篇文章報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)衍生的EVs可以作為藥物載體。Kalimuthu等［41]將MSCs與紫杉醇(PTX) 混合,分離出包載有PTX的EVs ,并評估其對乳腺癌的抗癌作用。結(jié)果證實(shí)不同濃度的紫杉醇(25、50、100 mg/mL)與人骨髓MSCs衍生的EVs混合后,與單純?nèi)斯撬鐴Vs相比,對乳腺癌的殺傷作用更加顯著。Yang等［42]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了腦內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體可以穿過血腦屏障(BBB)運(yùn)載抗腫瘤藥物用于斑馬魚模型的腦腫瘤治療。成像實(shí)驗(yàn)顯示,外泌體攜帶抗腫瘤藥物穿過BBB進(jìn)入大腦,外泌體包載的抗腫瘤藥物顯著降低了異種移植癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和腫瘤生長標(biāo)志物的表達(dá),證明了腦內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體有可能作為腦腫瘤治療中抗腫瘤藥物腦轉(zhuǎn)運(yùn)的載體。Quinn等［43]通過將EVs質(zhì)膜與過表達(dá)生長因子受體2(HER2)的BT-474細(xì)胞系衍生的HER2+EVs融合,成功地使三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞表面表達(dá)足量的HER2。然后使用HER2抗體結(jié)合的PTX載脂質(zhì)體進(jìn)行HER2靶向給藥,結(jié)果表明這種方式的靶向給藥,在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均可以提高的治療效果。

Yong等［44]開發(fā)了一種腫瘤細(xì)胞外泌體仿生多孔硅納米顆粒(PSiNPs)作為靶向藥物載體。腫瘤細(xì)胞通過內(nèi)吞包載DOX的PSiNPs,胞吐產(chǎn)生包裹DOX和PSiNPs的外泌體(DOX@E-PSiNPs)。在體外實(shí)驗(yàn)靜脈給藥后,腫瘤聚集現(xiàn)象增強(qiáng),從血管外滲并滲透到腫瘤深部實(shí)質(zhì)。此外,無論什么細(xì)胞來源的DOX@E-PSiNPs,在癌細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞(CSCs)中都具有顯著的細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性。這些特征使DOX@E-PSiNPs富集于具有CSCs特征的腫瘤細(xì)胞和側(cè)群細(xì)胞,從而導(dǎo)致皮下、原位和轉(zhuǎn)移性腫瘤模型中的抗癌活性和CSCs減少。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),姜黃素具有強(qiáng)大的抗癌和抗炎作用,Osterman等［45],通過光譜研究和熒光顯微鏡觀察到姜黃素處理胰腺癌細(xì)胞后分泌的外泌體中成功包載姜黃素,然后通過Hoffman調(diào)制對比顯微鏡以及AlamarBlue和Trypan blue排除試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞外泌體成功將姜黃素運(yùn)載到胰腺癌細(xì)胞,增強(qiáng)了姜黃素對胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用。

Bai等［46],報(bào)道了一種靶向tLyp-1外泌體將siRNA運(yùn)載到腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞。首先,研究者構(gòu)建了工程tLyp-1-lamp2b質(zhì)粒,在大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增。然后將tLyp-1-lamp2b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞,從轉(zhuǎn)染后的HEK293T細(xì)胞的分泌物中分離出tLyp-1外泌體。通過電穿孔技術(shù)將人工合成的siRNA包載到tLyp-1外泌體中。最后,使用靶向siRNA tLyp-1外泌體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞。結(jié)果表明,tLyp-1外泌體有能夠很好的轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞,靶向siRNA tLyp-1外泌體能夠敲除腫瘤細(xì)胞的靶基因,降低腫瘤干細(xì)胞的干性。Ohno等［47],證明了外泌體可以有效地將miRNA傳遞給表達(dá)表皮生長因子受體(EGFR)的乳腺癌細(xì)胞。通過使供體細(xì)胞表達(dá)能與GE11肽結(jié)合的血小板來源的生長因子受體跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)靶向,RAG2(-/-)小鼠靜脈注射外泌體,將miRNA遞送到表達(dá)EGFR的異種移植乳腺癌組織。

Celastrol(CEL)是一種植物衍生的三萜,許多研究證明CEL在各種癌癥的治療中具有重要意義。Aqil等［48],研究了外泌體包載CEL對2種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的作用,發(fā)現(xiàn)與游離CEL相比,牛乳來源性的外泌體包載CEL的對肺癌細(xì)胞的抗腫瘤療效更強(qiáng)。證明外泌體包載提高了CEL對肺癌中的效果并降低了毒副作用。具有生物活性的皂苷和黃酮類化合物,已經(jīng)被證明對癌細(xì)胞具有殺傷作用,Donoso-Quezada 等［49]研究發(fā)現(xiàn),用乳腺癌、結(jié)腸癌和肝癌細(xì)胞系中分離的外泌體包載皂苷和黃酮類化合物,與游離形式處理以及脂質(zhì)體包載形式處理相比,對腫瘤的殺傷作用更加顯著。

3.2 EVs運(yùn)載溶瘤病毒 Saari等［50]通過實(shí)驗(yàn)證明了,被溶瘤腺病毒(Adv)感染的腫瘤細(xì)胞分泌的EVs(IEVs)中的病毒載量與感染時(shí)間的對應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:IEVs在病毒裂解釋放之前就已經(jīng)分泌出來,它們的結(jié)構(gòu)類似于正常細(xì)胞分泌的EVs;IEVs能夠攜帶病毒可以誘導(dǎo)其他癌細(xì)胞感染殺傷腫瘤細(xì)胞,可應(yīng)用于癌癥治療。Adv在細(xì)胞表面表達(dá)柯薩奇受體和腺病毒受體(CAR)低的腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出差的感染效率,并且Adv中和抗體能減弱病毒對腫瘤細(xì)胞殺傷作用。Zhang等［51],構(gòu)建表達(dá)PD1胞外結(jié)構(gòu)域(Ad5-P)的重組Adv,將其感染細(xì)胞表面表達(dá)VSV-G蛋白的293T細(xì)胞,然后收集感染Ad5-P的293T-VSV-G細(xì)胞,通過密度梯度離心收集包載AD5-P的EVs。結(jié)果顯示:在CAR低表達(dá)的細(xì)胞系中,Adv的感染效率、溶瘤能力顯著增強(qiáng)并且產(chǎn)生了可溶性PD-1。小鼠實(shí)驗(yàn)顯示,包載AD5-P的EVs可以逃避免疫系統(tǒng)的中和作用,可溶性Ad5-p表達(dá)明顯延長。研究結(jié)果證明,該方法可顯著提高肝癌小鼠的抗腫瘤免疫應(yīng)答、延長小鼠生存期。Ran等［52],報(bào)道了腫瘤細(xì)胞來源的微囊泡(T-MPs)可以作為載體,運(yùn)載溶瘤病毒高效地溶解腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),T-MPs包載溶瘤病毒可以有效地靶向殺死腫瘤細(xì)胞。然而,使用T-MPs作為一種新型的溶瘤腺病毒遞送工具,是如何感染和殺死靶腫瘤細(xì)胞的機(jī)制仍然需要進(jìn)一步了解。

Garofalo等［53]研究了EVs作為藥物載體,包載溶瘤病毒和PTX對肺癌的聯(lián)合療法。結(jié)果顯示與EVs單獨(dú)包載Adv、紫杉醇相比,EVs同時(shí)包載兩者顯著提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)率和感染滴度。證明了EVs包載溶瘤病毒和紫杉醇聯(lián)合用藥能夠降低人肺癌動(dòng)物異種移植模型的腫瘤生長。這種聯(lián)合療法,在體內(nèi)和體外肺癌模型均顯示增強(qiáng)了抗腫瘤作用。在另一項(xiàng)研究中,Garofalo等［54]應(yīng)用影像技術(shù)觀察到EVs包載Adv后對小鼠腫瘤模型進(jìn)行靜脈注射給藥,與直接溶瘤病毒腹腔靜脈注射給藥相比,顯著增強(qiáng)了Adv的腫瘤趨向性;同時(shí)也證明了采用EVs包載溶瘤病毒的給藥方式,不會(huì)改變病毒的免疫調(diào)節(jié)特性。除此之外,Garofalo等［55]首次證明了腫瘤來源的EVs具有異種、跨物種的腫瘤趨向性,這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了目前對EVs歸巢特性的看法。研究者觀察到EVs裝載溶瘤病毒后,其表面電荷和尺寸大小不會(huì)發(fā)生顯著改變。給腫瘤小鼠靜脈注射腫瘤細(xì)胞源性的EVs,24 h后在腫瘤部位顯示了明顯的熒光積累,而注射健康組織源性的EVs時(shí),則沒有觀察到這種現(xiàn)象;當(dāng)EVs包載溶瘤病毒時(shí),并沒有改變EVs的腫瘤趨向性。該研究證明了腫瘤源性EVs對任何腫瘤組織都具有相同的趨向性,與腫瘤類型甚至囊泡的物種來源無關(guān)。

4 展望

EVs最初在被發(fā)現(xiàn)由網(wǎng)織紅細(xì)胞釋放分泌,被認(rèn)為是細(xì)胞處理廢物的一種工具。EVs在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著重要作用,調(diào)節(jié)各種疾病的發(fā)生發(fā)展包括癌癥、心臟病、神經(jīng)退行性疾病、精神疾病等。目前,仍處于EVs研究的起步階段,關(guān)于EVs 的產(chǎn)生、分選等過程的分子機(jī)制仍未被闡明,對相關(guān)機(jī)制的研究將更加深入地闡明EVs作為細(xì)胞間信號傳遞途徑在各種疾病發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的重要作用,有利于將EVs應(yīng)用于疾病的診斷、監(jiān)測和治療。

目前許多藥效很好的非靶向藥物在全身輸送時(shí)效率低下且有毒副作用,如何能將有效的治療藥物送到目標(biāo)器官,是一個(gè)亟待解決的問題。藥物給藥系統(tǒng)(DDS)可以高效的藥物運(yùn)送到病變器官、降低藥物的副作用,傳統(tǒng)的DDS如聚乙二醇和脂質(zhì)體在藥物遞送中的作用十分顯著。由于EVs是由細(xì)胞自然產(chǎn)生的,對機(jī)體器官或細(xì)胞有趨向性并且毒副作用低,有潛力作為天然DDS。在過去十幾年的研究中,EVs已經(jīng)成為靶向器官或細(xì)胞選擇性藥物的潛在工具,基于EVs的DDS研究已經(jīng)取得了很好的結(jié)果,因此,EVs介導(dǎo)的器官、細(xì)胞選擇性藥物給藥使EVs成為備受關(guān)注的DDS。

目前,EVs的臨床應(yīng)用還面臨著很多問題,僅有樹突狀細(xì)胞來源的EVs作為腫瘤疫苗的研究已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段,且尚沒有一個(gè)準(zhǔn)確的、通用的EVs鑒定的方式,說明EVs的研究仍具有極大的空間,其在人類疾病治療中的巨大潛能還未被完全發(fā)掘。相信隨著研究的不斷深入,EVs應(yīng)用的范圍將越來越廣,在重大疾病攻克中將取得突破性的進(jìn)展。