江巧麗 趙夢琦 崔夢妍 陸 游 陸穎影

小腸結(jié)節(jié)樣淋巴組織增生（NLH）是一種較罕見的疾病，其特點是小腸黏膜表面的多發(fā)性小結(jié)節(jié)，其診斷主要依據(jù)內(nèi)鏡和活體組織病理檢查，可見明顯的淋巴濾泡增生，淋巴細胞有絲分裂活躍的生發(fā)中心，其主要臨床表現(xiàn)為慢性腹瀉、腹痛、便血、貧血、低蛋白血癥等[1-2]。有研究報道NLH 可能與腸內(nèi)外淋巴瘤有關，腸外淋巴瘤患者的NLH經(jīng)化學治療后可消失[3-5]。NLH 的病因尚不清楚，有假說認為可能是由感染引起，腸道抗原反復刺激引起淋巴濾泡增生，有研究報道在幽門螺桿菌（Hp）、賈第蟲感染患者中發(fā)現(xiàn)NLH[6-8]；另一種觀點是NLH 與免疫缺陷所致淋巴細胞成熟障礙有關，導致漿細胞前體在淋巴濾泡中聚集，有研究報道在人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、常見變異型免疫缺陷病患者中發(fā)現(xiàn)NLH[9-10]。

末端回腸NLH 是指腸鏡下可見末端回腸有多發(fā)性散在的粒狀或圓形結(jié)節(jié)。NLH 患者可無明顯癥狀，也可表現(xiàn)為慢性腹瀉、腹痛和便血等[11]。目前國內(nèi)有關末端回腸NLH 的研究報道較少，本研究回顧性分析了末端回腸NLH 患者的臨床病理特征，并對其腸道菌群的變化進行了初步研究，以期對末端回腸NLH 的診治和發(fā)病機制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選 擇2021 年1 月1 日 至2021 年11 月30 日 在上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院經(jīng)腸鏡及活體組織病理檢查確診為末端回腸NLH 的80 例患者，在其中隨機選擇15 例患者設為NLH 組，另選擇15名末端回腸黏膜正常的同期健康體檢者設為對照組。入選者排除了糖尿病、炎癥性腸?。↖BD）、結(jié)腸切除手術史、結(jié)直腸癌及BMI≥30 kg/m2。比較2 組的一般資料及實驗室指標，并在腸鏡下取末端回腸黏膜組織進行菌群測序和病理組織學分析。所有入選者均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 收集臨床資料 收集入選者的一般資料，包括性別、年齡、BMI、臨床癥狀，并收集實驗室檢查結(jié)果資料，包括血常規(guī)、紅細胞沉降率（ESR）、C 反應蛋白（CRP）、白蛋白、Hp感染檢測[13C 尿素呼氣試驗（UBT）和快速尿素酶試驗（RUT）中有1 項陽性即診斷為感染]。

1.2.2 16S rRNA 腸黏膜菌群測序 所有樣本均由同一位實驗人員進行DNA 提取和PCR 擴增。通過化學裂解法裂解細胞膜及細胞核膜，后 續(xù)DNA 提 取 步 驟 按 照E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 試劑盒（購自美國Omega 公司）的說明書進行。以每個樣本提取的DNA 為模板，擴增16S rRNA 基 因 的V3～V4 區(qū) 域，通 用 細 菌 引 物為F1 和R2（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'和5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。將不同樣品的產(chǎn)物按相同比例進行混合，由上海慕柏生物醫(yī)學技術有限公司使用Illumina Miseq 平臺測序。獲得OTU 豐度矩陣之后，通過分析體現(xiàn)群落豐富度的Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)，以及體現(xiàn)群落均勻度的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)，計算每個樣本群落的多樣性（即α 多樣性）。Chao 指數(shù)或ACE 指數(shù)越大則群落的豐富度越高，Shannon 指數(shù)或Simpson指數(shù)越大則群落的多樣性越高。

1.2.3 H-E 染色和免疫組織化學染色 活體組織標本采用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后進行H-E染色。免疫組織化學染色步驟是將石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸抗原修復緩沖液（pH＝6.0）進行抗原修復，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，BSA 或血清封閉（一抗是山羊來源的用10%正常兔血清封閉，一抗是其他來源的用3% BSA 封閉），一抗孵育，二抗孵育，DAB 顯色，Harris 蘇木素復染細胞核，脫水封片，最后在光學顯微鏡下進行圖像采集分析。一抗Occludin、ZO-1、CD3、CD19和CD20 均購自武漢賽維爾生物科技有限公司，其稀釋比例分別為1︰600、1︰400、1︰1 000、1︰400 和1︰500。

1.2.4 腸黏膜病理和免疫組織化學染色結(jié)果分析 15 例末端回腸NLH 組織和15 例正常末端回腸黏膜組織均行H-E染色和免疫組織化學染色。H-E染色后，光學顯微鏡下觀察小腸組織病理變化，并行Chiu's 腸黏膜損傷評分：腸黏膜正常記0 分；絨毛頂端上皮下間隙增寬伴毛細血管淤血記1 分；上皮下間隙擴張伴上皮層與固有層中度分離記2 分；大片上皮層從絨毛兩側(cè)與固有層分離，部分絨毛頂端破損記3 分；絨毛破損伴固有層毛細血管暴露，有可能觀察到固有層細胞成分增多記4 分；固有層破壞和不完整，有出血和潰瘍形成記5 分。免疫組織化學染色結(jié)果分析：細胞膜呈線條狀棕黃色染色為Occludin 蛋白和ZO-1 蛋白陽性。以全自動圖象分析儀對其所得染色灰度值進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

80 例 末 端 回 腸NLH 患 者 中， 男 性65 例（81.25%），女性15 例（18.75%），年齡14～69 歲，平均年齡為（35.43±13.04）歲，其中年齡≤20歲 有6例（7.50%）， 21～30 歲 有25 例（31.25%），31～40 歲 有24 例（30.00%），41～50 歲 有16例（20.00%），51～60 歲有2 例（2.50%），＞60 歲有7例（8.75%）。從80 例NLH 患者中隨機選取的15例NLH 組患者中，男性11 例，女性4 例，平均年齡為（33.06±7.22）歲；15 名對照者中，男性7 例，女性8 例，平均年齡為（37.87±4.51）歲；2 組的年齡及性別構成差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

2.2 臨床癥狀和實驗室檢查

80 例末端回腸NLH 患者中，主要癥狀為腹瀉者33 例（41.25%），腹痛、腹脹16例（20.00%）；血常規(guī)檢查示白細胞和中性粒細胞比例均無異常，僅1 例患者有輕度貧血（血紅蛋白為110 g/L），其余患者無貧血。

根據(jù)病歷資料，80 例末端回腸NLH 患者中有25 例患者進行了Hp感染的檢測，包括UBT 和（或）RUT，其中15 例（60.00%）患者Hp陽性。另隨機選擇同期在該院行Hp感染檢測并行腸鏡檢查示末端回腸正常的25 例就診者（平均年齡和性別構成與25 例末端回腸NLH 患者相似），其中13 例（52.00%）患者Hp陽性。兩者比較結(jié)果顯示，末端回腸NLH 患者的Hp感染率較末端回腸正常者升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

15 例NLH 組 患 者 和15 名 對 照 者 的BMI、血常規(guī)相關指標、ESR、CRP、白蛋白檢查結(jié)果的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見表1。

表1 2 組的指標比較

2.3 腸道菌群分析

16S rRNA 測序分析結(jié)果顯示，NLH 組的ACE指數(shù)和Chao 指數(shù)均高于對照組（416.52±6.92 比383.16±10.02，399.00±10.42 比353.73±12.17，P均＜0.05）；NLH 組 的Shannon 指 數(shù) 和Simpson 指數(shù)均高于對照組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。結(jié)果表明末端回腸NLH 患者腸黏膜菌群的α 多樣性高于對照組，提示末端回腸NLH 患者可能存在小腸細菌過度生長（SIBO）。見圖1。

圖1 2 組的末端回腸黏膜菌群 α 多樣性比較 A ACE 指數(shù) B Chao 指數(shù)

2.4 組織學分析

末端回腸NLH 的內(nèi)鏡下表現(xiàn)為末端回腸黏膜表面多發(fā)性散在的粒狀或圓形結(jié)節(jié)，直徑為2～5 mm，見圖2。H-E 染色后在光學顯微鏡下可見腸黏膜層淋巴濾泡增生及有絲分裂活躍的生發(fā)中心，見圖3。免疫組織化學染色示增生的淋巴濾泡中以表達CD19、CD20 的B 細胞為主，并有少量表達CD3 的T 細胞，見圖4。H-E 染色后在光學顯微鏡下可見正常末端回腸組織和末端回腸NLH 組織的黏膜絨毛均完整無中斷，腸上皮細胞間緊密連接均完整。應用圖象分析儀對2 組的末端回腸黏膜組織中腸上皮緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達水平進行定量分析，比較結(jié)果顯示2 組的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見圖5。NLH 組和對照組的Chiu's 腸黏膜損傷評分分別為（1.87±0.72）分和（1.53±0.62）分，2 組評分的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 正常末端回腸和末端回腸NLH 的內(nèi)鏡圖像 A 正常末端回腸 B 末端回腸NLH

圖3 正常末端回腸和末端回腸NLH 組織的病理圖像 ×100 H-E 染色 A 正常末端回腸組織 B 末端回腸NLH 組織

圖4 末端回腸NLH 組織的淋巴濾泡中細胞分析 免疫組織化學染色 ×100 A 淋巴濾泡中以CD19 陽性的B 細胞為主 B 淋巴濾泡中以CD20 陽性的B 細胞為主 C 淋巴濾泡中有部分CD3 陽性的T 細胞

圖5 正常末端回腸和末端回腸NLH 的組織學分析 A 正常末端回腸組織 H-E 染色 ×200 B 末端回腸NLH 組織 H-E 染色 ×200 C 正常末端回腸組織中Occludin 表達 免疫組織化學染色 ×100 D 末端回腸NLH 組織中Occludin 表達 免疫組織化學染色 ×100 E 正常末端回腸組織中ZO-1 表達 免疫組織化學染色 ×100 F 末端回腸NLH 組織中ZO-1 表達 免疫組織化學染色 ×100

3 討論

隨著結(jié)腸鏡檢查的普及和技術提高，末端回腸NLH 的診斷率較以往明顯升高。本研究中，在2021 年1 月1 日至2021 年11 月30 日的3 423 例接受腸鏡檢查的患者中發(fā)現(xiàn)80 例末端回腸NLH 患者，NLH 發(fā)病率為2.3%，人群分布以中青年人群占比較高。在臨床表現(xiàn)上，41.25%的患者表現(xiàn)為反復腹瀉，20.00%的患者有腹痛、腹脹癥狀，與既往文獻報道相似[6]。本研究僅發(fā)現(xiàn)1 例末端回腸NLH 患者有輕度貧血，無低蛋白血癥，炎性反應指標未見異常，無其他嚴重伴發(fā)疾病，故認為末端回腸NLH 為良性疾病，一般無嚴重不良預后。需要注意的是，淋巴瘤有可能誤診為NLH，需通過活體組織病理檢查以明確診斷。

本研究應用16S rRNA 技術對末端回腸NLH組織進行腸黏膜菌群測序分析，結(jié)果顯示其α 多樣性明顯高于正常末端回腸黏膜，提示腸道菌群紊亂與末端回腸NLH 的發(fā)生可能存在相關性，可能與SIBO 導致局部炎性反應，刺激淋巴濾泡增生有關。SIBO 是指由多種原因引起的小腸細菌數(shù)量增加和（或）種類構成異常并伴有胃腸道癥狀的臨床綜合征，多由于結(jié)腸菌群因各種原因移位至小腸，導致小腸黏膜發(fā)生炎性反應、通透性增高及絨毛損傷，主要表現(xiàn)為營養(yǎng)吸收不良、腹痛、腹脹、腹瀉和小腸動力異常等[12]。SIBO 與結(jié)直腸癌、腸易激綜合征（IBS）、IBD、非酒精性脂肪性肝病等密切相關[13-16]。本研究發(fā)現(xiàn)末端回腸NLH 患者腸黏膜菌群的α 多樣性增高，可能通過促發(fā)炎性反應刺激B 細胞增生、淋巴濾泡形成，從而導致末端回腸NLH 的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明IBS 患者腸道發(fā)生NLH 的風險增高[17]，腸道菌群紊亂與IBS 有關[18]，調(diào)節(jié)腸道菌群是目前治療IBS 的有效方法之一，對末端回腸NLH 患者補充益生菌可改善癥狀[19]。有研究結(jié)果顯示，NLH 可能與腸內(nèi)外淋巴瘤有關[4-5]，故調(diào)節(jié)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)可能有助于減輕甚至治愈末端回腸NLH，從而降低淋巴瘤的發(fā)生風險。本研究通過H-E 染色及腸上皮緊密連接蛋白的免疫組織化學染色分析發(fā)現(xiàn)，末端回腸NLH 的腸黏膜屏障未見明顯改變，這提示腸道菌群改變并不影響腸黏膜屏障的完整性，不影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，一般不會導致貧血及低蛋白血癥，但腸道菌群的改變是否是導致疾病進展的危險因素尚不明確。

文獻報道，Hp感染與十二指腸NLH 相關，Hp根除后十二指腸NLH 會減輕[6]。已知Hp感染與MALT 淋巴瘤相關，而文獻報道末端回腸NLH與腸內(nèi)外淋巴瘤相關[4-5]。本研究中發(fā)現(xiàn)末端回腸NLH 患者的Hp感染率較正常末端回腸者升高，但差異無統(tǒng)計學意義，這可能是由于樣本量較小。因此，對于在腸鏡下發(fā)現(xiàn)末端回腸NLH 的患者，可進行Hp感染檢測，這可能使患者在預防淋巴瘤發(fā)生中獲益。

末端回腸NLH 患者的臨床表現(xiàn)無特異性，可出現(xiàn)腹瀉、腹痛、腹脹等癥狀，但不會引起小腸吸收不良，這與小腸疾病不同。本研究通過回顧性分析對末端回腸NLH 患者的臨床病理特征進行了探討，并進行了回腸末端黏膜菌群的初步分析，以期加深臨床醫(yī)生對該病的認識，并對末端回腸NLH的診治和發(fā)病機制研究提供參考。臨床上對部分患者補充益生菌、調(diào)節(jié)腸道菌群可使其癥狀緩解，本研究的發(fā)現(xiàn)為臨床治療提供了依據(jù)。本研究存在一定的局限性，如樣本量較小；臨床資料缺乏患者飲食習慣、生活習慣等調(diào)查數(shù)據(jù)，從而未判斷末端回腸病變是否源于上消化道功能狀態(tài)及宿主因素；未能判斷末端回腸細菌增多是否與結(jié)腸菌群來源有關；缺乏對末端回腸NLH 嚴重程度的定量評價；缺乏治療后隨訪數(shù)據(jù)，如Hp根除后末端回腸NLH 的變化等；這些將在后續(xù)研究中繼續(xù)探索。目前末端回腸NLH 的自然病程是自愈還是進展，以及其演變?yōu)榱馨土龅奈ｋU因素尚未明確，需要進一步研究。