陸文洪 莫黎 王真權(quán) 劉麗芳

〔摘要〕 目的 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探究芩柏四物合劑對(duì)壞死性筋膜炎（necrotizing fasciitis， NF）術(shù)后小鼠模型炎癥反應(yīng)及高凝狀態(tài)的影響。方法 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)芩柏四物合劑-NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)的共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析，獲取芩柏四物合劑治療NF的潛在作用機(jī)制。將48只小鼠隨機(jī)分為空白組、芩柏四物合劑組、低分子肝素鈉組、模型組。芩柏四物合劑組以芩柏四物合劑水煎液灌胃，空白組和模型組予等體積的生理鹽水灌胃，低分子肝素鈉組以低分子肝素鈉注射液經(jīng)腹壁皮下注射給藥。通過HE染色觀察肉芽組織病理形態(tài)；利用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)全血中的凝血酶原時(shí)間（prothrombin time， PT）、D二聚體（D-dimer， D-D）、血小板（platelet， PLT）；ELISA檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alfa， TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（iinterleukin-1 beta， IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（iinterleukin-6， IL-6）。結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)芩柏四物合劑干預(yù)NF主要與IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等聯(lián)系密切。體內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，與空白組相比，在灌胃3、7 d 后，模型組小鼠全血中PT、D-D、PLT升高（P＜0.01）；與模型組比較，芩柏四物合劑組、低分子肝素鈉組小鼠全血中PT、D-D、PLT下降（P＜0.01）；芩柏四物合劑組與低分子肝素鈉組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）；芩柏四物合劑組組內(nèi)比較，PT、D-D、PLT含量在第7 d明顯下降，與第3 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，與空白組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，芩柏四物合劑組、低分子肝素鈉組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降（P＜0.01）；芩柏四物合劑組中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯低于低分子肝素鈉組（P＜0.01）；芩柏四物合劑組組內(nèi)比較，TNF-α、IL-1β、IL-6含量在第7天明顯下降，與第3天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 芩柏四物合劑能通過多成分、多通路改善NF小鼠模型炎癥，緩解術(shù)后高凝狀態(tài)，從而有效地改善術(shù)后并發(fā)癥，控制病情。

〔關(guān)鍵詞〕 芩柏四物合劑；壞死性筋膜炎；炎性反應(yīng)；高凝狀態(tài)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；中醫(yī)藥

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.015

Effects of Qinbai Siwu Mixture on inflammatory response and hypercoagulability of necrotizing fasciitis mice after operation based on network pharmacology and experimental veirification

LU Wenhong1， MO Li1， WANG Zhenquan1， LIU Lifang2*

1. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China;

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Qingbai Siwu Mixture （QBSWM） on inflammatory response and hypercoag？鄄

ulability of mice after necrotizing fasciitis （NF） operation by establishing mice model after NF operation. Methods GO and KEGG enrichment analysis were carried out for QBSWM-NF related inflammatory response and hypercoagulable state by network pharmacology to identiry the potential mechanism of QBSWM in treating NF. Forty-eight mice were randomized into blank group， QBSWM group， low molecular weight heparinsodium （LMWHS） group and model group. QBSWM group was given the decoction of QBSWM intragastrically， blank group and model group were given the same volume of normal saline， LMWHS group received subcutaneous injection of LMWHS through abdominal wall. HE staining was used to observe the morphology of granulation tissue， prothrombin time （PT）， D-dimer （D-D） and platelets （PLT） in whole blood were detected by hematology analyzer， and serum tumor necrosis factor-alfa （TNF-α）， interleukin-1 beta （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6） were detected by ELISA to evaluate the effects of QBSWM on inflammatory response and hypercoagulability in mouse after NF operation. Results Model group had significantly higher content of PT， D-D and PLT than blank group at 3， 7 d after intragastric administration （P<0.01）; while QBSWM group and LMWHS group showed significantly lower content of PT， D-D and PLT than model group （P<0.01）; no significant difference was found between QBSWM group and LMWHS group （P>0.05） for the content of PT， D-D and PLT. In addition， compared with blank group， the content of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum of ?model group significantly increased （P<0.01）; compared with model group， the content of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum of QBSWM group and LMWHS group significantly decreased （P<0.01）; the content of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the QBSWM group were significantly lower than those in LMWHS group （P<0.01）. Conclusion QBSWM can significantly reduce the inflammatory indicators of mice after NF operation， alleviate inflammatory response， relieve the postoperative hypercoagulability state， thus effectively improve the postoperative complications and control the disease.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Qinbai Siwu Mixture; necrotizing fasciitis; inflammatory reaction; hypercoagulability; network pharmacology; Chinese medicine

壞死性筋膜炎（necrotizing fasciitis， NF）是一種臨床上少見的，以厭氧菌為主的混合菌感染，引起會(huì)陰部、陰囊、肛周，甚至腹壁皮下軟組織筋膜層的快速壞死性危害病癥。其病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅猛，治療棘手，可在數(shù)小時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥而危及生命[1]。近年來，該病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，常好發(fā)于糖尿病、動(dòng)脈硬化劑免疫力低下者[2]。中西醫(yī)結(jié)合的多學(xué)科救治可使NF患者獲益最大[3]。NF的治療原則為早期及時(shí)的徹底清創(chuàng)引流，而外科手術(shù)侵入常導(dǎo)致凝血平衡的改變，且疾病本身嚴(yán)重的炎性反應(yīng)可引起血管內(nèi)血栓形成。局部炎癥的浸潤(rùn)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，損傷微血管，擾亂纖溶系統(tǒng)的平衡，致微循環(huán)障礙的發(fā)生[4-6]，故臨床中NF常呈現(xiàn)術(shù)后機(jī)體的高凝狀態(tài)。芩柏四物合劑由《醫(yī)宗金鑒》名方“止痛如神湯”“桃紅四物湯”化裁而來，臨床實(shí)踐中運(yùn)用芩柏四物合劑內(nèi)服可以改善NF術(shù)后的炎癥反應(yīng)及高凝狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)建立NF術(shù)后小鼠模型，探討芩柏四物合劑對(duì)NF術(shù)后炎性因子與高凝狀態(tài)影響，以期為中藥復(fù)方制劑對(duì)NF術(shù)后的治療提供理論指導(dǎo)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

近年來，隨著系統(tǒng)生物學(xué)及計(jì)算機(jī)學(xué)科的高速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，其主要用于研究藥物與疾病之間的相互作用關(guān)系，建立“分子-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)模式，這與中醫(yī)學(xué)“整體觀念”的觀念十分契合。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建“芩柏四物合劑-中藥成分-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)生物功能及通路分析，為本課題組后期基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?建立芩柏四物合劑活性成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)

利用TCMSP平臺(tái)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集芩柏四物合劑中中藥的化學(xué)成分，以口服利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為條件篩選相關(guān)成分，將其作為候選成分并將其轉(zhuǎn)化為官方名稱。

1.2 ?建立靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)

以“necrotizing fasciitis”“inflammation”“hypercoagulability”為檢索詞，通過人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards（https：//www.genecards.org/）與人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM（https：//www.omim.org/）進(jìn)行檢索，匯總、分析、去重后，得到NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 ?構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)

將活性成分的作用靶點(diǎn)與NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得共同靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 ?調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因生物功能及通路分析

將候選成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，獲得“芩柏四物合劑-中藥成分-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。采用Rversion 3.5.2軟件ClusterProfile富集分析包對(duì)篩選出來的基因進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析，獲得芩柏四物合劑的潛在作用機(jī)制。

1.5 ?實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 ?動(dòng)物來源 ?健康雌性SPF級(jí)C57BL/6小鼠48只，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，均購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2020-0018。質(zhì)量檢測(cè)單位：湖北省疾病預(yù)防控制中心。飼養(yǎng)條件：12 h明暗交替，室溫21～25 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，噪聲≤50 dB。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（編號(hào)：ZYFY20210627）。

1.5.2 ?藥物制備方法 ?芩柏四物合劑由復(fù)方芩柏顆粒劑（湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥自制劑，藥物組成：黃芩、黃柏、秦艽、桃仁、防風(fēng)、澤瀉、當(dāng)歸、制大黃、玄胡、生地黃、檳榔）12 g，桃紅四物湯（桃仁12 g，紅花9 g，當(dāng)歸12 g，川芎9 g，赤芍9 g，生地黃12 g）組成，然后在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑科將藥物用蒸餾水制成水煎液，混合后濃縮為含有生藥量為1.44 g/mL的湯劑。低分子肝素鈉注射液（0.3 mL∶3200I.U.aXa，批號(hào)：24419）由Alfasigma S.p.A提供。混合菌（革蘭氏陽(yáng)性的溶血性鏈球菌、金黃葡萄球菌），以A組鏈球菌為主（2∶1），由武漢伯韜生物有限公司培養(yǎng)制備。

1.5.3 ?主要試劑 ?正丁醇（貨號(hào)：10005218，批號(hào)：20190104）、無(wú)水乙醇（貨號(hào)：100092683，批號(hào)：20190307）、二甲苯（貨號(hào)：10023418，批號(hào)：20190719）均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HE染色液（北京蘭杰柯科技有限公司，貨號(hào)：BL700B，批號(hào)70080020）；Mus TNF-α ELISA Kit（貨號(hào)：E-EL-M0049c， 批號(hào)：NM0466H46632）、Mus IL-1b ELISA Kit（貨號(hào)：E-EL-M0037c，批號(hào)：NM356KL24586）；Mus D2D ELISA Kit（貨號(hào)：E-EL-M0400c，批號(hào)：NM64FHD34726）、小鼠IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：E-EL-R0016c，批號(hào)：NM564SR16485）均購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.5.4 ?主要儀器 ?脫水機(jī)（型號(hào)：JT-12J）、包埋機(jī)（型號(hào)：JB-L5）、組織攤片機(jī)（型號(hào)：JK-6）由武漢俊杰電子有限公司提供。病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：LEiCARM2016）；微型高速離心機(jī)（美國(guó)Labnet，型號(hào)：C2500-R-230V）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本ASONE，型號(hào)：ICV-450）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo scientific，型號(hào)：Multiskan MK3）。

1.5.5 ?造模方法 ?動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只小鼠分為空白組、模型組、芩柏四物合劑組、低分子肝素鈉組，每組12只。除空白組外，其他3組參照文獻(xiàn)[7]制作NF模型，即將小鼠抓取固定好后，使用1 mL的注射器，針頭輕輕刺入會(huì)陰部周圍皮下，針頭輕輕上挑。推入混合菌 （3×107個(gè)菌落）100 μL，退出針頭后輕壓針眼位置幾秒，防止漏液。驗(yàn)證：造模3 d后，從各組中隨機(jī)抽取一只處死并解剖，切開皮膚、皮下至筋膜層，觀察筋膜層，出現(xiàn)肉眼可見組織缺血壞死，并有惡臭，病理檢查發(fā)現(xiàn)炎性改變時(shí)，即NF造模成功。后行手術(shù)造模，用0.3%戊巴比妥鈉溶液給小鼠腹腔注射麻醉劑，待小鼠完全麻醉后，剔除病變周圍毛發(fā)并消毒，在超凈工作臺(tái)中給小鼠施以手術(shù)：用無(wú)菌手術(shù)剪剪除全層皮膚及皮下組織，暴露筋膜組織，清除壞死組織，制造NF術(shù)后模型。

1.5.6 ?給藥方法 ?造模成功后第2天開始灌胃。芩柏四物合劑組按照0.4 mL/20 g灌胃，每天1次?？瞻捉M和模型組予等體積的生理鹽水灌胃，每天1次。低分子肝素鈉組以低分子肝素鈉注射液，每支原液體積0.3 mL，用生理鹽水稀釋為20 mL，按366.43 IU/（kg·d），經(jīng)腹壁皮下注射給藥。

1.5.7 ?樣本采集及處理 ?造模3 d后，從各組中隨機(jī)抽取一只處死并解剖，切開皮膚、皮下至筋膜層，取創(chuàng)面肉芽組織及周邊皮膚組織行HE染色檢測(cè)。各組小鼠給藥后3、7 d共2個(gè)時(shí)相點(diǎn)分別取血后，并采集創(chuàng)面肉芽組織及周邊皮膚組織，于病變最明顯處剖取標(biāo)本。各組全血用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)PT、D-D、PLT。各組血清用ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6。

1.5.8 ?觀察指標(biāo)

1.5.8.1 ?HE染色 ?制備合格標(biāo)本后，按如下步驟行HE染色。（1）石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ20 min→二甲苯Ⅱ20 min→無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min→無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min→75%乙醇5 min梯度脫蠟→水洗。（2）蘇木素染色：切片入蘇木素染3～5 min，自來水洗凈多余染液，1%鹽酸水溶液分化數(shù)秒，自來水漂洗，然后0.6%～0.7%氨水水溶液返藍(lán)，流水沖洗數(shù)秒。（3）伊紅染色：石蠟切片梯度乙醇（85%乙醇→95%乙醇）脫水，放入伊紅染液中染色5 min。（4）脫水封片：石蠟切片依次放入無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min →無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min→無(wú)水乙醇Ⅲ5 min→正丁醇5 min→二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。（5）結(jié)果判讀：細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為紅色。

1.5.8.2 ?細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組小鼠全血中PT、D-D、PLT含量 ?抽取靜脈血，按照 9∶1 比例加入到 3.8%（或3.2%）的枸櫞酸鈉抗凝管中，輕輕顛倒10次使之充分混勻，不得有凝塊，不得形成泡沫，采樣后應(yīng)盡快分離血漿（60 min內(nèi)進(jìn)行），將標(biāo)本3000 r/min離心（半徑：8.42 cm）10～15 min，使血漿分層，取上層血漿。分別測(cè)定各組小鼠全血中PT、D-D、PLT含量。

1.5.8.3 ?ELISA法測(cè)定各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量 ?實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品蛋白水平。

1.5.9 ?統(tǒng)計(jì)方法 ?采用 SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用參數(shù)檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)，等級(jí)資料使用秩和檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?芩柏四物合劑治療NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)的物質(zhì)基礎(chǔ)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、篩選后共獲得芩柏四物合劑成分935個(gè)，其中黃柏140個(gè)、檳榔8個(gè)、秦艽27個(gè)、防風(fēng)173個(gè)、大黃92個(gè)、生地黃2個(gè)、當(dāng)歸125個(gè)、桃仁66個(gè)、延胡索77個(gè)、黃芩143個(gè)、澤瀉46個(gè)、赤芍29個(gè)、川芎7個(gè)。去重后共獲得247個(gè)不同有效成分。通過TCMSP檢索，并經(jīng)UniProt校對(duì)名稱，去重后獲得相關(guān)靶點(diǎn)236個(gè)。在GeneCard與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中，共獲得NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)相關(guān)靶點(diǎn)59個(gè)，匯總獲得芩柏四物合劑治療NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)關(guān)鍵靶點(diǎn)20個(gè)。關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI分析結(jié)果見圖1。

2.2 ?芩柏四物合劑治療NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、潛在作用機(jī)制

利用R語(yǔ)言對(duì)芩柏四物合劑-NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG分析。GO富集結(jié)果顯示，生物過程（BP）涉及96條，主要富集條目為正向調(diào)控T細(xì)胞增殖（positive regulation of T cell proliferation）、基因表達(dá)正調(diào)控（positive regulation of gene expression）、血管生成正調(diào)控（positive regulation of angiogenesis）等；細(xì)胞組成（CC）涉及8條，主要富集在胞外（extracellular space）、血小板α顆粒管腔（platelet alpha granule lumen）、細(xì)胞表面（cell surface）等；分子功能（MF）涉及16條，主要富集條目為細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、類固醇結(jié)合（steroid binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）等。KEGG富集分析顯示，芩柏四物合劑治療NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)主要涉及46條相關(guān)通路，主要與IL-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）等聯(lián)系密切。詳見圖2。

2.3 ?各組小鼠一般情況觀察

空白組小鼠在治療前后毛色柔潤(rùn)光澤，無(wú)皮膚感染、組織壞死情況，無(wú)體質(zhì)量下降。模型組小鼠在造模成功后出現(xiàn)飲食減少、懶動(dòng)、筋膜層出現(xiàn)肉眼可見組織缺血壞死，并有惡臭；芩柏四物合劑組、低分子肝素鈉組治療后小鼠飲食及飲水量增加，活動(dòng)頻繁，筋膜層肉眼可見組織逐漸鮮活，無(wú)異味。其中模型組一只鼠因感染而死亡。

2.4 ?各組小鼠肉芽組織形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠皮下肉芽組織出現(xiàn)明顯黏膜損傷，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織結(jié)構(gòu)層次排列紊亂，筋膜層病變明顯。芩柏四物合劑組及低分子肝素鈉組肉芽組織病理改變不同程度恢復(fù)，組織結(jié)構(gòu)層次排列較整齊，筋膜層病變減輕，炎性浸潤(rùn)減輕?？瞻捉M組織結(jié)構(gòu)層次清晰，無(wú)炎性浸潤(rùn)。詳見圖3。

2.5 ?各組小鼠全血中PT、D-D、PLT含量比較

在3、7 d不同時(shí)相點(diǎn)對(duì)比中，與空白組相比，模型組小鼠全血中PT、D-D、PLT含量明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，芩柏四物合劑組、低分子肝素鈉組小鼠全血中PT、D-D、PLT含量明顯降低（P<0.01），芩柏四物合劑組與低分子肝素鈉組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）芩柏四物合劑組組內(nèi)比較，PT、D-D、PLT含量在第7天明顯下降，與第3天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.6 ?各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較

在3、7 d不同時(shí)相點(diǎn)對(duì)比中，與空白組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，芩柏四物合劑組、低分子肝素鈉組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低（P<0.01）。芩柏四物合劑組中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯低于低分子肝素鈉組（P<0.01）。芩柏四物合劑組組內(nèi)比較，TNF-α、IL-1β、IL-6含量在第7天明顯下降，與第3天比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

3 討論

NF歸屬于中醫(yī)學(xué)“肛疽”“壞疽”“爛疔”等范疇。早在《諸病源候論·疔瘡病諸候》中就有記載：“亦有肉突起，如魚眼之狀，赤黑，慘痛徹骨，久結(jié)皆變至爛成瘡，瘡下深孔如大針穿之狀?！盵8]中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病多正氣內(nèi)虛、外傷染毒、火毒熾盛，以致毒聚肌膚，氣血凝滯，熱盛肉腐，氣分傳變營(yíng)血，火毒內(nèi)陷，以致亡陽(yáng)劫陰。后世醫(yī)家主張內(nèi)外合治，外以切開引流，中藥清洗創(chuàng)面，并用中藥散劑煨膿長(zhǎng)肉，祛腐生??；中藥內(nèi)服早期介入對(duì)控制病情，預(yù)防并發(fā)癥及縮短病程具有確切的臨床療效[9]。

NF作為一種病死率較高的臨床急危重癥，具有起病急、發(fā)展迅速、破壞力強(qiáng)、病死率高等特點(diǎn)。若發(fā)病未及時(shí)予以有效的救治，感染極易發(fā)展到會(huì)陰部、腹部，危及全身，常死于膿毒血癥、感染性休克和多器官功能衰竭[10-11]。本病病理特點(diǎn)為皮下組織及筋膜的廣泛壞死，其病理改變是皮下組織水腫和壞死，包括鄰近的筋膜，筋膜內(nèi)支配皮膚的血管內(nèi)有血栓形成，皮下血管閉塞，導(dǎo)致覆蓋區(qū)域缺血和化膿性感染，鏡下為明顯的白細(xì)胞浸潤(rùn)，皮下小動(dòng)脈和小靜脈常完全閉塞[12]。此外有研究表明，多種混合菌在人體內(nèi)產(chǎn)生的膠原酶和肝素酶，誘導(dǎo)血小板的聚集和補(bǔ)體沉積，進(jìn)而導(dǎo)致皮下組織及筋膜的微血管血栓形成，阻礙血運(yùn)和淋巴回流，加速了組織的缺血和壞死[13]。同時(shí)，感染過程中產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，介導(dǎo)全身瀑布樣的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致多系統(tǒng)器官功能衰竭而死亡[14]。故NF本身呈現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥與高凝狀態(tài)，臨床中一旦確診為NF，必須進(jìn)行及時(shí)的手術(shù)清創(chuàng)和全身治療[15-16]。在感染的急性期，除及時(shí)切開引流外，常需運(yùn)用抗凝劑與足量的廣譜抗生素。然而，手術(shù)創(chuàng)傷所致術(shù)后高凝狀態(tài)已被研究證實(shí)[17-19]，因手術(shù)侵入導(dǎo)致的凝血平衡的改變，由于凝血機(jī)制的激活，對(duì)圍手術(shù)期安全性構(gòu)成嚴(yán)重威脅，且NF本身的高炎性反應(yīng)可引起血管內(nèi)血栓形成，阻塞血運(yùn)，致大面積皮膚及皮下淺深筋膜壞死[20]，炎性反應(yīng)與凝血系統(tǒng)之間有著密切的聯(lián)系。炎癥反應(yīng)時(shí)，機(jī)體的炎癥細(xì)胞受到過度的刺激，釋放出促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可以導(dǎo)致凝血機(jī)制異常，并抑制纖維蛋白溶解，引起纖溶亢進(jìn)，致微循環(huán)障礙的發(fā)生[21-22]。加之術(shù)后患者傷口疼痛、行動(dòng)不便，臥床時(shí)間長(zhǎng)，更易致高凝狀態(tài)。術(shù)后高凝狀態(tài)不但影響傷口愈合，還可引起靜脈血栓形成致下肢深靜脈血栓栓塞或肺栓塞，而這也是導(dǎo)致NF術(shù)后患者死亡的重要因素之一。

本研究中，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，在GeneCard與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中，共獲得NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)相關(guān)靶點(diǎn)59個(gè)，匯總獲得芩柏四物合劑治療NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)關(guān)鍵靶點(diǎn)20個(gè)。此外，利用R語(yǔ)言對(duì)芩柏四物合劑-NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG分析顯示：生物過程主要富集條目為正向調(diào)控T細(xì)胞增殖、基因表達(dá)正調(diào)控、血管生成正調(diào)控、血小板α顆粒管腔、細(xì)胞因子活性等。主要涉及46條相關(guān)通路，主要與IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等聯(lián)系密切。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過程中，在灌胃3、7 d 時(shí)，與空白組相比，模型組小鼠全血中PT、D-D、PLT含量明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，芩柏四物合劑組、低分子肝素鈉組小鼠血清中小鼠全血中PT、D-D、PLT含量明顯降低（P<0.01），芩柏四物合劑組與低分子肝素鈉組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。說明芩柏四物合劑能有效地改善NF術(shù)后高凝狀態(tài)，且與低分子肝素鈉組治療效果相當(dāng)。其作用機(jī)制可能通過介導(dǎo)NF相關(guān)炎性反應(yīng)及高凝狀態(tài)關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)而發(fā)揮作用。此外，與空白組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，芩柏四物合劑組、低分子肝素鈉組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低（P<0.01）。表明模型組中呈現(xiàn)一致的高炎癥反應(yīng)狀態(tài)，芩柏四物合劑能有效降低NF術(shù)后小鼠的相關(guān)炎癥指標(biāo)，對(duì)延緩和阻擊NF病情的進(jìn)展惡化具有重要意義。其作用機(jī)制可能通過抑制TNF等炎癥相關(guān)信號(hào)通路的活化，減少炎癥因子的生成而發(fā)揮抗炎作用。

芩柏四物合劑由復(fù)方芩柏顆粒合桃紅四物湯加減而成，復(fù)方芩柏顆粒劑是由《醫(yī)宗金鑒》名方“止痛如神湯”化裁并改變劑型而成。藥物組成為黃芩、黃柏、熟大黃、延胡索、澤瀉、生地黃、防風(fēng)等11味中藥。諸藥合用，共奏清熱燥濕、行氣活血、止血、鎮(zhèn)痛之功。復(fù)方芩柏顆粒治療NF有顯著的抗炎、滅菌、止痛促愈的療效[23]。桃紅四物湯出自《醫(yī)宗金鑒》，由當(dāng)歸、赤芍、生地黃、川芎、桃仁、紅花組成，桃紅四物湯在四物湯補(bǔ)血養(yǎng)血的基礎(chǔ)上，加入活血祛瘀的桃仁及活血通經(jīng)的紅花，使此方養(yǎng)血而不滯血，活血而不破血，補(bǔ)中有行，破中有收，諸藥合用，達(dá)到活血行氣、扶正祛邪之功效。NF術(shù)后多兼有氣滯血瘀之癥狀，這與NF術(shù)后的高凝狀態(tài)和高炎癥反應(yīng)十分契合。故臨床中和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能收到一致的治療效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，芩柏四物合劑對(duì)NF小鼠的高凝狀態(tài)及炎癥指標(biāo)均有明顯改善作用，早期以中藥內(nèi)服介入NF，能有效地控制病情，改善術(shù)后并發(fā)癥。目前，國(guó)內(nèi)缺乏NF的實(shí)驗(yàn)研究，且術(shù)后高凝狀態(tài)及其機(jī)制的研究極少，故探討NF術(shù)后高凝狀態(tài)的機(jī)制有著重要意義，進(jìn)一步為臨床指導(dǎo)用藥奠定研究基礎(chǔ)。

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〔收稿日期〕2022-08-14

〔基金項(xiàng)目〕湖南省衛(wèi)生健康委科研課題（202104010993）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)科研課題一般項(xiàng)目（2020XJJJ057，2020XJJJ060）；湖南省普通高等學(xué)校教學(xué)改革研究項(xiàng)目（HNJG-2021-0586）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)改革立項(xiàng)項(xiàng)目（2020-JG042）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校院聯(lián)合基金教學(xué)改革研究重點(diǎn)項(xiàng)目（2022-LHJG003）。

〔第一作者〕陸文洪，男，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)外科疾病防治。

〔通信作者〕*劉麗芳，女，博士，主任醫(yī)師，E-mail：Liulff@126.com。