張雙 李驍群 李江林 趙瑞珍 唐啟盛

〔摘要〕 目的 運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討頤腦解郁方對(duì)抑郁癥促炎細(xì)胞因子的調(diào)控作用，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。方法 首先通過(guò)TCMSP、HERB數(shù)據(jù)庫(kù)查找頤腦解郁方組成藥物的主要活性成分，使用SwissTargetPrediction平臺(tái)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)；利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選抑郁癥、炎癥相關(guān)疾病基因；藥物與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)為頤腦解郁方的潛在調(diào)控靶點(diǎn)，在Cytoscape 3.8.0軟件中構(gòu)建藥物-活性成分-潛在調(diào)控靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用CytoNCA插件計(jì)算度值，篩選重要的活性成分；利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建潛在調(diào)控靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)，得到核心蛋白，之后利用R語(yǔ)言對(duì)潛在調(diào)控靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG富集分析，繪制條形圖和點(diǎn)圖。最終選取較重要的交集核心蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)雄性大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、頤腦解郁方組（中藥組）和鹽酸氟西汀組（西藥組），采用慢性不可預(yù)知溫和刺激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）聯(lián)合孤養(yǎng)法復(fù)制抑郁模型，使用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的抑郁樣行為，最后采集各組大鼠的血清進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果 共篩選出頤腦解郁方有效成分272種，作用靶點(diǎn)共計(jì)1167個(gè)，抑郁癥、炎癥相關(guān)靶點(diǎn)93個(gè)；頤腦解郁方的潛在調(diào)控靶點(diǎn)35個(gè)，較重要的活性成分為槲皮素和咖啡酸，核心蛋白為白介素-6（interleukin 6， IL-6）、干擾素（interferon， TNF）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）、白介素-1β（interleukin 1β， IL-1β）等，GO富集和KEGG富集分析結(jié)果顯示頤腦解郁方具有多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，其中核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）通路較為重要；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)頤腦解郁方能夠降低抑郁大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平（P＜0.05）。結(jié)論 頤腦解郁方可能通過(guò)降低血清中促炎細(xì)胞因子水平發(fā)揮抗抑郁的作用，是多種成分、多種通路和靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果。

〔關(guān)鍵詞〕 頤腦解郁方；抑郁癥；促炎細(xì)胞因子；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;大鼠

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.014

Effects of Yinao Jieyu Formula on pro-inflammatory factors for depression based on

network pharmacology and experimental verification

ZHANG Shuang1，2， LI Xiaoqun1，2， LI Jianglin1，2， ZHAO Ruizhen2*， TANG Qisheng2

1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2. Preventive and Treatment Center， The Third

Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the effects of Yinao Jieyu Formula （YNJYF） on pro-inflammatory factors for depression based on network pharmacology and experimental verification. Methods The ingredients of YNJYF were obtained from TCMSP and HERB databases， and the targets were detected by SwissTargetPrediction. The genes related to depression and inflammation were obtained from GeneCards database. Intersection of ingredients and disease are the potential targets of YNJYF. The network of herbs， ingredients， potential targets and diseases was built by Cytoscape 3.8.0 software. And the degree was calculated by CytoNCA to find the important active ingredients. Then the protein-protein interaction （PPI） network about the potential targets through STRING database was constructed to obtain the core proteins， and the potential targets were analyzed by GO and KEGG with the R language， then the barplot and dotplot were drawn. Finally， the more important core proteins were selected to verify by experiment. SPF male rats were randomly divided into normal group， model group， YNJYF group （Chinese medicine group） and fluoxetine group （western medicine group）. Chronic unpredictable mild stress （CUMS） and solitary rearing were used to replicate the depression model， and the depressive-like behavior was evaluated by open field experiment. Finally， the serum of each group was collected for test. Results A total of 272 active ingredients and 1167 targets of YNJYF were obtained. There were 93 targets related to depression and inflammation， and 35 potential targets of YNJYF. The important active ingredients were quercetin and caffeic acid. The core proteins were interleukin-6 （IL-6）， interferon （TNF）， Toll-like receptors 4 （TLR4）， interleukin-1β （IL-1β）， etc. GO and KEGG enrichment analysis showed that YNJYF had multiple targets and multiple pathways， and nuclear factor kappa-B （NF-κB） pathway was more important. Animal experiment showed that YNJYF could reduce the levels of IL-6， TNF-α and IL-1β in depressed rats. Conclusion YNJYF may play an antidepressant role by decreasing the level of pro-inflammatory cytokines in serum， which results from the joint action of multiple components， multiple targets and multiple pathways.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yinao Jieyu Formula; depression; pro-inflammatory cytokine; network pharmacology; experimental verification; rats

隨著社會(huì)節(jié)奏的加快及競(jìng)爭(zhēng)的加劇，抑郁癥成為現(xiàn)今社會(huì)最主要的情感障礙疾病[1]。抑郁癥以持續(xù)的情緒低落、快感缺失為主要表現(xiàn)，伴有不同程度的認(rèn)知和行為改變，同時(shí)可伴有失眠、體質(zhì)量改變等軀體癥狀以及幻覺(jué)、妄想等精神病性癥狀，甚至出現(xiàn)自殺行為，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。目前，抑郁癥發(fā)病機(jī)制仍不明確，近年來(lái)，炎癥假說(shuō)受到諸多關(guān)注且得到越來(lái)越多實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持[2-3]。炎癥因子具有豐富的生物學(xué)特性，其可通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝、下丘腦-垂體-腎上腺軸等多種途徑參與抑郁癥的生理病理過(guò)程[4]。臨床研究表明，抑郁癥患者外周血中炎癥因子白介素-1β（interleukin 1β， IL-1β）、干擾素-α（interferon α， TNF-α）和白介素-6（interleukin 6， IL-6）水平明顯高于正常對(duì)照組，而在給予抗抑郁治療之后這些炎癥因子的表達(dá)水平得到抑制[5]。因此，炎癥細(xì)胞因子可能成為抑郁癥治療的新靶點(diǎn)。

頤腦解郁方是唐啟盛教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，對(duì)治療抑郁癥具有良好的臨床療效，且安全性好[6-7]。前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明頤腦解郁方可改善慢性不可預(yù)知溫和刺激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）模型大鼠抑郁樣表現(xiàn)[8-9]，可調(diào)控模型大鼠的神經(jīng)遞質(zhì)及信號(hào)因子的表達(dá)[8-10]。為進(jìn)一步驗(yàn)證其與免疫反應(yīng)間的關(guān)聯(lián)，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法觀察頤腦解郁方對(duì)抑郁癥炎癥細(xì)胞因子的影響，豐富中醫(yī)藥抗抑郁治療的科學(xué)理論和證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 ?頤腦解郁方藥物活性成分和作用靶點(diǎn)的獲取

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)[11]（ TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和本草組鑒平臺(tái)[12]（HERB， http：//drug.ac.cn/）分別搜索“刺五加”“五味子”“郁金”“梔子”化學(xué)成分。TCMSP篩選條件設(shè)置為生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18；HERB數(shù)據(jù)庫(kù)中藥物成分根據(jù)Lipinsk原則[13]在SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行篩選。將上述獲得的中藥成分通過(guò)SwissTargetPrediction平臺(tái)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)并導(dǎo)出。

1.2 ?抑郁癥和炎癥相關(guān)靶點(diǎn)的收集

以“depression”“depressive disorder”“major depressive disorder”和“inflammation”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）檢索相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)出并取交集。

1.3 ?藥物活性成分與疾病共同靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用R語(yǔ)言中的VennDiagram數(shù)據(jù)包對(duì)頤腦解郁方藥物活性成分靶點(diǎn)和抑郁癥、炎癥相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，獲得共同靶點(diǎn)，共同靶點(diǎn)認(rèn)為是頤腦解郁方對(duì)抑郁癥促炎細(xì)胞因子的潛在調(diào)控靶點(diǎn)。

1.4 ?構(gòu)建藥物-活性成分-潛在調(diào)控靶點(diǎn)-疾病的數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape 3.8.0中構(gòu)建頤腦解郁方藥物-活性成分-潛在調(diào)控靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，使用CytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)Degree參數(shù)獲得頤腦解郁方在調(diào)控抑郁癥促炎細(xì)胞因子中發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.5 ?蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建頤腦解郁方調(diào)控抑郁癥促炎細(xì)胞因子水平的潛在調(diào)控靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并篩選出核心蛋白。將潛在調(diào)控靶點(diǎn)錄入數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“homo sapiens”，最低閾值設(shè)置為中等置信度0.4，其余參數(shù)不變，隱藏沒(méi)有相互聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，獲得蛋白互作關(guān)系，導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)，保存TSV格式文件，使用R軟件篩選核心蛋白。

1.6 ?潛在調(diào)控靶點(diǎn)的GO和KEGG通路富集分析

使用R語(yǔ)言的clusterProfiler及Bioconductor包[14]提供的GO通路和KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。以P＜0.05為條件進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，并將富集結(jié)果可視化。

1.7 ?實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ?SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（200±10） g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證編號(hào)：SYXK（京）2020-0036。保持室內(nèi)溫度、濕度固定，7：00～19：00光照（晝夜顛倒應(yīng)激方法時(shí)段除外）。本研究由北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)，研究?jī)?nèi)容和過(guò)程涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均符合國(guó)家對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有關(guān)要求，倫理編號(hào)為BUCM-4-2021091308-3166。

1.7.2 ?材料 ?（1）藥物：頤腦解郁方（藥物組成為刺五加20 g、郁金10 g、梔子10 g、五味子10 g，顆粒劑由北京康仁堂制藥有限公司提供，批號(hào)：20033601）；鹽酸氟西汀膠囊（規(guī)格：20 mg/粒，禮來(lái)蘇州制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20170022）。

（2）試劑：放免試劑盒IL-1β（北京華英生物有限公司，批號(hào)：HY-100237）；TNF-α（北京華英生物有限公司，批號(hào)：HY-10116）；IL-6（北京華英生物有限公司，批號(hào)：HY-10105）。

（3）儀器：敞箱（自制，80 cm×80 cm×40 cm），夾尾器（自制），游泳水箱（自制，45 cm×33 cm×27 cm），恒溫加熱器（自制），空氣振蕩浴（哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠，型號(hào)：HZQ-C），秒表計(jì)數(shù)器（上海晨光文具股份有限公司，型號(hào)：ARC925L8），SONY數(shù)碼攝錄一體機(jī)（日本索尼公司，型號(hào)：HDR-SR10E），單人單面潔凈工作臺(tái)（蘇潔凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)：SW-CJ-ID）、電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，型號(hào)：ME204），低溫離心機(jī)（日本Beckman，型號(hào)：Avanti JXN-30），γ-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀（中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司，型號(hào)：GC-911）。

1.7.3 ?方法 ?（1）分組：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、模型組、頤腦解郁方組（中藥組）、鹽酸氟西汀組（西藥組），共4組。

（2）造模：采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)法制備抑郁大鼠模型[9]。CUMS方法：21 d內(nèi)隨機(jī)選用以下7種應(yīng)激方法：夾尾1 min、45 ℃熱環(huán)境5 min、晝夜顛倒、禁水24 h、禁食24 h、震蕩環(huán)境30 min、4 ℃冰水游泳5 min，每種方法使用3次，保證每周1次、隨機(jī)排序。孤養(yǎng)法：即大鼠單籠飼養(yǎng)。

（3）給藥方法：根據(jù)參考文獻(xiàn)于應(yīng)激結(jié)束后開(kāi)始干預(yù)，模型組、中藥組、西藥組開(kāi)始分別灌胃雙蒸水、頤腦解郁方、鹽酸氟西汀[9-10]。頤腦解郁方顆粒和鹽酸氟西汀在灌胃前使用雙蒸水調(diào)配，濃度和灌胃劑量與課題組前期一致[10]，頤腦解郁方藥物濃度為0.62 g 生藥/mL，鹽酸氟西汀濃度為0.23 g/L。根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整灌胃量，灌胃量均為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃28 d。正常組不予任何處理，正常自由飲水和進(jìn)食。

（4）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：使用自制黑色敞箱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，敞箱底面用白線劃分為25個(gè)16 cm×16 cm方格。將大鼠置于箱子中央方格中，觀察大鼠3 min的活動(dòng)情況，記錄大鼠的水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分。水平運(yùn)動(dòng)得分計(jì)分規(guī)則：以大鼠穿越方格數(shù)（至少3爪進(jìn)入方格）為水平運(yùn)動(dòng)得分，每格得1分；垂直運(yùn)動(dòng)得分計(jì)分規(guī)則：以大鼠前兩肢直立次數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)得分，每直立1次得1分。每只測(cè)定結(jié)束后清理尿便并使用酒精消毒擦拭箱子內(nèi)部，避免氣味殘留。

造模前、造模后和灌胃結(jié)束后，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，符合條件者進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)過(guò)程。剔除死亡、衰弱、造模失敗以及合并其他系統(tǒng)病變的大鼠后， 最終每組納入6只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

1.7.4 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，對(duì)所得數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，以“ｘ±s”表示。組間比較先進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，符合條件者采用單因素方差分析檢驗(yàn)（one-way Anova），組間比較采用LSD方法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?頤腦解郁方活性成分和作用靶點(diǎn)

在TCMSP和HERB數(shù)據(jù)庫(kù)查找有效成分，通過(guò)篩選共獲得刺五加有效活性成分9個(gè)，五味子有效活性成分59個(gè)，郁金有效活性成分148個(gè)，梔子有效活性成分72個(gè)，去除重復(fù)的成分，得到頤腦解郁方有效活性成分共計(jì)272個(gè)。使用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)查找以上活性成分的靶點(diǎn)，篩選Probability＞0.05的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)基因，共計(jì)1167個(gè)。

2.2 ?頤腦解郁方對(duì)抑郁癥促炎細(xì)胞因子的潛在調(diào)控靶點(diǎn)

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集抑郁癥和炎癥相關(guān)基因，分別得到12 978個(gè)、11 109個(gè)靶點(diǎn)，納入Relevance score＞10的靶點(diǎn)，分別得到1552個(gè)、95個(gè)。使用R語(yǔ)言的VennDiagram數(shù)據(jù)包中Venny函數(shù)繪制藥物有效活性成分的作用靶點(diǎn)和抑郁癥靶點(diǎn)、炎癥靶點(diǎn)的交集，獲得頤腦解郁方對(duì)抑郁癥促炎細(xì)胞因子的潛在調(diào)控靶點(diǎn)35個(gè)。詳見(jiàn)圖1。

2.3 ?藥物-活性成分-潛在調(diào)控靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

將郁金、梔子、刺五加、五味子的有效活性成分及潛在調(diào)控靶點(diǎn)導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.8.0中，構(gòu)建頤腦解郁方藥物-活性成分-潛在調(diào)控靶點(diǎn)-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。通過(guò)Cytoscape 3.8.0軟件中的CytoNCA插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征，根據(jù)Degree進(jìn)行排序，槲皮素（quercetin）和咖啡酸（caffeic acid）是Degree最高的藥物活性成分（Degree均為15，圖2紅色所示），其中槲皮素是刺五加、郁金、梔子3味藥的共有成分，咖啡酸是郁金、梔子的共同成分。

2.4 ?PPI網(wǎng)絡(luò)

在STRING網(wǎng)站的檢索框“Multiple proteins”輸入35個(gè)潛在調(diào)控靶點(diǎn)，物種選擇人類（Homo sapiens），得到頤腦解郁方對(duì)抑郁癥炎癥機(jī)制的潛在調(diào)控靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3），該網(wǎng)絡(luò)共計(jì)35個(gè)節(jié)點(diǎn)，369條邊。

通過(guò)R語(yǔ)言分析獲取PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)度最高的前20個(gè)核心蛋白，繪制條形圖（圖4），主要的核心蛋白有IL-6、TNF、TLR4、IL-1β等。

2.5 ?潛在調(diào)控靶點(diǎn)的富集分析

將35個(gè)潛在調(diào)控靶點(diǎn)基因?qū)隦/bioconductor進(jìn)行GO、KEGG富集分析。GO富集分析得到分子功能（molecular function， MF）條目18個(gè)，生物學(xué)過(guò)程（biological process， BP）條目769個(gè)，細(xì)胞組分（cellular component， CC）條目9個(gè)，選取結(jié)果的top20進(jìn)行可視化分析，如圖5所示。其中MF主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、信號(hào)受體激活劑活性、抗氧化活性等；BP包括對(duì)各種刺激的反應(yīng)（脂多糖、細(xì)菌來(lái)源分子）、對(duì)細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子生成的積極調(diào)節(jié)等；CC主要涉及質(zhì)膜外側(cè)、分泌顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、囊泡腔等。

KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示P＜0.05的結(jié)果共有182條，通路主要集中在核因子κB（nuclearfactorkappa-B， NF-κB）信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、感染、白介素17（interleukin-17， IL-17）信號(hào)通路等，如圖6所示。

2.6 ?實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.6.1 ?各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 ?造模前各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模結(jié)束后，與正常組比較，各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分均降低（P＜0.01，P＜0.05）。干預(yù)結(jié)束后，與模型組比較，中藥組和西藥組水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直運(yùn)動(dòng)得分均上升（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表1，圖7為各組大鼠曠場(chǎng)軌跡圖。

2.6.2 ?各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平的比較 ?與正常組相比，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組和西藥組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均下降（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

3 討論

抑郁癥屬于中醫(yī)學(xué)“郁證”范疇，《素問(wèn)·舉痛論》曰：“百病生于氣也?！币钟舭Y也不例外，其基本病機(jī)為情志不舒、氣機(jī)郁滯[15]，加之現(xiàn)代社會(huì)快節(jié)奏和高壓力，造成精血津液等物質(zhì)的消耗，如《靈樞·本神》記載：“怵惕思慮者，則傷神，神傷則恐懼流淫而不止……”頤腦解郁方以補(bǔ)腎調(diào)氣立意，其內(nèi)涵為填腎精、益腎氣、溫腎陽(yáng)、滋腎陰和調(diào)達(dá)氣機(jī)。腦為髓海，腎主骨生髓，神志的正常依賴腎精的充養(yǎng)以及氣的升降出入，正如《素問(wèn)·六微旨大論》中所說(shuō)：“出入廢，則神機(jī)化滅；升降息，則氣立孤危。故非出入，則無(wú)以生長(zhǎng)壯老已；非升降，則無(wú)以生長(zhǎng)化收藏。”全方重用刺五加為君藥，益腎填精、安神益智；五味子滋腎斂肺、寧心安神；郁金入肝經(jīng)血分，可活血止痛、行氣解郁；梔子瀉火除煩，可解郁除煩；全方配伍應(yīng)用，標(biāo)本兼治，具有益腎降濁、理氣開(kāi)郁、頤腦醒神的作用[3，16]。

研究表明，炎癥是抑郁癥等壓力相關(guān)性疾病的共同發(fā)病機(jī)制[17]，其發(fā)病和進(jìn)展與免疫激活、促炎細(xì)胞因子分泌有關(guān)。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合CUMS抑郁模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討頤腦解郁方對(duì)抑郁癥促炎細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用。

藥物-活性成分-潛在調(diào)控靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)表明頤腦解郁方中有效活性成分較多，而且某些活性成分會(huì)對(duì)多個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)產(chǎn)生影響，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，其中槲皮素和咖啡酸是頤腦解郁方組成藥物中較為重要的活性物質(zhì)。槲皮素是一種黃酮類化合物，存在于多種食物和中藥中，具有抗炎和抗氧化的作用[18]，研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能通過(guò)抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β的激活發(fā)揮抗抑郁作用[19]?？Х人崾且环N存在于多種植物、藥材中的天然酚類物質(zhì)，具有天然抗氧化、抗炎的作用，有研究顯示咖啡酸可改善CUMS模型大鼠的抑郁樣行為[20]，顯著降低抑郁大鼠海馬中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量[21]。

本研究結(jié)果顯示，頤腦解郁方對(duì)抑郁癥促炎細(xì)胞因子的潛在調(diào)控靶點(diǎn)共計(jì)35個(gè)，核心蛋白為IL-6、TNF、TLR4、IL-1β等。研究發(fā)現(xiàn)在抑郁癥患者中IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高，而且其水平與抑郁癥的發(fā)展密切相關(guān)[5]。TLR4是一種模式識(shí)別受體，參與NF-κB信號(hào)通路激活，導(dǎo)致其下游IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)升高[22]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α?xí)黾友X屏障的通透性[23]，血腦屏障的功能障礙加速了炎癥介質(zhì)和外周免疫細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的滲透，導(dǎo)致行為異常和情緒障礙[24]。穿越血腦屏障的IL-6、IL-1β等促炎細(xì)胞因子能激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)炎癥的發(fā)生[25]，介導(dǎo)海馬等腦區(qū)的細(xì)胞焦亡[26]，影響神經(jīng)再生[27]，而且促炎細(xì)胞因子水平升高可引起大腦內(nèi)吲哚胺-2，3-雙加氧酶升高，導(dǎo)致海馬組織內(nèi)5-HT水平下降，從而誘發(fā)抑郁癥[28]。若能抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生、活化可能減輕腦神經(jīng)損害的發(fā)生發(fā)展[11]。

GO分析結(jié)果顯示，這些靶點(diǎn)參與了細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子活性等過(guò)程，影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳遞等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)涉及NF-κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等多條通路，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。其中NF-κB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要通路，當(dāng)阻斷NF-κB時(shí)，外周的炎癥反應(yīng)則不會(huì)引起中樞炎癥反應(yīng)。研究表明NF-κB可通過(guò)多種信號(hào)通路參與抑郁癥的發(fā)生，在CMS模型小鼠和LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中TLR4信號(hào)的激活促進(jìn)了NF-κB的磷酸化，從而促進(jìn)了炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致抑郁[29-30]。綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，頤腦解郁方可能通過(guò)槲皮素、咖啡酸等有效活性成分抑制NF-κB信號(hào)通路，從而降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，使5-HT神經(jīng)遞質(zhì)水平恢復(fù)正常從而產(chǎn)生抗抑郁作用，頤腦解郁方還可能通過(guò)降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平減輕神經(jīng)炎癥，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，21 d CUMS應(yīng)激結(jié)束后，和正常組相比，其余3組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分偏低，提示模型制備成功。藥物干預(yù)28 d后，與模型組相比，中藥組和西藥組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分上升，說(shuō)明頤腦解郁方同鹽酸氟西汀一樣，可改善抑郁大鼠行為，提示頤腦解郁方具有抗抑郁作用。模型組與正常組相比，血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.01），說(shuō)明促炎細(xì)胞因子升高與抑郁癥相關(guān)；中藥組和西藥組促炎細(xì)胞因子水平較模型組下降，表明頤腦解郁方能夠降低CUMS抑郁模型大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α促炎細(xì)胞因子水平。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度對(duì)頤腦解郁方調(diào)控抑郁癥促炎細(xì)胞因子的有效活性成分、潛在調(diào)控靶點(diǎn)、關(guān)鍵蛋白和通路、機(jī)制進(jìn)行了闡述，并針對(duì)血清促炎細(xì)胞因子水平進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果提示頤腦解郁方可能通過(guò)降低血清促炎細(xì)胞因子水平從而改善抑郁癥，其作用涉及不同靶點(diǎn)和通路，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療抑郁癥的多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn)。本次研究為初步探索，頤腦解郁方調(diào)節(jié)抑郁癥促炎細(xì)胞因子水平的具體通路機(jī)制需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories， 1990-2019： A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019[J]. Lancet， 2020， 396（10258）： 1204-1222.

[2] TROUBAT R， BARONE P， LEMAN S， et al. Neuroinflammation and depression： A review[J]. The European Journal of Neuroscience， 2021， 53（1）： 151-171.

[3] 白 ?揚(yáng)，李曉紅，任素劍，等.冠心病、抑郁癥與慢性應(yīng)激[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，21（2）：54-57.

[4] 楊會(huì)增，楊程皓.抑郁癥抗炎治療的研究進(jìn)展[J].臨床精神醫(yī)學(xué)雜志，2022，32（6）：492-496.

[5] P？魪REZ-S？譧NCHEZ G， BECERRIL-VILLANUEVA E， ARREOLA R， et al. Inflammatory profiles in depressed adolescents treated with fluoxetine： An 8-week follow-up open study[J]. Mediators of Inflammation， 2018， 2018： 4074051.

[6] 曲 ?淼，孫文軍，徐向青，等.益腎調(diào)氣法治療腎虛肝郁型抑郁癥的多中心、隨機(jī)、對(duì)照臨床研究[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（7）：1710-1713，1718.

[7] 趙 ?晶，唐啟盛，裴清華，等.頤腦解郁方治療抑郁癥腎虛肝郁型的臨床療效觀察[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（1）：61-63.

[8] 裴清華，唐啟盛，侯秀娟.頤腦解郁方對(duì)抑郁狀態(tài)模型大鼠行為學(xué)及腦內(nèi)5-羥色胺去甲腎上腺素的表達(dá)影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（7）：1446-1448.

[9] 唐啟盛，侯秀娟，趙瑞珍.中藥頤腦解郁方對(duì)抑郁模型大鼠腦單胺遞質(zhì)的干預(yù)作用[J].北京中醫(yī)藥，2011，30（9）：710-713.

[10] 趙 ?蕓，趙瑞珍，趙子珺，等.頤腦解郁方對(duì)抑郁大鼠PI-3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2018，16（23）： 3441-3444.

[11] RU J L， LI P， WANG J N， et al. TCMSP： A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. Journal of Cheminformatics， 2014， 6： 13.

[12] FANG S S， DONG L， LIU L， et al. HERB： A high-throughput experiment-and reference-guided database of traditional Chinese medicine[J]. Nucleic Acids Research， 2021， 49（D1）： D1197-D1206.

[13] LIPINSKI C A. Lead-and drug-like compounds： The rule-of-five revolution[J]. Drug Discovery Today Technologies， 2004， 1（4）： 337-341.

[14] YU G C， WANG L G， HAN Y Y， et al. clusterProfiler： An R package for comparing biological themes among gene clusters[J]. Omics： a Journal of Integrative Biology， 2012， 16（5）： 284-287.

[15] 王 ?雪，趙 ?燕，扈新剛，等.從中醫(yī)肝主疏泄理論談疏肝解郁法在情志病中的應(yīng)用[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2019，12（3）：366-370.

[16] 李冬梅，唐啟盛，趙瑞珍，等.腦卒中后大鼠模型邊緣系統(tǒng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的動(dòng)態(tài)改變及中藥的干預(yù)作用[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（9）：606-610.

[17] ARIOZ B I， TASTAN B， TARAKCIOGLU E， et al. Melatonin attenuates LPS-induced acute depressive-like behaviors and microglial NLRP3 inflammasome activation through the SIRT1/Nrf2 pathway[J]. Frontiers in Immunology， 2019， 10： 1511.

[18] LI Y， YAO J Y， HAN C Y， et al. Quercetin， inflammation and immunity[J]. Nutrients， 2016， 8（3）： 167.

[19] HAN X J， XU T S， FANG Q J， et al. Quercetin hinders microglial activation to alleviate neurotoxicity via the interplay between NLRP3 inflammasome and mitophagy[J]. Redox Biology， 2021， 44： 102010.

[20] HUANG D， ZHANG L， YANG J Q， et al. Evaluation on monoamine neurotransmitters changes in depression rats given with sertraline， meloxicam or/and caffeic acid[J]. Genes & Diseases， 2019， 6（2）： 167-175.

[21] 馬慶陽(yáng).咖啡酸對(duì)CUMS大鼠抑郁行為的影響[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2012.

[22] WEI Y C， HU Y H， QI K M， et al. Dihydromyricetin improves LPS-induced sickness and depressive-like behaviors in mice by inhibiting the TLR4/Akt/HIF1a/NLRP3 pathway[J]. Behavioural Brain Research， 2022， 423： 113775.

[23] CHENG Y Y， DESSE S， MARTINEZ A， et al. TNFα disrupts blood brain barrier integrity to maintain prolonged depressive-like behavior in mice[J]. Brain， Behavior， and Immunity， 2018， 69： 556-567.

[24] UZZAN S， AZAB A N. Anti-TNF-α compounds as a treatment for depression[J]. Molecules， 2021， 26（8）： 2368.

[25] WANG Y L， HAN Q Q， GONG W Q， et al. Microglial activation mediates chronic mild stress-induced depressive-and anxiety-like behavior in adult rats[J]. Journal of Neuroinflammation， 2018， 15（1）： 21.

[26] XU Y J， SHENG H， BAO Q Y， et al. NLRP3 inflammasome activation mediates estrogen deficiency-induced depression-and anxiety-like behavior and hippocampal inflammation in mice[J]. Brain， Behavior， and Immunity， 2016， 56： 175-186.

[27] KIM Y K， NA K S， MYINT A M， et al. The role of pro-inflammatory cytokines in neuroinflammation， neurogenesis and the neuroendocrine system in major depression[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry， 2016， 64： 277-284.

[28] KIM Y K， WON E.. The influence of stress on neuroinflammation and alterations in brain structure and function in major depressive disorder[J]. Behavioural Brain Research， 2017， 329： 6-11.

[29] HUANG X， FEI G Q， LIU W J， et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells protect against CMS-induced depression-like behaviors in mice via regulating the Nrf2/HO-1 and TLR4/NF-κB signaling pathways[J]. Acta Pharmacologica Sinica， 2020， 41（5）： 612-619.

[30] XU X， PIAO H N， AOSAI F M， et al. Arctigenin protects against depression by inhibiting microglial activation and neuroinflammation via HMGB1/TLR4/NF-κB and TNF-α/TNFR1/NF-κB pathways[J]. British Journal of Pharmacology， 2020， 177（22）： 5224-5245.

〔收稿日期〕2022-10-27

〔基金項(xiàng)目〕中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（2020-JYB-ZDGG-144-3）。

〔第一作者〕張 ?雙，女，博士研究生，研究方向：神經(jīng)精神疾病的中醫(yī)藥防治。

〔通信作者〕*趙瑞珍，女，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhaoruizhen2009@163.com。