王 瑤，徐春暉，張芳榮，陳方會(huì)，杜俊民

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討歐李類(lèi)黃酮成分抗骨質(zhì)疏松作用

王 瑤，徐春暉，張芳榮，陳方會(huì)，杜俊民*

(山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，晉中 030619)

為了定性分析歐李果實(shí)中的類(lèi)黃酮成分，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究歐李類(lèi)黃酮抗骨質(zhì)疏松作用，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討其作用機(jī)制。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，對(duì)歐李果實(shí)類(lèi)黃酮粉末進(jìn)行成分分析，建立維甲酸小鼠骨質(zhì)疏松模型，檢測(cè)小鼠血清中Ca、StrACP、AKP、MDA、T-SOD等含量及股骨長(zhǎng)度等物理指標(biāo)。利用Swiss和PubMed挖掘活性成分靶點(diǎn)信息，通過(guò)GeneCards、OMIM、TTD和PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)得到骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點(diǎn)信息，將成分靶點(diǎn)和骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)取交集。使用STRING建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。使用DAVID對(duì)歐李果實(shí)類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，繪制KEGG富集分析高級(jí)氣泡圖。利用Cytoscape軟件構(gòu)建歐李果實(shí)類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果表明：歐李果實(shí)類(lèi)黃酮粉末正離子模式下共檢測(cè)到50 種活性成分；在小鼠骨質(zhì)疏松模型中，歐李類(lèi)黃酮顯著提高血清鈣和AKP水平，增強(qiáng)T-SOD活性，降低MDA含量及StrACP水平；基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到歐李果實(shí)類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松作用前5 位KEGG通路主要是催乳素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、C型凝集素受體信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路和血小板活化通路。參與上述5 個(gè)途徑，其中，程度最高的靶向基因是?？梢?jiàn)歐李果實(shí)類(lèi)黃酮可以改善維甲酸引起的小鼠骨質(zhì)疏松，其可能與、等靶基因有關(guān)。

歐李；類(lèi)黃酮；抗骨質(zhì)疏松；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨病，會(huì)導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。骨質(zhì)疏松癥患者的骨微結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致骨密度降低和骨脆性增加[1]。絕經(jīng)期婦女由于雌激素缺乏而導(dǎo)致的骨質(zhì)流失被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松的主要原因。目前激素替代療法被廣泛用于補(bǔ)償骨質(zhì)流失，但該過(guò)程伴隨著嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，研發(fā)安全有效的新型合成產(chǎn)品，抵御與更年期相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥的影響很有必要。

歐李是我國(guó)特有的果藥兼用型樹(shù)種[2]，主要分布在黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古等干旱寒冷地區(qū)[3-4]。歐李果實(shí)營(yíng)養(yǎng)十分豐富，特別是鈣的含量居于所有水果之首，因此又稱(chēng)“鈣果”[5-6]，歐李果肉其他營(yíng)養(yǎng)成分含量也較高，如氨基酸354.9 mg·100 g-1，總糖62.5 g·kg-1，它們和礦質(zhì)元素、有機(jī)酸、類(lèi)黃酮等一道形成酸甜可口、風(fēng)味獨(dú)特的口味，深受消費(fèi)者的歡迎[7-8]。除鈣含量外，果肉含有大量的多酚，是歐李關(guān)鍵的活性成分，它們具有抗氧化、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等特性[9-10]。

白東海[11]研究發(fā)現(xiàn)歐李含有類(lèi)黃酮，并且絕大多數(shù)品種歐李果實(shí)果皮類(lèi)黃酮含量在10 ～ 30 mg·g-1范圍內(nèi)，但到目前為止，還尚未有人針對(duì)歐李中的黃酮類(lèi)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究。課題組前期試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)歐李類(lèi)黃酮可提高小鼠骨密度，因此，本研究在此基礎(chǔ)上，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)歐李類(lèi)黃酮成分進(jìn)行分析，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)研究歐李類(lèi)黃對(duì)骨質(zhì)疏松藥效作用，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討歐李類(lèi)黃酮抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制，以期為今后臨床應(yīng)用及治療骨質(zhì)疏松癥新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮（含量60.34 %）為實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)提取純化后粉末；維甲酸（HPLC ≥ 98 %）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；鈣試劑盒（20220107）、抗酒石酸酸性磷酸酶（StrACP）（20220110）、堿性磷酸酶（AKP）（20211230）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）（20211231）和丙二醛（MDA）（20220103）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；復(fù)方葡萄糖酸鈣口服液（國(guó)藥準(zhǔn)字H20193040）購(gòu)自哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 電子分析天平：上海贊維衡器有限公司(CP124C)；超聲波清洗儀：廈門(mén)明甬航自動(dòng)化科技有限公司(JM-20D-40)；BIOBASE-EL10系列酶標(biāo)儀：濟(jì)南濟(jì)威醫(yī)療器械有限公司(SB25 -12DTS)；游標(biāo)卡尺：東莞市景有模具五金有限公司（0 ～150 mm）；超速低溫離心機(jī)：賽默飛（世爾）儀器有限公司(Legend Micro 17)；線(xiàn)性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨液質(zhì)：賽默飛（世爾）儀器有限公司（LTQ ORBITRAP VELOS PRO）。

1.1.3 供試動(dòng)物 清潔型雌性昆明小白鼠，60 只，體重（25±2.3）g，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)，飼養(yǎng)環(huán)境（22 ± 2）℃，相對(duì)濕度：45% ～ 65%，定期環(huán)境消毒。

1.1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù) PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)(https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)，Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstarget prediction.ch/），GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. gene cards.org/），在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳(OMIM)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://db.idrblab.net/ttd/），PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.pharmgkb.org/），STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)和DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// david.ncifcrf.gov/）。

1.2 方法

1.2.1 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮成分分析 （1）供試品制備方法。取歐李果實(shí)類(lèi)黃酮純化后樣品0.1 g于離心管（10 mL）內(nèi)，加入50%甲醇水溶液（8 mL）,超聲提取40 min（45 ℃），靜置5 min，取上清液，13 000 r·min-1離心10 min，過(guò)微孔濾膜（0.22 μm），得到歐李黃酮提取液。同樣條件得到空白對(duì)照樣品。放入4 ℃冰箱保存，分析前取出（保存時(shí)間不能超過(guò)24 h）。

（2）色譜條件。色譜儀器為：UltiMate 3000 UHPLC。色譜柱為C18(1.8 μm，2.1mm×100 mm)；柱溫（45 ℃）；流速（0.4 mL·min-1）；進(jìn)樣量（4 μL）；流動(dòng)相采用乙腈﹣0.1 %甲酸水溶液的梯度洗脫程序，具體見(jiàn)表1。

（3）質(zhì)譜條件。質(zhì)譜儀器為L(zhǎng)TQ ORBITRAP VELOS PRO, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA。HESI源，正離子模式，離子源溫度為350 ℃，毛細(xì)管溫度為320 ℃，鞘氣體積流量35 L·h-1，輔助氣體積流量10 L·h-1，噴霧電壓（4 kV），毛細(xì)管電壓（35 V），管透鏡電壓（110 V），樣品先進(jìn)行全掃描，分辨率設(shè)為30 000，掃描范圍（50 ～ 900），二級(jí)采用動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)依賴(lài)性?huà)呙?data dependent scan，DDS)，選取上一級(jí)豐度前三強(qiáng)的峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碎片掃描，以離子阱打拿極(dynode)檢測(cè)。

1.2.2 維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松試驗(yàn) （1）動(dòng)物分組及維甲酸小鼠模型建立。將60 只小鼠隨機(jī)分為6 組，分別為空白組、模型組（維甲酸組）、對(duì)照組（葡萄糖酸鈣組）、低、中、高劑量組（58.5、117 和234 mg·kg-1），適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，所有動(dòng)物喂養(yǎng)條件一致。除空白組外，各組小鼠每天灌胃給予維甲酸（105 mg·kg-1），連續(xù)造模14 d后成功。模型組給予維甲酸，對(duì)照組給予葡萄糖酸鈣（3.9 mL·kg-1）、低、中、高劑量組（58.5、117 和234 mg·kg-1）分別給予不同濃度的歐李果實(shí)類(lèi)黃酮。小鼠每日/每千克給藥量=成人每日給藥量除以人體重70 kg×9.1，給藥容積為0.02 mL·g-1。持續(xù)給藥14 d。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

（2）檢測(cè)指標(biāo)。動(dòng)物體質(zhì)量：試驗(yàn)結(jié)束和開(kāi)始時(shí)，稱(chēng)定動(dòng)物體質(zhì)量；臟器指數(shù)：取心、肝、脾、肺，腎稱(chēng)量，計(jì)算臟器指數(shù)；血清指標(biāo)：血清鈣、StrACP、AKP含量均按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定；抗氧化指標(biāo)：血清中MDA和T-SOD含量均按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定；股骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)：小鼠股骨，用游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨長(zhǎng)度（mm）及直徑[12]。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究 （1）歐李果實(shí)類(lèi)黃酮活性成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和篩選。通過(guò)文獻(xiàn)查找，選取四乙酸-3-O-甲基槲皮素酯、橙皮素、2', 4', 5-三羥基-7-甲氧基異黃酮、5-O-甲基柚皮素、6-甲氧基柚皮素、5, 7, 4'-三羥基-8-甲基二氫黃酮、4'-羥基漢黃芩素、山奈素和2', 5, 7-三羥基-8-甲氧基黃烷酮9種成分，利用PubMed找取上述各活性成分的分子式，再用Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)找取活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。

（2）歐李果實(shí)類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和篩選。通過(guò)GeneCards、OMIM、TTD和PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)找取治療骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)，去除無(wú)效基因，匯總整理骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)。把骨質(zhì)疏松作用靶點(diǎn)與歐李果實(shí)類(lèi)黃酮成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集。

（3）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)數(shù)據(jù)。通過(guò)STRING獲得與歐李果實(shí)類(lèi)黃酮和骨質(zhì)疏松的共同靶點(diǎn)直接或間接相互作用的相關(guān)蛋白。

（4）治療骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)通路的注釋分析。通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路分析計(jì)算和評(píng)價(jià)，探討基因的功能注釋和參與通路[13]。< 0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

（5）藥物“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。把歐李果實(shí)類(lèi)黃酮有效活性成分及其骨質(zhì)疏松作用靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件以構(gòu)建歐李果實(shí)類(lèi)黃酮抗骨質(zhì)疏松的“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮成分分析結(jié)果

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分目標(biāo)物搜索：歐李黃酮提取物正離子模式下共檢測(cè)到50種活性成分，按質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度排序依次為：四乙酸-3-O-甲基槲皮素酯、穗花杉雙黃酮 7, 4', 7'', 4'''-四甲基醚、5,7-二羥基-3-(4-羥基芐基)色滿(mǎn)-4-酮、巴西蘇木素、櫻花亭、5-O-甲基柚皮素、3-去氧蘇木酮 B、異櫻花亭、5, 7, 4'-三羥基-8-甲基二氫黃酮、Dihydrooroxylin、櫻花素、異櫻花素、瑞斯蒂酮、球松素、山姜素、美迪紫檀素、甘草甙元、異甘草甙元、2'-O-甲基異甘草甙元、2'-Methoxyisoliquiritigenin、4'-Hydroxy-4- methoxydalbergione、7, 3', 4'-三羥基-3-芐基-2H-苯并吡喃、羥基芫花素、鳶尾黃素、香葉木素、異山奈素、高車(chē)前素、4'-羥基漢黃芩素、山奈素、3'-O-甲基香豌豆苷元、2-羥基異櫻黃素、koparin、鼠李檸檬素、金圣草(黃)素、3′-Hydroxymelanettin、2', 4', 5-三羥基-7-甲氧基異黃酮、小構(gòu)樹(shù)醇 B、光甘草醇、5,7-二羥基-6, 8-二甲基-3-(4'-羥基-3', 5'-二甲氧基芐基)色滿(mǎn)-4-酮、麥冬二氫高異黃酮F、麥冬黃烷酮F、假馬齒莧素 A3、艾納香素、6-甲氧基柚皮素、2', 5, 7-三羥基-8-甲氧基黃烷酮、圣草酚-7-O-葡糖苷、橙皮素、蘇木素、高圣草酚和3-Hydroxyvestitone（圖1和表2）。

圖1 歐李黃酮中藥提取物正離子模式下總離子流圖

Figure 1 Total ion flow diagram of flavonoid extracts fromunder positive ion mode

表2 黃酮檢測(cè)成分詳細(xì)信息

續(xù)表2

表3 小鼠體質(zhì)量及股骨指標(biāo)比較

注：與空白組相比，*<0.05,**<0.01;與模型組相比，#<0.05,##<0.01。下同。

表4 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮對(duì)血清生化指標(biāo)的影響

表5 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮對(duì)MDA和T-SOD的影響

2.2 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮抗骨質(zhì)疏松試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 體質(zhì)量、和股骨指標(biāo) 如表3所示，試驗(yàn)?zāi)┢?，與空白組相比，模型組動(dòng)物體質(zhì)量下降，有顯著性差異（< 0.05）；股骨長(zhǎng)度和股骨直徑呈下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異；與模型組相比，歐李果實(shí)類(lèi)黃酮低、中、高劑量組及對(duì)照組體質(zhì)量無(wú)顯著性差異，股骨長(zhǎng)度和股骨直徑呈上升趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 血液生化指標(biāo) 如表4所示，與空白組比較，模型組血清Ca及AKP降低（< 0.05，< 0.01）StrACP升高（< 0.01）。與模型組相比，對(duì)照組血清Ca及AKP水平升高（< 0.01），StrACP降低 （< 0.01）；歐李果實(shí)類(lèi)黃酮中、高劑量組血清鈣升高（< 0.05，< 0.01）, AKP水平升高（< 0.01），StrACP水平均降低（< 0.05）。

2.2.3 血液抗氧化指標(biāo) 由表5可知，與空白組相比，模型組MDA顯著上升（< 0.01），T-SOD活性明顯下降（< 0.01）；與模型組相比，歐李類(lèi)黃酮高劑量組MDA含量下降，T-SOD上升（< 0.05）。由此可知，歐李類(lèi)黃酮能減少氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化所帶來(lái)的損傷，達(dá)到較好的抗氧化作用。

2.2.4 臟器指數(shù) 如表6所示，與空白組相比，模型組肝臟指數(shù)有顯著性差異（< 0.01），其余臟器指數(shù)無(wú)顯著性差異；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、歐李果實(shí)類(lèi)黃酮中、高劑量組肝指數(shù)都有顯著性差異（< 0.05）。表明肝臟受到了一定的損傷。

表6 各組臟器指數(shù)間比較

表7 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮有效化學(xué)成分

表8 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮與骨質(zhì)疏松交集靶點(diǎn)

圖2 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

Figure 2 PPI network of osteoporosis target protein treated with flavonoids fromfruit

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.3.1 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮潛在活性和靶點(diǎn) 將Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)度設(shè)置值> 0，將目標(biāo)預(yù)測(cè)方法給出的分?jǐn)?shù)超過(guò)給定相關(guān)度分?jǐn)?shù)的預(yù)測(cè)候選目標(biāo)視為潛在目標(biāo)，并將對(duì)其進(jìn)行介紹和進(jìn)一步分析。共得到4 個(gè)有效潛在目標(biāo)（表7），并將每個(gè)潛在目標(biāo)的靶點(diǎn)去除重復(fù)，共得到歐李果實(shí)類(lèi)黃酮活性成分的靶點(diǎn)258 個(gè)（去除重復(fù)后）。

2.3.2 歐李果實(shí)類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和篩選 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得24 個(gè)靶基因，在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得31 個(gè)靶基因、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得0 個(gè)靶基因和PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)獲得3 個(gè)靶基因。為了更加精準(zhǔn)的鎖定骨質(zhì)疏松疾病，把這4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行整合，總共獲得了58 個(gè)靶基因。為了獲得歐李果實(shí)類(lèi)黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松作用的候選靶點(diǎn)，我們將活性成分預(yù)測(cè)的258 個(gè)歐李果實(shí)類(lèi)黃酮靶點(diǎn)與骨質(zhì)疏松靶基因整合，得出歐李果實(shí)類(lèi)黃酮活性成分與骨質(zhì)疏松相關(guān)的潛在靶點(diǎn)（表8）。

2.3.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)數(shù)據(jù) 通過(guò)把歐李果實(shí)類(lèi)黃酮活性成分對(duì)應(yīng)的治療骨質(zhì)疏松的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合Cytoscape軟件構(gòu)建歐李果實(shí)類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松的PPI網(wǎng)絡(luò)，具體見(jiàn)圖2。共涉及節(jié)點(diǎn)數(shù)5 個(gè)，邊數(shù)7 個(gè)，平均節(jié)點(diǎn)度為10.3，degree中位數(shù)為3。

2.3.4 KEGG通路分析 利用DAVID進(jìn)行KEGG分析，共得到21 條KEGG通路。

通過(guò)DAVID軟件數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，該5 個(gè)靶點(diǎn)富集在21 條通路上(＜0.05)，將其結(jié)果繪制氣泡圖（圖3），橫坐標(biāo)是富集在該條通路的基因數(shù)目，縱坐標(biāo)是通路名稱(chēng)，顏色深淺代表值大小，點(diǎn)的大小代表通路富集基因的數(shù)量。KEGG富集分析中與骨質(zhì)疏松相關(guān)的前五位KEGG通路分別是催乳素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、C型凝集素受體信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、血小板活化通路，詳見(jiàn)表9。和參與了所有5 個(gè)途徑。程度最高的靶向基因是。

Figure 3 KEGG enrichment analysis of flavonoids infruit against

表9 歐李類(lèi)黃酮抗骨質(zhì)疏松前5個(gè)KEGG通路和相關(guān)基因

圖4 歐李類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

Figure 4 '' Active component - target '' network diagram offlavonoids in the treatment of

2.3.5 藥物“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape軟件構(gòu)建歐李類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。以58 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)及4 個(gè)活性成分建立歐李類(lèi)黃酮治療骨質(zhì)疏松活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），共包括31 個(gè)節(jié)點(diǎn)和70 個(gè)邊條。

3 討論與結(jié)論

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨病，由骨轉(zhuǎn)換不平衡引起，導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[14]。研究表明黃酮類(lèi)化合物具有抗骨質(zhì)疏松作用[15-16]，晉楠[17]用歐李果實(shí)制品對(duì)改善大小鼠骨質(zhì)疏松進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)小鼠對(duì)鈣的吸收，改善骨質(zhì)疏松。因此本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析歐李類(lèi)黃酮成分，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，進(jìn)一步探討其抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制。

動(dòng)物試驗(yàn)表明，歐李果實(shí)類(lèi)黃酮可減少氧化所帶來(lái)的的損傷，改善股骨長(zhǎng)度和股骨直徑；降低酸性磷酸酶活性，同時(shí)升高堿性磷酸酶活性，使成骨細(xì)胞骨合成與破骨細(xì)胞骨吸收處于平衡狀態(tài)，達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的作用。堿性磷酸酶活性是成骨細(xì)胞早期發(fā)生的既定標(biāo)志，在成骨細(xì)胞分化為成熟成骨細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程中增加，隨后在整個(gè)礦化期下降[18-19]。該蛋白在早期成骨形成過(guò)程中增長(zhǎng)最快，被認(rèn)為是篩選成骨活性的一個(gè)極好的標(biāo)志物[20]。酸性磷酸酶活性被稱(chēng)為破骨細(xì)胞標(biāo)志物，它的量在伴隨病理性骨吸收的血清中被檢測(cè)到升高。有證據(jù)表明，當(dāng)破骨細(xì)胞以增加的速率被刺激進(jìn)入吸收活動(dòng)時(shí)，骨吸收的病理性增加就會(huì)出現(xiàn)，這破壞了骨吸收和骨合成之間的正常平衡[21]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)歐李類(lèi)黃酮靶向基因與骨質(zhì)疏松癥之間共有21 條KEGG通路。在21 條KEGG通路中，按值遞增排名前5 位的分別是催乳素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、C型凝集素受體信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路和血小板活化通路?；蚝蛥⑴c了所有5 條KEGG通路，因此它們被認(rèn)為是中樞基因。可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、存活和增殖。有研究表明，在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫中發(fā)揮著多種作用，如吞噬作用、炎性細(xì)胞因子/介質(zhì)的產(chǎn)生和細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)。巨噬細(xì)胞參與多種免疫反應(yīng)和炎癥性疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥和骨質(zhì)疏松癥等[22]。是與骨形成密切相關(guān)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵介質(zhì)。Zhu等[23]發(fā)現(xiàn)的上調(diào)增強(qiáng)了成骨細(xì)胞分化，降低了破骨細(xì)胞相關(guān)基因的水平；相反，的下調(diào)降低了成骨細(xì)胞相關(guān)基因的水平，增加了破骨細(xì)胞相關(guān)基因的水平。通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞形成來(lái)維持骨穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，歐李果實(shí)類(lèi)黃酮可以通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞生成和抑制破骨細(xì)胞生成來(lái)改善骨質(zhì)疏松癥。其主要可能通過(guò)調(diào)節(jié)催乳素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗通路發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松功能。

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Anti-osteoporosis effect of flavonoids frombased on network pharmacology and animal experiments

WANG Yao, XU Chunhui, ZHANG Fangrong, CHEN Fanghui, DU Junmin

(College of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 031619)

To study the anti-osteoporosis effect of flavonoids fromfruit by animal experiment and explore its mechanism based on network pharmacology, HPLC-MS was used to analyze the components of flavonoids powder fromfruit. The osteoporosis model of retinoic acid mice was established to detect the contents of Ca, StrACP, AKP, MDA, T-SOD in serum and physical indexes such as femur length. Swiss and PubMed were used to mine the target information of active components. The information of osteoporosis-related targets was obtained through GeneCards, OMIM, TTD and PharmGKB databases, and the component targets and osteoporosis targets were intersected. STRING was used to establish protein-protein interaction (PPI) networks. DAVID was used to analyze the KEGG pathway of flavonoids fromfruit in the treatment of osteoporosis, and the high-level bubble diagram of KEGG enrichment analysis was plotted. Cytoscape software was used to construct the “active ingredient-target” network diagram of flavonoids fromfruit in the treatment of osteoporosis. As results, a total of 50 active components were detected in the positive ion mode of flavonoids powder fromfruit. In the osteoporosis model of mice, the contents of serum calcium and AKP were significantly increased, the activity of T-SOD was enhanced, and the content of MDA and the level of StrACP were decreased. Based on network pharmacology analysis, the top five KEGG pathways in the treatment of osteoporosis by flavonoids fromfruit were mainly prolactin signaling pathway, endocrine resistance, C-type lectin receptor signaling pathway, thyroid hormone signaling pathway, and platelet activation pathway.andwere involved in these five pathways, and the target gene with the highest degree was. In conclusion, flavonoids can improve the osteoporosis induced by retinoic acid in mice, which may be related to target genes such asand.

; flavonoids; anti-osteoporosis; network pharmacology

R282.71; S662.309.9

A

1672-352X (2023)02-0356-08

2022-05-09

山西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(201703D221028-2)和校級(jí)項(xiàng)目（2020PY-ZH-05）共同資助。

王 瑤，碩士研究生。E-mail：y18795873421@163.com

通信作者:杜俊民，博士，教授。E-mail：dujmtcm@163.com

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.004

2023-05-12 10:34:36

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20230511.1150.008.html