孫俏潔 李祥平 楊群菲

喉癌（laryngeal cancer）為常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道，喉癌的五年總體生存率為32%～70%，且男性患者多于女性［1］。喉癌患者確診后常需要接受手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療。多西他賽（Docetaxel，DOC）為喉癌治療的一線化療藥物，可通過(guò)影響微管的聚合而發(fā)揮細(xì)胞毒作用，但仍有部分患者對(duì)DOC 不敏感［2］。因此，如何增強(qiáng)喉癌細(xì)胞對(duì)DOC 的敏感性是臨床治療亟待解決的問(wèn)題。miR-122a 屬于轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度在22～25 nt 范圍內(nèi)的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。研究發(fā)現(xiàn)外源性過(guò)表達(dá)miR-122a 能顯著抑制喉癌細(xì)胞Hep2 的增殖能力［3］，但其抑制Hep2 細(xì)胞增殖的信號(hào)機(jī)制不完全清楚，其是否影響喉癌細(xì)胞對(duì)DOC 的敏感性暫無(wú)報(bào)道。為此，本研究以Hep-2 細(xì)胞為觀察對(duì)象，通過(guò)外源性過(guò)表達(dá)miR-122a，觀察細(xì)胞對(duì)DOC 的敏感性變化，同時(shí)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床治療喉癌提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人喉癌細(xì)胞Hep-2（ATCC CCL-23）購(gòu)自北納生物公司。

1.2 主要試劑 DOC 購(gòu)自浙江海正藥業(yè)公司，miR-122a 慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自山東維真生物公司，RPMI1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，TRIZOL、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RTFQ-PCR 試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa 公司，BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑購(gòu)自上海碧云天公司，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGER）抗體（4267S）、p-EGFR（3777S）、蛋白激酶B（AKT）抗體（4685S）、p-AKT 抗體（4060S）、抗兔IgG-HRP 抗體（7074S）、抗兔 IgG（H+L），F(xiàn)（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor? 594 Conjugate）（8889S）、抗兔IgG（H+L），（Alexa Fluor? 488 Conjugate）（4416S）購(gòu)自美國(guó)CST 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CKX41 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司產(chǎn)品）；HERAguard ECO1.5 超凈工作臺(tái)（美國(guó)Thermo Scientific 公司產(chǎn)品）；Allegra 64R Centrifuge 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter 公司產(chǎn)品）；ABI Prism?7300型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司產(chǎn)品）；Model550酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽及轉(zhuǎn)印夾（美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品）；GE600 凝膠成像儀（美國(guó)GE 公司產(chǎn)品）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法（1）細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒轉(zhuǎn)染及分組：人喉癌細(xì)胞Hep2 培養(yǎng)在含10% FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5% CO2，95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱。慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建miR-122a 過(guò)表達(dá)細(xì)胞：將載有miR-122a 的慢病毒和空載慢病毒稀釋5倍，分別加入Hep-2 細(xì)胞中培養(yǎng)細(xì)胞24 h，傳代兩次后以1 μg/mL 嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選。將過(guò)表達(dá)miR-122a 的Hep-2 細(xì)胞設(shè)為過(guò)表達(dá)組，轉(zhuǎn)染空白載體的細(xì)胞設(shè)為空載對(duì)照組，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照組。（2）RTFQ-PCR 檢測(cè)細(xì)胞miR-122a 表達(dá)水平：培養(yǎng)空白對(duì)照組、空載對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，收集細(xì)胞，TRIZOL 法提取細(xì)胞總RNA，將RNA 以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將miR-122a 正向引物和反向引物稀釋后按1 ∶1 混合，以RTFQ-PCR 試劑盒在ABI 7300 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔。以U6 作為內(nèi)參，2-△△CT法計(jì)算miR-122a 的相對(duì)表達(dá)水平。miR-122a 引物序列如下，正向引物：5’-CAAGCGTTGGAGTGTGACA-3’，反向引物：5’-CGTCCTACCATTCTCCAGC-3’；內(nèi)參U6 引物如下，正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。（3）四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力：培養(yǎng)空白對(duì)照組、空載對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，各組細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，每組細(xì)胞設(shè)7 個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度5 個(gè)重復(fù)孔。次日，將細(xì)胞更換為含0、0.5、1、5、10、20、50 mg/L DOC 的RPMI1640 培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h 時(shí)，每孔加入20 μL MTT，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀A490 nm 處測(cè)量各孔的吸光值。制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算各組細(xì)胞的細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）。（4）結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞貼壁存活情況：培養(yǎng)空白對(duì)照組、空載對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，各組細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，當(dāng)匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，細(xì)胞同步化12 h。而后聚山梨酯-80（溶劑，1‰）和DOC（5.56 μg/mL）分別處理各組細(xì)胞24 h。處理結(jié)束后細(xì)胞PBS 洗3 遍，每孔加入1 mL 固定液（4%多聚甲醛）固定10 min，PBS 洗1 遍，各加入1 mL 結(jié)晶紫染色液染色10 min，雙蒸水洗兩遍，倒置顯微鏡下拍照。每組隨機(jī)視野拍照3～5 張，人工計(jì)數(shù)后計(jì)算細(xì)胞貼壁存活率。（5）蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)細(xì)胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表達(dá)：培養(yǎng)各組細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，按1×106個(gè)/皿接種于6 cm 培養(yǎng)皿中，適時(shí)收集細(xì)胞，用RIPA 細(xì)胞裂解液提取總蛋白，12,000 r/min 離心20 min（r=8 cm），將上清液以BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，制備含35 μg/15 μL 的蛋白樣品，100 ℃變性，采用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5 %脫脂牛奶封閉過(guò)夜，次日孵育EGFR（1 ∶2,000）、p-EGFR（1 ∶1,000）、AKT（1 ∶3,000）、p-AKT（1 ∶1,000）或內(nèi)參抗體GAPDH（1 ∶5,000）3 h，TBST 洗膜3 次，孵育羊抗兔IgG-HRP 抗體1 h，TBST 洗膜3 次，以ECL 化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，GE600 凝膠成像儀下成像并讀取相應(yīng)蛋白條帶。（6）免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表達(dá)：培養(yǎng)空白對(duì)照組、空載對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，各組細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于放置蓋玻片的6 孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗1 遍，細(xì)胞以4 %多聚甲醛固定10 min，PBS 洗2 遍，取出載玻片并以0.5% TritonX-100 通透10 min，PBS 洗2 遍，以8%山羊血清封閉1 h，而后滴加p-EGFR（1 ∶500）和p-AKT（1 ∶500）4 ℃孵育過(guò)夜，PBST 洗3 遍，避光孵育熒光二抗（1 ∶300）1 h，PBTS 浸洗3 遍，DAPI染色5min，洗去DAPI 后封片，于倒置熒光顯微鏡下拍照并記錄熒光強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較方法采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-122a 表達(dá)水平差異 RTFQ-PCR結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和空載對(duì)照組miR-122a 表達(dá)水平無(wú)明顯差異；與空載對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞miR-122a 表達(dá)明顯升高（F=264.9，P＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞miR-122a表達(dá)變化（注：與空載對(duì)照組比較，** P＜0.01。n=3）

2.2 DOC對(duì)各組細(xì)胞的IC50值的比較 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DOC 對(duì)空白對(duì)照組、空載對(duì)照組及過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的IC50 值分別為（15.26±2.13）μg/mL、（15.65±2.02）μg/mL 及（5.56±0.71）μg/mL。空白對(duì)照組與空載對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而與空載對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞IC50 明顯降低（F=32.24，P＜0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 DOC處理后各組細(xì)胞活力曲線（注：n=6）

2.3 DOC 處理后各組細(xì)胞貼壁存活率差異 溶劑聚山梨酯-80（1‰）處理對(duì)各組細(xì)胞無(wú)明顯影響。以DOC（5.56 μg/mL）處理細(xì)胞24 h 后，空白對(duì)照組與空載對(duì)照組貼壁存活率無(wú)明顯差異；與空載對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞貼壁存活率明顯降低（F=123.5，P=0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 DOC處理后各組細(xì)胞貼壁存活率（注：*P＜0.01，# P＜0.05，△P＜0.05。n=3）

2.4 各組細(xì)胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表達(dá)變化 Western blot 結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與空載對(duì)照組p-EGFR 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而與空載對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞p-EGFR 蛋白表達(dá)明顯降低（F=85.32，P＜0.001）?？瞻讓?duì)照組與空載對(duì)照組p-AKT 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而與空載對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞p-AKT 蛋白表達(dá)明顯降低（F=90.66，P＜0.001）。免疫熒光結(jié)果顯示，與空載對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞p-EGFR 和p-AKT 熒光強(qiáng)度明顯降低（F=44.73，P＜0.001；F=52.47，P＜0.001），空白對(duì)照組和空載對(duì)照組無(wú)明顯差異。

3 討論

miR-122a 在調(diào)節(jié)糖尿病代謝、腸上皮通透性以及生殖細(xì)胞行為等方面發(fā)揮著重要作用［4］。研究報(bào)道，miR-122a 常在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，并具有抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)功能［5］。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-122a 可靶向細(xì)胞周期蛋白G1 并下調(diào)后者的蛋白表達(dá)水平，從而影響正常的癌細(xì)胞周期進(jìn)程［6］。提示miR-122a 可能作為一種抑癌信號(hào)分子參與惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)展。

喉癌作為難治性惡性腫瘤，目前化療仍是其主要治療手段之一。然而，部分喉癌患者常對(duì)某些化療藥物（如DOC）不敏感，這限制了一些化療方案的應(yīng)用。因此，如何解決喉癌對(duì)化療藥物的敏感性具有重要的臨床意義。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染法成功構(gòu)建了miR-122a 過(guò)表達(dá)的喉癌Hep-2 細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)DOC 對(duì)細(xì)胞的IC50 顯著下降，同時(shí)DOC 處理后細(xì)胞貼壁存活率明顯減少。提示過(guò)表達(dá)miR-122a 可增強(qiáng)Hep-2 細(xì)胞對(duì)DOC 的敏感性。

表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是受體酪氨酸激酶的家族成員，表達(dá)于細(xì)胞膜，通過(guò)與配體結(jié)合而磷酸化激活［7］。EGFR 在多種細(xì)胞行為中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞代謝、遷移、周期調(diào)控等［7］?；罨腅GFR 能進(jìn)一步磷酸化激活下游相關(guān)激酶通路，如MAPK、Akt 和JNK 通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖［8］。研究顯示，外源性干擾EGFR蛋白表達(dá)可明顯增強(qiáng)肺癌A549細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性［9］。提示抑制EGFR 與腫瘤細(xì)胞化療增敏有關(guān)。本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-122a 過(guò)表達(dá)后Hep-2 細(xì)胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。提示miR-122a 能抑制EGFR-AKT 信號(hào)通路活化，這可能是Hep-2 細(xì)胞對(duì)DOC 敏感性增強(qiáng)的潛在分子機(jī)制。

綜上所述，miR-122a 可能通過(guò)抑制EGFR-AKT 信號(hào)通路增強(qiáng)Hep-2 細(xì)胞對(duì)DOC 的敏感性。本研究揭示了miR-122a 在喉癌細(xì)胞DOC 增敏中的可能機(jī)制，為臨床治療提供了一定的理論支持。但miR-122a 的下游信號(hào)機(jī)制還不夠完善，有待于進(jìn)一步研究。