王 旭,徐 靜,滑 芳,王玉凈,都治香

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,河北 石家莊 050031)

宮頸癌(cervical cancer,CC)是常見的女性癌癥之一[1]。研究證實,在大多數(shù)宮頸癌病例中發(fā)現(xiàn)了人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染[2],雖然HPV疫苗的出現(xiàn)降低了感染發(fā)生率,宮頸癌早期診斷的治療效果有所提高,但在晚期和預(yù)防化療耐藥發(fā)展方面仍存在許多挑戰(zhàn)[3]。研究發(fā)現(xiàn),包括非編碼RNA在內(nèi)的其他輔助因子,已經(jīng)證實與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān),因此探究其他基因變異對于了解子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作為一種非編碼RNA,與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)lncRNA異常表達(dá)可誘發(fā)癌變,并與癌癥患者預(yù)后不良有關(guān)。易彬彬等[4]研究發(fā)現(xiàn),HOTAIR與宮頸癌易感性相關(guān);邵學(xué)成等[5]研究發(fā)現(xiàn),HOTAIR,ANRIL,H19多種lncRNAs在宮頸癌中異常表達(dá),并與其發(fā)病機(jī)制相關(guān)。lncRNA核仁小分子宿主基因12(small nucleolar host gene12,SNHG12)位在染色體1p35.3區(qū)域,抑制SNHG12通過阻斷G0/G1期細(xì)胞周期進(jìn)程可抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力[6];在結(jié)直腸癌中,SNHG12可以充當(dāng)miR-16的海綿促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移[7];SNHG12還可以在肝癌、肺癌等多種癌癥中促進(jìn)腫瘤生長[8-9]?，F(xiàn)階段SNHG12在宮頸癌中的作用上尚不明確。本研究旨在闡述體內(nèi)外試驗中SNHG12對宮頸癌SiHa細(xì)胞的部分生物行為調(diào)控能力,參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2018年6月—2021年5月于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院經(jīng)病理確診的宮頸癌患者45例,年齡(48.82±13.26)歲,收集手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本及癌旁正常組織。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 本研究所用HaCaT,C33A,SiHa和CasKi細(xì)胞株,培養(yǎng)液:RPMI 1640并添加10%胎牛血清,抗生素100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。功能性試驗選取SiHa細(xì)胞,將SiHa細(xì)胞分為NC組,SNHG12組,siNC組和SNHG12 siRNA組,應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000試劑,SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染SNHG12過表達(dá)質(zhì)粒,SNHG12 siRNA以及對應(yīng)的陰性對照。

1.3RNA提取及實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 使用Trizol從SiHa細(xì)胞系或河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收集的宮頸癌組織樣本中提取總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA,進(jìn)行試驗。試驗結(jié)果以2-△△CT值形式表示。

1.4CCK8試驗 將NC組、SNHG12組、siNC組、SNHG12 siRNA組SiHa細(xì)胞接種于96孔板,參照CCK-8試劑盒操作說明書指示進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗檢測,37 ℃孵育1～2 h,將其置于酶聯(lián)免疫檢測儀上,在450 nm下測量吸光。

1.5流式細(xì)胞法 將NC組、SNHG12組、siNC組、SNHG12 siRNA組SiHa細(xì)胞收集于5 mL流式離心管中,4 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定各組宮頸癌SiHa細(xì)胞1 h。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.6Transwell試驗 SiHa細(xì)胞Matrigel膠對小室包被,將各組SiHa細(xì)胞懸液200 μL置于Transwell上室,下室加入600 μL10%胎牛血清培養(yǎng)基,恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出腔室后,將小室用95%乙醇中固定10 min。0.5%結(jié)晶紫染色10 min,輕拭去Transwell小室上層細(xì)胞,顯微鏡觀察下層細(xì)胞。

1.7細(xì)胞劃痕試驗 NC組、SNHG12組、siNC組、SNHG12 siRNA組SiHa細(xì)胞置于6孔板上,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時,200 μL移液器槍頭在正中央位置劃一直線,形成單層細(xì)胞間劃痕,分別觀察SiHa細(xì)胞顯微鏡下切片。

1.8Tunel試驗 在4%多聚甲醛中固定NC組,SNHG12組、siNC組、SNHG12 siRNA組宮頸癌SiHa細(xì)胞30～60 min,0.3% H2O2孵育(37 ℃,20 min),50 μL生物素標(biāo)記液孵育(37 ℃,60 min)。0.1～0.3 mL標(biāo)記反應(yīng)終止液,37 ℃孵育10 min,50 μL Streptavidin-HRP工作液,37 ℃,30 min,滴加0.2～0.5 mL DAB顯色液,用蘇木素染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色。95%乙醇脫水5 min,100%乙醇脫水2次(3 min/次),甲苯透明2次(5 min/次),顯微鏡下觀察切片。

1.9動物模型 BALB/c裸鼠24只,6～8周,體重13～19 g,隨機(jī)分為NC組,SNHG12組,siNC組,SNHG12 siRNA組,每組6只。SiHa細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染SNHG12過表達(dá)質(zhì)粒,SNHG12 siRNA以及對應(yīng)的陰性對照,1 mL注射器將轉(zhuǎn)染好的SiHa細(xì)胞懸液注射到各組裸鼠右后肢腋部皮下(1×106個/只),21 d建模成功。

1.10免疫組織化學(xué) 將小鼠宮頸癌組織切片脫蠟入水,加熱修復(fù)抗原,5%正常羊血清封閉(37 ℃,60 min)。1∶100比例稀釋的Ki67抗體,4 ℃過夜。加入兔二抗(1∶200),37 ℃孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37 ℃,30 min。DAB顯色,蘇木精染色2 min,脫水,封片。

1.11統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1SNHG12在宮頸癌組織和多種細(xì)胞株中表達(dá) qRT-PCR檢測SNHG12在宮頸癌組織中的表達(dá),宮頸癌組織中SNHG12mRNA相對表達(dá)顯著高于癌旁組織(2.58±0.21vs.1.01±0.10,t=45.280,P<0.001), 同時在相比正常細(xì)胞HaCaT,SNHG12在宮頸癌細(xì)胞株C33A、SiHa和CasKi中表達(dá)水平也均顯著升高,其中在SiHa細(xì)胞中表達(dá)量最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。后續(xù)細(xì)胞試驗以SiHa為目標(biāo)細(xì)胞。提示SNHG12異常表達(dá)的變化情況可能和宮頸癌有關(guān)。

表1 SNHG12在宮頸癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)Table 1 Expression of SNHG12 in cervical cancer tissues and cell lines

2.2SNHG12調(diào)控SiHa細(xì)胞增殖和周期 將SNHG12或siSNHG12轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞后,采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),相比NC組,SNHG12或siSNHG12的表達(dá)水平顯著升高或降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。證明轉(zhuǎn)染成功。采用CCK8法檢測SNHG12對SiHa細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SNHG12組SiHa細(xì)胞的增殖顯著增加,而siSNHG12組SiHa細(xì)胞增殖能力降低。采用流式細(xì)胞法檢測發(fā)現(xiàn),SNHG12組能促進(jìn)S期阻滯,而siSNHG12組則產(chǎn)生了相反的結(jié)論,可抑制SiHa細(xì)胞的增殖以及S期阻滯,提示SNHG12能對SiHa細(xì)胞增殖和周期具有一定的調(diào)控能力。見表2,3。

2.3SNHG12調(diào)控SiHa細(xì)胞的侵襲、遷移及凋亡 Transwell試驗檢測SNHG12對SiHa細(xì)胞侵襲的能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比,SNHG12組能促進(jìn)SiHa細(xì)胞侵襲的能力,細(xì)胞穿孔數(shù)明顯增加。而siSNHG12組,細(xì)胞穿孔數(shù)顯著降低,抑制了SiHa細(xì)胞的侵襲能力(圖1A)。Tunel細(xì)胞凋亡試驗結(jié)果顯示,SNHG12組的SiHa細(xì)胞凋亡率顯著減少,siSNHG12組促進(jìn)了SiHa細(xì)胞凋亡(圖1B)。細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果顯示,SNHG12組促進(jìn)SiHa細(xì)胞的遷移率,siSNHG12組抑制SiHa細(xì)胞的遷移能力(圖1C)。提示SNHG12能調(diào)控SiHa細(xì)胞的部分生物行為。

表2 SNHG12對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖和周期影響Table 2 Effects of SNHG12 on proliferation and cycle of cervical cancer SiHa cells

表3 siSNHG12對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖和周期影響Table 3 Effects of siSNHG12 on proliferation and cycle of cervical cancer SiHa cells

圖1 SNHG12調(diào)控SiHa細(xì)胞的侵襲、遷移及凋亡

2.4構(gòu)建宮頸癌裸鼠通過體內(nèi)試驗檢測增殖情況 利用SiHa細(xì)胞構(gòu)建了宮頸癌小鼠模型,21 d后剝離瘤體稱重并選取組織進(jìn)行切片,結(jié)果顯示,SNHG12組腫瘤重量高于NC對照組,而SiSNHG12組腫瘤重量低于SiNC對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明表達(dá)SNHG12促進(jìn)了裸鼠腫瘤生長,而干擾SNHG12則相反抑制了腫瘤生長,見表4,5。Ki67試驗檢測皮下宮頸癌細(xì)胞核中陽性染色細(xì)胞所占的百分比,結(jié)果顯示,上調(diào)SNHG12的陽性信號顯著高于正常對照組,下調(diào)SNHG12則結(jié)論相反(圖2),提示SNHG12能在體內(nèi)試驗中加強(qiáng)增殖能力,促進(jìn)腫瘤生長,而通過RNA干擾技術(shù),則能產(chǎn)生則能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。

表4 SNHG12組腫瘤重量Table 4 Tumor weights of SNHG12 group

表5 siSNHG12組腫瘤重量Table 5 Tumor weights of siSNHG12 group

圖2 Ki67檢測小鼠腫瘤增殖(蘇木精染色,Scale bar=50 μm,×200)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示,在宮頸癌組織和細(xì)胞中,SNHG12異常高表達(dá),過表達(dá)SNHG12能促進(jìn)宮頸癌SiHa惡性生物學(xué)行為,而干擾SNHG12則出現(xiàn)了相反的結(jié)論,隨后構(gòu)建動物模型進(jìn)行驗證,發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)試驗中SNHG12能加強(qiáng)增殖能力,促進(jìn)腫瘤生長,而通過RNA干擾技術(shù),沉默SNHG12后則能產(chǎn)生抗宮頸癌的調(diào)控機(jī)制,充分說明SNHG12促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞SiHa細(xì)胞增殖、周期、侵襲、遷移及抑制凋亡,參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

宮頸癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),lncRNA UCA1在宮頸癌組織中表達(dá)升高,UCA1水平高的患者生存時間短,并通過細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)Lnc-RNA UCA1通過靶向miR-155調(diào)控宮頸癌細(xì)胞EMT的發(fā)生[10]。LncRNA TP73-AS1宮頸癌細(xì)胞中上調(diào),并能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力,進(jìn)一步的挽救試驗證實TP73-AS1通過miR-329-3p/ARF1調(diào)控宮頸細(xì)胞的增殖和遷移,TP73-AS1可能成為一種新的宮頸癌調(diào)控因子[11]。LncRNA SOX2OT通過調(diào)控SOX2影響宮頸癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[12]。有多種lncRNAs與宮頸癌發(fā)病機(jī)制相關(guān),但現(xiàn)階段SNHG12在宮頸癌中的相關(guān)作用機(jī)制暫未發(fā)現(xiàn)。

SNHG12作為一種新型lncRNA,近年來已發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中呈現(xiàn)異常高表達(dá)[13],比如SNHG12在卵巢癌組織中表達(dá)高于正常組織,同時高水平SNHG12卵巢癌患者的5年生存率明顯低于低水平組[14]。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA SNHG12通過海綿細(xì)胞miR-133b調(diào)控前列腺癌的預(yù)后并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)SNHG12通過激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)胃癌發(fā)生。本研究中,發(fā)現(xiàn)SNHG12在宮頸癌組織和C33A、SiHa和CasKi等多種細(xì)胞株均高表達(dá),說明SNHG12異常表達(dá)的變化情況可能和宮頸癌有密切關(guān)系。

相比較宮頸癌細(xì)胞C33A和CasKi,SNHG12在SiHa細(xì)胞表達(dá)最高,因此后續(xù)細(xì)胞試驗以SiHa為目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行功能性試驗,發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG12促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖、周期、侵襲、遷移及抑制凋亡,而干擾SNHG12則出現(xiàn)了相反的結(jié)論,可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、周期、侵襲、遷移并促進(jìn)凋亡。說明SNHG12能夠調(diào)控宮頸癌SiHa細(xì)胞的部分生物行為,參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[17-19]。為了驗證細(xì)胞試驗的結(jié)論,利用SiHa細(xì)胞構(gòu)建宮頸癌裸鼠移植瘤模型,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SNHG12促進(jìn)了裸鼠腫瘤生長,干擾SNHG12則抑制了腫瘤生長。上調(diào)SNHG12的陽性信號顯著高于正常對照組,而下調(diào)SNHG12則結(jié)論相反,提示SNHG12能加強(qiáng)增殖能力,促進(jìn)腫瘤生長,而通過RNA干擾技術(shù),沉默SNHG12后則能產(chǎn)生抗宮頸癌的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述,SNHG12促進(jìn)SiHa細(xì)胞增殖、周期、侵襲、遷移及抑制凋亡,參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。因此SNHG12可能成為宮頸癌診斷及治療的新靶點。