陳博倫，楊倩，石華堂，陳新華，李軼聰

（1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊第962醫(yī)院 麻醉科，黑龍江 哈爾濱 150080）

瑞馬唑侖是一種新型的苯二氮?類藥物，與丙泊酚等靜脈鎮(zhèn)靜藥物相比，具有起效快、副作用小、血流動力學(xué)穩(wěn)定、清除時間短、呼吸抑制輕微等的優(yōu)點［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，除鎮(zhèn)靜作用外，瑞馬唑侖還能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡［3］，對神經(jīng)性疼痛也具有緩解作用［4］，但其具體機制仍不明確。炎癥反應(yīng)是引起包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的基礎(chǔ)，在腫瘤的病理生理中發(fā)揮重要作用［5］。過量的炎性細胞因子有助于惡性細胞的增殖和生存，擴大炎癥反應(yīng)，促進腫瘤細胞的生存，最終促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［6-7］。因此，本研究通過將瑞馬唑侖作用于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC-12，觀察瑞馬唑侖對神經(jīng)細胞瘤炎癥和凋亡的影響，為瑞馬唑侖的臨床應(yīng)用提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑和儀器

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC-12 來源中國科學(xué)院上海細胞庫。F12K、胎牛血清購于Gibco公司，Donor Equine Serum 馬血清購于HyClone 公司，瑞馬唑侖購于江蘇恒瑞公司，PBS、0.25%胰蛋白酶、細胞活力檢測試劑盒（CCK-8）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA（強）組織細胞快速裂解液、十二烷基硫酸鈉（SDS）購于solarbio 公司，AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購于BD 公司，大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒、兔抗Bcl-2、Bax 和辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）購于Bioswamp 公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑購于millipore 公司。

1.2 主要儀器

二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱購于Thermo 公司，倒置熒光顯微鏡購于Leica 公司，酶標儀購于杭州奧盛，流式細胞儀購于艾森公司，電泳儀購于BIO-RAD 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及分組 PC-12 細胞用含5%胎牛血清（FBS）和10% 馬血清（HS）的F12K 培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達到80%以上時，用0.25%胰酶消化，按照1∶2 傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期的細胞進行后續(xù)實驗。將細胞分成5 組：對照組（瑞馬唑侖0 μmol/L）、25 μmol/L 組（瑞馬唑侖25 μmol/L）、50 μmol/L組（瑞馬唑侖50 μmol/L）、125 μmol/L 組（瑞馬唑侖125 μmol/L）、250 μmol/L 組（瑞馬唑侖250 μmol/L）。

1.3.2 CCK8 檢測細胞存活率 收集細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，接種于96 孔板，使每孔3×103個細胞，過夜培養(yǎng)使細胞貼壁，不同濃度的瑞馬唑侖處理PC-12 細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，取出培養(yǎng)板每孔加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)4 h 后檢測450 nm 處的吸光值。

1.3.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 不同濃度的瑞馬唑侖處理PC-12 細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后收集細胞，取1×106個培養(yǎng)基重懸的細胞，400 g，4℃離心5 min，棄上清后加入1 mL 預(yù)冷的PBS，輕輕吹打混勻，400 g，4℃離心5 min，棄上清，用200 μL PBS 重懸細胞，加入10 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，混勻后4℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS，隨即進行流式檢測，利用NovoExpress 分析軟件對結(jié)果進行分析。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 收集不同濃度和處理時間瑞馬唑侖處理后的PC-12 細胞，嚴格按照試劑盒說明書檢測各組細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的水平，每組設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3.5 Western blot 檢測凋亡蛋白Bcl-2 和Bax 的表達 收集不同濃度和處理時間瑞馬唑侖處理后的PC-12 細胞，吸去培養(yǎng)液，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，充分裂解后，4℃12 000 g 離心15 min，取上清用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，每孔上樣量為20 μg 蛋白，12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），結(jié)束后濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入一抗稀釋液（1∶1 000），室溫孵育1 h，PBST 洗滌5 min，洗滌3 次后加入二抗稀釋液（1∶20 000），室溫孵育1 h，PBST 洗滌3 次后增強型化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影，全自動化學(xué)發(fā)光分析儀檢測，TANON GIS 軟件讀取灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瑞馬唑侖抑制PC-12 細胞增殖

隨著瑞馬唑侖濃度的升高，PC-12 細胞的增殖能力不斷降低，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。所有瑞馬唑侖處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明瑞馬唑侖能夠抑制PC-12 細胞增殖。見表1。

表1 各組細胞增殖能力的比較（）

表1 各組細胞增殖能力的比較（）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

2.2 瑞馬唑侖對PC-12 細胞炎癥因子水平的影響

與對照組相比，其他四組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），呈現(xiàn)劑量和時間效應(yīng)關(guān)系，瑞馬唑侖濃度越高處理時間越長，IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平越高，說明瑞馬唑侖能夠升高PC-12 細胞炎癥因子水平，促進炎癥反應(yīng)。見表2。

表2 各組細胞炎癥因子水平的比較（,pg/mL）

表2 各組細胞炎癥因子水平的比較（,pg/mL）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

2.3 瑞馬唑侖促進PC-12 細胞凋亡

與對照組相比，所有瑞馬唑侖處理組的細胞凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且細胞凋亡率隨著瑞馬唑侖濃度的升高和作用時間的延長而不斷升高，說明瑞馬唑侖能夠促進PC-12細胞凋亡。見圖1 和表3。

圖1 瑞馬唑侖對PC-12 細胞凋亡的影響

表3 各組細胞凋亡率的比較（,%）

表3 各組細胞凋亡率的比較（,%）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

2.4 瑞馬唑侖對PC-12 細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2 表達的影響

結(jié)果顯示，瑞馬唑侖處理后PC-12 細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax 的表達水平顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達水平顯著降低，且均具有濃度依賴性。提示瑞馬唑侖可通過誘導(dǎo)PC-12 細胞內(nèi)Bax蛋白表達，抑制Bcl-2 蛋白表達來促進凋亡。見圖2和表4。

圖2 瑞馬唑侖對PC-12 細胞Bax 和Bcl-2 蛋白表達的影響

表4 各組細胞Bax、Bcl-2 蛋白水平比較

3 討論

瑞馬唑侖是一種新型鎮(zhèn)定藥物，自2020 年12 月在中國被國家藥品監(jiān)督管理局批準使用以來，瑞馬唑侖廣泛地應(yīng)用于成人全身麻醉和ICU 鎮(zhèn)靜［8］。除鎮(zhèn)靜作用外，瑞馬唑侖還具有抑制腫瘤的作用，XU 等［3］發(fā)現(xiàn)瑞馬唑侖能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞生長，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究表明，瑞馬唑侖能夠顯著抑制PC-12 細胞的增殖，表明瑞馬唑侖具有抑制神經(jīng)細胞瘤的作用。TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子作為免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤復(fù)雜的病理生理機制中發(fā)揮著重要作用［9］。炎癥介質(zhì)和細胞效應(yīng)因子是腫瘤局部環(huán)境的重要組成部分，有助于惡性細胞的增殖和生存，促進血管生成和轉(zhuǎn)移，破壞適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并改變對激素和化療藥物的反應(yīng)［10-11］。我們檢測了瑞馬唑侖對PC-12 細胞炎癥因子表達的影響，結(jié)果顯示瑞馬唑侖能夠促進炎性因子TNF-α、IL-6 和IL-1β的釋放，提示瑞馬唑侖誤導(dǎo)細胞凋亡在多細胞生物中是一個高度受控的生理過程，凋亡異常會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生［12］。細胞凋亡缺陷與多種疾病相關(guān)，包括自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、心臟病和癌癥等［13］。研究表明，凋亡細胞的快速清除是誘導(dǎo)免疫耐受和預(yù)防炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。生理條件下，正常組織中游離的凋亡細胞很少。然而，吞噬細胞攝取死亡細胞的效率低下或凋亡率增加會導(dǎo)致游離凋亡細胞的繼發(fā)性壞死，從而誘導(dǎo)促炎細胞因子的分泌［14］。本研究結(jié)果顯示，瑞馬唑侖處理后，PC-12 細胞的凋亡率顯著升高，表明瑞馬唑侖能夠誘導(dǎo)PC-12 細胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

Bcl-2 蛋白家族因其異常表達會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生而成為重要的藥物靶點［15］。Bcl-2 是Bcl-2家族中的抗凋亡因子，對許多細胞系的誘導(dǎo)凋亡具有保護作用，而家族中的其他蛋白質(zhì)如Bax 具有相反的效果，能夠促進細胞凋亡［16］。研究表明，Bcl-2 可以與其他蛋白質(zhì)如Bax 相互作用形成異二聚體，Bax 在細胞中的表達可以抵消Bcl-2 的作用［17］。本研究結(jié)果顯示，瑞馬唑侖能夠上調(diào)PC-12 細胞中促凋亡蛋白Bax 的表達，并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，提示瑞馬唑侖可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達促進PC-12 凋亡，這與YANG等［18］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，瑞馬唑侖可誘導(dǎo)PC-12 細胞的炎癥反應(yīng)，并能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達促進PC-12 凋亡。