夏小東,張曉波,施勇烽,許如根

(1.揚州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,江蘇 揚州 225009; 2.中國水稻研究所,浙江 杭州 311401)

水稻全基因組測序完成極大地推動了功能基因組學(xué)研究。水稻突變體作為重要的遺傳材料,在水稻功能基因組學(xué)研究中,發(fā)揮了重要作用。葉片是水稻進行光合作用的主要場所,水稻葉色突變包括黃化、白化、條紋、淡綠等,研究者通過物理誘變和化學(xué)誘變等方法處理水稻,獲得了大量的葉色突變體。對水稻葉色突變體的研究有助于對葉片光合作用機制的剖析。衰老是植物生長發(fā)育必經(jīng)階段,主要由內(nèi)部和外部信號所引發(fā),且伴隨著生理生化的改變,而早衰是非正常的衰老,往往會對植物造成傷害,產(chǎn)生斑點葉和黃化等表型,導(dǎo)致作物籽粒最終產(chǎn)量損失,品質(zhì)下降。

水稻致死突變體主要包括葉色突變體和早衰突變體兩大類。目前,國內(nèi)外的科學(xué)家克隆了大量葉色基因,這些基因主要涉及葉綠素合成與代謝、葉綠體發(fā)育等。水稻早衰表現(xiàn)出葉綠素降解、光合作用速率下降、細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞、活性氧大量積累,甚至抗氧化酶活性降低等生理特性變化[1],使植物細(xì)胞死亡,植物器官或組織凋零,最終導(dǎo)致植株過早衰老甚至死亡。水稻中的轉(zhuǎn)錄因子、激素代謝、蛋白質(zhì)代謝等途徑都可能影響早衰的發(fā)生。延遲葉片衰老對產(chǎn)量和品質(zhì)有積極作用。

1 水稻白化致死突變基因的克隆

水稻葉片白化致死基因很多,包括細(xì)胞核基因、細(xì)胞質(zhì)基因和核-質(zhì)互作基因,多數(shù)突變由1對隱性核基因控制。截至2022年4月,有127個控制水稻葉色的基因被克隆,其中,葉片白化致死基因有13個,分布在第1、2、3、5、6、7、9、10、11號染色體上(表1)。

表1 已克隆的水稻白化致死基因Table 1 Albino lethal genes cloned from rice

2 水稻白化致死突變基因的分子調(diào)控機制

2.1 參與光合色素生物合成與降解

植物的光合作用在葉綠體中完成,需要葉綠素(包括葉綠素a和葉綠素b)和類胡蘿卜素的參與。葉綠素合成始于谷氨酰-tRNA,終于葉綠素a和b的合成,需要27個基因編碼的15種酶參與[14]。葉綠素的生物合成主要包括2個過程:一是由δ-氨基乙酰丙酸在葉綠體基質(zhì)生成原卟啉Ⅸ(protoporphyrin Ⅸ);二是由原卟啉Ⅸ與鎂離子螯合,經(jīng)過多個膜結(jié)合酶催化反應(yīng)生成葉綠素[15]。鎂離子螯合酶是一個依賴ATP的異源聚合酶,由I(40 ku)、D(70～80 ku)和H(140 ku)3個亞基組成,突變植株葉片呈現(xiàn)黃化[16]或者白化表型[17],甚至導(dǎo)致植株死亡。Zhang等[17]對一個葉綠素缺乏的突變體——白化葉致死突變體(ell)進行了研究,突變體葉綠素含量約為野生型的1%,葉綠體發(fā)育完全受阻,未見類囊體結(jié)構(gòu);并在OsCHLI(鎂螯合酶Ⅰ亞基編碼基因)中發(fā)現(xiàn)1個單堿基突變,導(dǎo)致1個高度保守區(qū)域的氨基酸發(fā)生改變;突變體中原卟啉Ⅸ含量較高,而鎂原卟啉Ⅸ含量較低,引入外源OsCHLI基因能夠恢復(fù)突變體葉綠體損傷;突變引起了光合作用相關(guān)的核和質(zhì)體基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào),阻斷了OsCHLI和OsCHLD之間的內(nèi)在相互作用;此外,OsCHLI還與硫氧還蛋白(TRXs)發(fā)生物理作用,表明在單子葉和雙子葉植物中Mg-螯合酶活性具有相似的調(diào)節(jié)機制。

八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)、ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)、類胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISO)和番茄紅素β-羥化酶(β-LCY)是水稻類胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[11,18]。ALE1編碼一個ζ-胡蘿卜素脫氫酶,參與類胡蘿卜素的生物合成,在水稻葉綠體發(fā)育和植株生長中起著重要作用[11]。ale1突變體葉片呈現(xiàn)白化表型,葉綠體類囊體發(fā)育不良,光合色素含量下降,活性氧積累,導(dǎo)致ale1在3周內(nèi)死亡。

2.2 葉綠體發(fā)育相關(guān)基因

葉綠體是植物進行光合作用的主要場所,是一種含有遺傳物質(zhì)的半自主細(xì)胞器,由雙層膜包裹的前質(zhì)體發(fā)育而來。葉綠體的發(fā)育通常包括質(zhì)體的復(fù)制和質(zhì)體DNA合成、葉綠體遺傳系統(tǒng)建立、葉綠體光合作用系統(tǒng)建立3個階段,任何階段表達異常都有可能造成葉綠體發(fā)育異常,甚至導(dǎo)致植株死亡。

2.2.1 質(zhì)體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物參與葉綠體的發(fā)育

科學(xué)家已經(jīng)在水稻中鑒定了一些質(zhì)體基因編碼的RNA聚合酶(plastid-encoded RNA polymerase,PEP)復(fù)合物,這類質(zhì)體RNA聚合酶是成熟葉綠體中占主導(dǎo)地位的RNA聚合酶,由核心亞基和外周亞基組成,外周亞基在PEP活性控制中具有重要作用。WSL3基因編碼水稻PEP復(fù)合物關(guān)鍵外周亞基OsPAP1/OspTAC3,水稻wsl3突變體缺乏1個外圍亞基,白化致死,表現(xiàn)出典型的質(zhì)體編碼基因表達模式,提示PEP活性受損,WSL3定位于葉綠體,與PEP復(fù)合物亞基相互作用,對葉綠體的早期發(fā)育至關(guān)重要[13]。OspTAC2編碼一個含有10個PPR(pentatricopeptide repeat)結(jié)構(gòu)域的葉綠體蛋白,在葉綠體發(fā)育中起關(guān)鍵作用,osptac2突變體呈現(xiàn)白化表型,苗期致死[5]。ASL3編碼一個具有10個PPR基序的水稻PPR蛋白,定位于葉綠體,在水稻的早期發(fā)育和葉綠體發(fā)育中起重要作用,水稻PPR突變體asl3苗期白化致死,asl3突變嚴(yán)重影響了相關(guān)重要基因的轉(zhuǎn)錄水平、質(zhì)體的翻譯和光合作用,最終導(dǎo)致asl3突變體幼苗死亡[4]。OsPPR6基因位于第5染色體,編碼一個定位于質(zhì)體上的PPR蛋白,OsPPR6通過參與質(zhì)體基因編碼的ndhB轉(zhuǎn)錄本編輯和ycf3轉(zhuǎn)錄本剪接,調(diào)控水稻早期葉綠體生物合成;osppr6突變體不能形成類囊體膜,表現(xiàn)出葉綠體早期發(fā)育缺陷,幼苗白化死亡[8]。OsPPR1是核基因,編碼PPR蛋白,可能參與葉綠體的形成;OsPPR1主要在水稻葉片中積累,反義轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出典型的葉綠素缺陷型突變型,白化致死[12]。OsTRXz編碼一個Z型硫氧還蛋白,OsTRXz與2個果糖激酶FLN1 和HSA1/FLN2 互作,參與PEP 復(fù)合物的形成;Ostrxz突變體表現(xiàn)為葉片白化致死[19]。tcm1突變體在低溫(20 ℃)下三葉期前表現(xiàn)為白化表型,葉綠體畸形,但在較高溫度(>28 ℃)下為正常表型,質(zhì)體編碼依賴聚合酶(PEP)的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào),在高溫下能部分恢復(fù),這表明TCM1編碼一個染色體轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物(transcriptionally active chromosome,TAC)的葉綠體蛋白,水稻核編碼TAC的TCM1蛋白是葉綠體正常發(fā)育和低溫脅迫下保持PEP活性所必需的[20]。水稻LAS1/OsHMBPP編碼HMBPP還原酶,參與催化甲基-D-赤蘚醇磷酸鹽(MEP)轉(zhuǎn)化為IPP和DMAPP,影響葉綠體核糖體的生物合成,最終影響葉綠體的發(fā)育,水稻突變體las1幼苗白化致死;可見,LAS1/OsHMBPP在水稻葉綠體早期發(fā)育中發(fā)揮了重要作用[6]。核糖體在葉綠體中負(fù)責(zé)質(zhì)體編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯,是葉綠體發(fā)育和植物生長所必需的;水稻ASL4編碼的30S核糖體蛋白S1定位于葉綠體,對葉綠體核糖體的合成和葉綠體的早期發(fā)育至關(guān)重要[7]。

2.2.2 轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控葉綠體發(fā)育

植物中參與質(zhì)體基因轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白主要有PPR蛋白、MORF(multiple organellar RNA editing factor)蛋白和一些質(zhì)體基因剪切因子[14]。分子克隆結(jié)果表明,AL2編碼水稻葉綠體內(nèi)IIA型內(nèi)含子剪接促進因子(CRS1),AL2也可能參與葉綠體I型內(nèi)含子的剪接,破壞AL2的表達導(dǎo)致葉綠體合成相關(guān)基因的表達改變,包括葉綠素生物合成基因、質(zhì)體編碼聚合酶和核編碼的葉綠體基因,影響多個質(zhì)體基因內(nèi)含子剪切;al2突變體早期發(fā)育階段葉綠體結(jié)構(gòu)即遭到破壞,導(dǎo)致整個葉綠體分解,該突變體在發(fā)育早期形成明顯的白化葉片表型,最終在幼苗期死亡[21]。OsCAF1編碼一個含有CRM結(jié)構(gòu)域的葉綠體蛋白,參與atpF、ndhA、ndhB、rpl2、rps12、ycf3共6個質(zhì)體基因內(nèi)含子剪切,OsCAF1的C末端與OsCRS2相互作用,OsCAF1-OsCRS2復(fù)合物可能參與水稻葉綠體中IIA型和IIB型內(nèi)含子的剪接;oscaf1突變體葉肉細(xì)胞中的葉綠體數(shù)量減少,葉綠體結(jié)構(gòu)受損,呈現(xiàn)白化表型,并在苗期死亡[3]。

2.2.3 核質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與質(zhì)體發(fā)育

質(zhì)體代謝與發(fā)育狀態(tài)若發(fā)生改變,質(zhì)體與細(xì)胞核之間的信號傳遞反饋使細(xì)胞核能夠隨之做出相應(yīng)的反應(yīng),從而調(diào)控細(xì)胞核基因的表達。OsGUN4可以與水稻鎂離子螯合酶H亞基結(jié)合,參與由原卟啉合成鎂原卟啉的生物過程,從而調(diào)控葉綠素的生物合成,同時,鎂-原葉琳IX也是質(zhì)體與細(xì)胞核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的信號分子[15]。

2.2.4 葉綠體蛋白酶調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育

葉綠體蛋白酶在葉綠體的降解中起到了不可替代的作用。葉綠體光系統(tǒng)蛋白的降解需要SPP(stromal processing peptidase,基質(zhì)加工肽酶)與TPR(thylakoid processing peptidase,類囊體加工肽酶)的參與,而葉綠體中其他蛋白的降解主要依賴于FtsH(filamentous temperature sensitive protein H, 絲狀溫度敏感蛋白H)和Clp(caseinolytic protease)。質(zhì)體核糖體蛋白(PRPs)在質(zhì)體蛋白生物合成、葉綠體分化和葉綠體早期發(fā)育中起著重要作用。水稻ASL2基因編碼葉綠體核糖體大亞基一個重要組分——50S核糖體蛋白L21(RPL21c),定位于葉綠體中,受光的調(diào)控,與葉綠素的生物合成、光合作用和葉綠體發(fā)育有關(guān);水稻asl2突變體呈白化表型,苗期死亡,葉片顏色變化與葉綠素含量和葉綠體發(fā)育異常有關(guān)[22]。

2.2.5 其他葉綠體發(fā)育相關(guān)基因

葉綠體蛋白的突變可能導(dǎo)致植株葉色異常。氨酰合成酶是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵酶,RA1基因編碼甘氨酰tRNA合成酶(RA1),RA1定位于葉綠體中,參與葉綠體早期發(fā)育和核糖體的合成,缺失RA1導(dǎo)致質(zhì)體發(fā)育障礙;水稻ra1突變體在苗期表現(xiàn)為葉片白化,葉綠體發(fā)育異常,葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低,類囊體膜結(jié)構(gòu)異常,嗜鋨顆粒增加[9]。

2.3 其他途徑

葉綠體在植物碳水化合物代謝中起著至關(guān)重要的作用。水稻OsBE1基因編碼一個糖苷水解酶13家族的蛋白,osbe1突變體葉綠體數(shù)量較少,無明顯的基質(zhì)片層結(jié)構(gòu),幼苗呈現(xiàn)白化表型,且其白化表型不能用外源糖類恢復(fù),最終在三葉期死亡[10]。

3 水稻早衰致死突變的遺傳機理與基因克隆

植物衰老是一個非常復(fù)雜的過程,受內(nèi)部因素和外部環(huán)境共同影響,也受遺傳調(diào)控的負(fù)影響(圖1)[23]?？茖W(xué)家利用各種物理和化學(xué)方法,創(chuàng)造了大量水稻葉片早衰相關(guān)突變體,定位了大量葉片衰老相關(guān)基因(senescence-associated genes, SAGs),包括SMS1[24]、psl2[25]、LAD[26]、MPS1[27]、es5、g398[28]、OsLES[29]、lmes1[30]、LMES2[31]、LTS1[32]、Oswss1[33]、WL4[34]等。

圖1 水稻葉片衰老調(diào)控途徑[23]Fig.1 Mode of regulation approach in rice leaf senescence[23]

3.1 葉綠體的發(fā)育和葉綠素降解途徑調(diào)控早衰

葉綠體的發(fā)育和葉綠素降解途徑與衰老密切相關(guān)。水稻類病變和早衰突變體lms開花后加速衰老,對稻瘟病的抗性增強[35]。水稻Ospse1編碼一種果膠酸裂解酶,Ospse1突變體中與衰老相關(guān)的基因OsNYC1和OsSgr上調(diào)表達,推測ospse1的早衰可能受果膠酸裂解酶介導(dǎo)的機制調(diào)控[36]。PLS2/PSL2定位在第3染色體,編碼一個糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases,GTs);pls2突變體中PLS2第9個外顯子第41位的C→T發(fā)生替換,使精氨酸替換為半胱氨酸,突變體在孕穗期表現(xiàn)早衰,株高下降,節(jié)間和穗長縮短,光合能力降低,分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)減少,穗粒數(shù)和結(jié)實率明顯下降,千粒重降低,穗發(fā)育不良,灌漿不充分;葉片的CAT活性顯著降低,H2O2積累,死亡細(xì)胞增加,葉綠體結(jié)構(gòu)變差,葉綠體中淀粉和嗜鋨顆粒增多;黑暗處理加速突變體葉片衰老,葉綠體超微結(jié)構(gòu)球狀化[25,37-38]。SPL29編碼UDP-N-乙?；咸烟墙沽姿峄?(UAP1),UAP1參與水稻葉片衰老和防御反應(yīng)的調(diào)控,spl29突變體葉片衰老,葉綠體降解,衰老轉(zhuǎn)錄因子和衰老相關(guān)基因表達水平上調(diào),光合作用相關(guān)基因表達水平下調(diào),對白葉枯病的抗性和防御反應(yīng)基因表達水平上調(diào),植株中積累茉莉酸和脫落酸[39]。ZS編碼細(xì)胞色素單加氧酶(P450),zs突變體第2外顯子上1個堿基突變導(dǎo)致蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?該基因可能參與調(diào)控葉綠素合成和質(zhì)體的發(fā)育[40]。YPD1在葉片中優(yōu)先表達,編碼一個類LRR蛋白YPD1,YPD1定位于葉綠體膜上,可能影響葉綠體發(fā)育和葉片衰老;ypd1突變體中YPD1第13外顯子發(fā)生G→A替換,影響剪接并導(dǎo)致編碼蛋白的提前終止,造成葉綠體異常,光合色素水平降低[41]。

3.2 蛋白質(zhì)的合成、降解和轉(zhuǎn)運途徑調(diào)控早衰

科學(xué)家在水稻中發(fā)現(xiàn)了多種參與蛋白質(zhì)合成、降解、運輸途徑的基因與植物的早衰致死相關(guān)。GnT1編碼N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶,該酶功能缺失使水稻對細(xì)胞分裂素的敏感性降低,細(xì)胞分裂素信號通路受損;gnt1突變體出苗后發(fā)育不良,細(xì)胞壁生物合成不完全,導(dǎo)致分蘗失敗、葉片變脆、細(xì)胞壁厚度減少、纖維素含量降低,最終導(dǎo)致植株在早期死亡[42]。水稻衰老或接種病原體后誘導(dǎo)OsSAG12-1的表達,粳稻品種TP309中獲得的OsSAG12-1 RNAi轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出不同程度的早衰,接種細(xì)菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae時死亡細(xì)胞增多,表明OsSAG12-1編碼OsSAG12-1半胱氨酸蛋白酶前體,是水稻細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控因子[43]。Osh69編碼堿性半乳糖苷酶,在葉片自然衰老過程中上調(diào)表達,而且在黑暗、激素(茉莉酸甲酯、水楊酸)、過氧化氫脅迫下也能迅速上調(diào);Osh69特異地定位于衰老葉片的葉綠體中,在葉片衰老過程中葉綠體半乳糖脂的降解中發(fā)揮重要作用[44]。psd128突變體從六葉期開始葉片發(fā)黃發(fā)白,同時產(chǎn)生褐色斑點,抽穗期除劍葉外,其他葉片、莖稈均已枯死;LOC_Os03g05730的編碼區(qū)(CDS)中第2 347位堿基由C突變成T(C2347T),其編碼的蛋白質(zhì)比野生型減少27個氨基酸殘基;OsCDC48編碼一個AAA-ATPase酶,OsCDC48突變通過相關(guān)激素代謝途徑影響psd128突變體對白葉枯病的抗性[45-46]。RLS3編碼一個具有AAA+結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),定位于葉綠體,在維持水稻正常生長中發(fā)揮著關(guān)鍵作用;rls3突變體中RLS3基因在第10外顯子/第11外顯子的剪接位點出現(xiàn)了單核苷酸替換(G→A),導(dǎo)致第11外顯子的第1個核苷酸被剪切,使RLS3蛋白翻譯提前終止;相比野生型,rls3突變體葉片衰老速度快,株高和穗長更短,結(jié)實率低[47]。類病斑和早衰性狀均由編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶家族CYP71P1蛋白的SL基因隱性等位基因控制,分蘗期,msl-2突變體葉片出現(xiàn)較大的橙色斑點,抽穗期msl-2植株完全死亡,突變體中葉綠體降解、光合色素含量下降、葉綠體合成/光合相關(guān)基因表達下調(diào)、衰老相關(guān)基因表達上調(diào)[48]。

3.3 激素途徑調(diào)控早衰

在水稻生長發(fā)育的過程中,激素起至關(guān)重要的調(diào)控作用,水稻的衰老也受激素調(diào)控。生長素(Auxin)、赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(CTK)抑制水稻葉片衰老,而ABA、ETH、SA、JA和油菜素內(nèi)酯(BRs)的作用正好相反[49]。HD-Zip Ⅲ成員OsHox33在水稻葉片衰老中起重要作用,源自O(shè)sHox33 5′末端區(qū)域和3′-UTR的2個特定RNAi載體轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出相似的葉片早衰癥狀,表明敲除OsHox33基因促進了葉綠體降解,導(dǎo)致水稻葉片早衰;OsHox33可以調(diào)節(jié)2個衰老相關(guān)基因GS1和GS2的表達[50]。

3.4 細(xì)胞程序性死亡相關(guān)基因?qū)υ缢サ恼{(diào)控

SPL28編碼網(wǎng)格型銜接蛋白復(fù)合物1的中間亞基μ1(AP1M1),綠色熒光蛋白SPL28融合蛋白(SPL28::GFP)定位于高爾基體;SPL28似乎參與囊泡轉(zhuǎn)運的調(diào)控,SPL28功能障礙導(dǎo)致類HR病斑的形成,使葉片開始衰老;spl28突變體早期發(fā)育正常,開花后可溶性葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、光系統(tǒng)Ⅱ效率顯著降低,對稻瘟病和白葉枯病的抗性增強[51]。RLS1編碼一個含有NB(核苷酸結(jié)合位點)的蛋白,其羧基端有ARM(armadillo)結(jié)構(gòu)域,在暗誘導(dǎo)的葉片衰老過程中,RLS1表達上調(diào),說明RLS1參與葉片衰老過程并且受細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)下調(diào)表達;葉片衰老過程中葉綠素含量的快速降低是導(dǎo)致葉片衰老的主要原因。有趣的是,隨著轉(zhuǎn)基因水稻植株葉綠素含量的降低,RLS1的組成性表達也略微加速了葉片衰老;rls1突變體出現(xiàn)了類病斑,早期分散在整個葉片表面,導(dǎo)致早衰[52]。

3.5 轉(zhuǎn)錄因子對早衰的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的特異性轉(zhuǎn)錄因子家族之一,參與植物的各種生物學(xué)過程,包括植物發(fā)育、葉片衰老、細(xì)胞分裂、木材形成和生物/非生物應(yīng)激反應(yīng)[53-54],多個轉(zhuǎn)錄因子家族參與衰老調(diào)控,包括NAC、WRKY(Zn)、MYB、C2H2(Zn)、AP2/EREBP、HB、bHLH、bZIP、NAC(NAM/ATAF/CUC)等[55]。

PS1編碼一個植物特異性NAC轉(zhuǎn)錄激活因子OsNAP,過表達OsNAP顯著促進衰老,而敲除OsNAP則顯著延緩衰老。OsNAP的表達與葉片衰老的發(fā)生密切相關(guān),OsNAP通過直接靶向葉綠素降解和營養(yǎng)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因,以及其他與衰老相關(guān)的基因,正向調(diào)控葉片衰老;由ABA特異性誘導(dǎo),OsNAP對ABA生物合成反饋抑制,是ABA和葉片衰老之間的重要環(huán)節(jié);此外,OsNAP表達量減少導(dǎo)致葉片衰老延遲和籽粒灌漿期延長,使籽粒產(chǎn)量提高;推測調(diào)整OsNAP的表達是未來提高水稻產(chǎn)量的一種有效策略[56]。

3.6 早衰的其他調(diào)控基因與調(diào)控機理

Ospls1突變體早期幼苗發(fā)育正常,但其葉片表現(xiàn)出類病斑和早衰,種子休眠;編碼空泡H+-ATPase A1亞基(VHA-A1)的OsPLS1基因中的胞嘧啶缺失導(dǎo)致了該突變體的表型異常;OsPSL1/VHA-A1的轉(zhuǎn)錄水平在Ospls1突變體及其野生型中均隨葉片衰老而逐漸下降,VHA活性也顯著下降,表明正常的OSPLS1/VHA-A1基因在水稻葉片衰老開始過程中起負(fù)調(diào)控作用;Ospls1突變體中水楊酸和活性氧(ROS)含量較高,并通過上調(diào)葉片WRKY基因激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo);上述結(jié)果表明,OsPSL1/VAH-A1突變通過ROS和SA信號的組合在葉片早衰中發(fā)揮作用[57]。psls1發(fā)育到七葉期以后葉片自下而上葉綠素含量下降,葉片逐漸黃化至枯萎,由于PSLS1基因突變使得谷氨酸合酶失活,氮代謝異常而導(dǎo)致突變體psls1早衰[58]。osled突變體受到1個隱性基因調(diào)控,OsLED基因 (AK111569,LSD1相關(guān)基因)發(fā)生2個堿基(AA)缺失,造成移碼突變,該基因編碼一類鋅指蛋白LSD1;osled突變體自分蘗期開始,葉片出現(xiàn)不同程度早衰,生育期更長,植株變矮,穗粒數(shù)、千粒重、結(jié)實率均顯著降低;劍葉、倒二葉和倒三葉的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性顯著升高,JA、SA和H2O2抑制突變體植株生長發(fā)育[59]。Os03g0131200編碼一個過氧化氫酶OsCATC,w330突變體中該基因在第1個內(nèi)含子的末位發(fā)生了一個C到G的替換,造成第1個內(nèi)含子沒有剪切,最終導(dǎo)致翻譯提前終止;w330突變體從3葉期開始出現(xiàn)葉片衰老,直至抽穗期、黃熟期,w330株高變矮、分蘗減少、葉片變窄、抽穗期不變,每株有效穗數(shù)、每穗著粒數(shù)和結(jié)實率亦顯著降低[60]。

已定位克隆的水稻早衰相關(guān)基因見表2。

表2 已定位或克隆的水稻早衰致死基因Table 2 Mapped or cloned premature lethal genes in rice

4 對高光效育種分子機理解析的作用

葉片是植物進行光合作用主要的器官,光合作用是水稻生長發(fā)育的生理基礎(chǔ)。創(chuàng)制水稻新的葉色突變體,并深入剖析突變?nèi)~色背后的分子機制對水稻育種具有重要意義。葉綠體是一個具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能的亞細(xì)胞系統(tǒng),其發(fā)育機制和光合作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)依然存在許多未知,需要加強水稻葉色基因種質(zhì)資源的發(fā)掘,克隆鑒定更多的葉色基因,并深入探究其作用機制,為培育高光效水稻新品種奠定理論基礎(chǔ)。葉色突變體在研究水稻光合作用、葉綠素合成與降解及其生長發(fā)育調(diào)控機制方面具有重要作用,而且在水稻雜交制種、提高生物量等方面具有較高的實際應(yīng)用價值。水稻葉色調(diào)控機制涉及多個調(diào)控途徑,包括色素生物合成與降解、質(zhì)體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄后修飾、核質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、葉綠體蛋白酶,以及轉(zhuǎn)錄因子與表觀遺傳。葉色突變體也可以在育種中得到應(yīng)用。一些白色條紋與白化轉(zhuǎn)綠突變體在不同生長時期或因溫度的變化而呈現(xiàn)出不同的葉色,但主要農(nóng)藝性狀相比野生型并無明顯變劣,這些葉色突變體在育種中已廣泛應(yīng)用,如玉兔S、中紫S、白豐A、全龍A等不育系。在水稻中過表達葉綠體基因D1可以提高CO2凈同化速率,增加生物量和產(chǎn)量,增幅高達8.1%～21.0%,顯示出巨大的育種利用價值[61]。VAL1編碼磷酸核糖基胺-甘氨酸連接酶(PurD),參與葉綠體發(fā)育、葉綠素代謝和細(xì)胞分裂的調(diào)控,過表達該基因植株光合能力顯著提高,可以將該基因運用到育種中,提高水稻的產(chǎn)量[62]。

長期以來,科學(xué)家希望利用篩選出的水稻葉片早衰突變體研究早衰的生理與分子機制,以及延緩葉片衰老的栽培調(diào)控途徑并提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。OsNAP的下調(diào)表達可以延緩葉片衰老,使籽粒灌漿期延長,其RNAi株系的籽粒產(chǎn)量提高了10.3%[56]。在暗誘導(dǎo)和自然衰老條件下,Oself3.1突變體衰老延遲,而OsELF3.1過表達植株衰老提前,提示了該基因在育種中的利用價值[63]。SGR是一個與衰老相關(guān)的基因,編碼一種新的葉綠體蛋白,SGR在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控葉綠素的降解,與LHCPII相互作用,SGR誘導(dǎo)LHCPII的分解,進而調(diào)控葉綠素的降解,而sgr突變體葉綠素降解延緩,葉片保持綠色[64]。上述突變體在育種中具有較高的價值。

目前,水稻早衰突變體呈黃化、白條紋、斑點葉等表型,一些類病斑突變體[30-31,35]在發(fā)育早期發(fā)生早衰現(xiàn)象,葉片出現(xiàn)類病斑。接種試驗表明,lms突變體相比野生型對稻瘟病菌株非親和小種的抗性上升;早衰突變體spl29[39]防御信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達量上調(diào),對白葉枯病的抗性也明顯增強。闡明突變體的分子生物學(xué)機制,有助于加深對植株衰老機理的闡釋,也具有一定的育種應(yīng)用價值。

5 問題與展望

水稻葉色突變體是研究水稻葉綠素合成、光合作用和葉綠體發(fā)育的理想材料。截至2022年,國內(nèi)外科學(xué)工作者已經(jīng)克隆鑒定了超過120個葉色基因,并利用分子生物學(xué)和基因組學(xué)的方法對這些基因的功能進行深入研究,闡明了它們在光合色素合成和葉綠體發(fā)育中的功能。一些白條紋轉(zhuǎn)綠葉色突變體作為葉色標(biāo)記等在雜交制種中得到應(yīng)用。一些葉色突變體受限于其劣變的農(nóng)藝性狀而未能在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用,但這些突變體對于闡明水稻葉色分子調(diào)控機制、完善葉綠體發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和培育高光效作物新品種具有重要意義。

與野生型相比,水稻葉色突變體葉綠素合成途徑受阻,光合作用受抑,長勢不及野生型,產(chǎn)量下降,但其各異的葉色具有較高的觀賞價值,可以發(fā)掘其觀賞價值,在旅游觀光中具有一定的潛力。此外,可以利用傳統(tǒng)或者分子生物學(xué)的方法將葉色基因轉(zhuǎn)入觀賞植物中去,定向創(chuàng)制觀賞植物新品種。

水稻衰老的過程非常復(fù)雜,多個調(diào)控途徑涉及水稻衰老進程,到目前為止,其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)遠(yuǎn)未成型。水稻中存在大量的轉(zhuǎn)錄因子參與水稻衰老進程的調(diào)控,NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的研究相對完善,形成了相對完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。水稻衰老過程中,一些早衰相關(guān)基因的敲除有助于延緩水稻衰老進程,從而達到增加生物學(xué)產(chǎn)量的目的,但如何有效抑制(敲除)或利用已知早衰基因提高作物產(chǎn)量仍需進一步研究。未來研究中應(yīng)首先注重不同類型早衰突變體的篩選鑒定,不斷發(fā)掘早衰相關(guān)種質(zhì)資源,挖掘早衰新基因,通過基因敲除等分子生物學(xué)方法,深入剖析調(diào)控衰老新基因的功能,不斷完善其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在闡明水稻衰老調(diào)控機制的基礎(chǔ)上,設(shè)計分子和栽培調(diào)控植物衰老的策略,發(fā)掘其育種和生產(chǎn)價值。

水稻早衰在一定程度上影響稻米品質(zhì)。目前對于水稻衰老與品質(zhì)的關(guān)系研究較少,且少有涉及其分子機理。在以后的研究中,產(chǎn)量作為最重要的農(nóng)藝性狀之一,在關(guān)注產(chǎn)量的同時,稻米品質(zhì)也應(yīng)該得到充分的重視。以早衰水稻灌漿期淀粉合成相關(guān)酶活性為抓手,深入研究早衰對淀粉理化性質(zhì)的影響,系統(tǒng)運用分子生物學(xué)的方法,調(diào)控葉片衰老進程,解決水稻衰老的內(nèi)部制約因素,有效延緩衰老,為優(yōu)質(zhì)抗衰水稻品種的選育提供支撐。