馬曉涵,韓濱,高凡,遲松

(青島大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東 青島 266003)

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性認知障礙、記憶減退和精神行為癥狀為主要臨床特征的神經(jīng)退行性疾病,其致殘率高,病程較長,目前尚無有效的防治策略[1]。AD的發(fā)病機制存在多種假說,其中β-淀粉樣蛋白(Aβ)激活小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)被認為在AD的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用[2-3]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體是由NLRP3受體、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)組成的多蛋白復合體[4],在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達于小膠質(zhì)細胞[5]。研究表明,NLRP3 炎性小體可被Aβ激活,進而促進Aβ的沉積和微管蛋白tau 的過度磷酸化[6-9]。此外,NLRP3 炎性小體的激活能夠觸發(fā)小膠質(zhì)細胞的焦亡,這是一種新的程序性的細胞死亡形式,表現(xiàn)為細胞不斷腫脹直至細胞膜破裂,釋放大量炎性遞質(zhì),加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng)[10]。

氟西汀是一種選擇性的5-羥色胺再攝取抑制劑,在臨床上廣泛應(yīng)用于抑郁癥的治療。最近的研究發(fā)現(xiàn),氟西汀能夠通過抗炎、抗氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護作用[11-12]。在抑郁動物模型中,氟西汀能通過下調(diào) NLRP3 信號通路抑制小膠質(zhì)細胞的活化和炎性因子的分泌[13-14]。盡管研究發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥的長期應(yīng)用能夠降低AD 罹患風險并改善認知能力[15-17],但是氟西汀能否抑制AD環(huán)境下小膠質(zhì)細胞焦亡和神經(jīng)炎癥目前尚無報道。本研究使用Aβ25-35刺激 BV2 小膠質(zhì)細胞模擬AD炎性環(huán)境,以NLRP3炎性小體與細胞焦亡為切入點,探討氟西汀對AD的保護作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

永生系小鼠BV2小膠質(zhì)細胞購于武漢普諾賽公司。氟西汀購于美國Sigma公司。Aβ25-35、雙硫侖和CCK8檢測試劑盒購于美國MCE公司;胎牛血清、青鏈霉素混合液以及MEM培養(yǎng)液購自武漢普諾賽公司;BCA蛋白檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、白細胞介素1β(IL-1β)及白細胞介素18(IL-18)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自武漢伊萊瑞特公司;乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自北京索萊寶公司;PBS緩沖液、RIPA裂解液和DCFH-DA活性氧(ROS)檢測試劑盒購自上海碧云天公司;ECL試劑盒購于武漢博士德公司;caspase-1抗體購于美國Santa cruz公司;NLRP3、ASC和活化半胱氨酸蛋白酶-1(cleaved-caspase-1)抗體購于美國CST公司;GAPDH和膜穿孔蛋白D(GSDMD)抗體購自美國Proteintech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 BV2細胞生長于含有體積分數(shù)0.10胎牛血清和10 g/L青鏈霉素的MEM培養(yǎng)液中,置于含體積分數(shù)0.05 CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后傳代。本研究使用第3～5代的細胞。首先將BV2細胞以每孔大約5×103個細胞的密度種植于96孔板中,用不同濃度的Aβ25-35處理12、24、36、48 h,利用CCK8檢測細胞活力,獲得Aβ25-35最佳處理濃度(20 μmol/L)和時間(24 h)。實驗分為以下6組:空白對照組(A組),Aβ25-35組(B組),Aβ25-35+小劑量(5 μmol/L)氟西汀組(C組),Aβ25-35+中劑量(濃度10 μmol/L)氟西汀組(D組),Aβ25-35+高劑量(濃度20 μmol/L)氟西汀組(E組),Aβ25-35+雙硫侖(10 μmol/L)組(F組)。除空白對照組外,其他各組用不同濃度的氟西汀或雙硫侖預(yù)處理BV2細胞2 h,再加入20 μmol/L的Aβ25-35培養(yǎng)24 h用于后續(xù)實驗。

1.2.2CCK8法檢測細胞活力 將BV2細胞以大約每孔5×103個細胞的密度接種到96孔板中,待其均勻貼壁生長后,用不同濃度的Aβ25-35、氟西汀、雙硫侖進行處理。然后在規(guī)定的不同時間點每孔加入10 μL CCK8試劑,在37 ℃下孵育2.5 h。最后用酶標儀測量各組細胞在450 nm波長下的吸光度(A)值,細胞存活率=(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)×100%。

1.2.3ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β和IL-18含量 收集處理好的各組細胞上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書的步驟測定IL-1β和IL-18水平。

1.2.4LDH釋放量檢測 LDH的釋放反映了細胞質(zhì)膜完整性的喪失,可間接反映細胞焦亡的程度。收集各組細胞上清液,根據(jù)LDH試劑盒說明步驟測定LDH的釋放量。

1.2.5Annexin V-FITC/PI染色 早期凋亡細胞被Annexin V標記,而焦亡和中晚期凋亡細胞可被Annexin V和PI同時標記,所以Annexin V/PI雙陽性率可作為細胞焦亡比例的間接指標。收集各組細胞后按Annexin V-FITC/PI雙染色凋亡檢測試劑盒說明步驟處理,上流式細胞儀檢測各組細胞Annexin V/PI雙陽性率,使用Flowjo分析數(shù)據(jù)。

1.2.6ROS生成的檢測 按照DCFH-DA試劑盒說明步驟處理各組細胞,使用Image J 6.0分析各組熒光強度(細胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF,ROS含量與熒光顯微鏡下測量的DCF熒光強度呈正比)。

1.2.7Western blot法檢測炎性小體及焦亡相關(guān)蛋白表達 處理好的各組細胞以冷PBS洗滌3次后用細胞刮刀刮下置于離心管中,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min。細胞裂解物于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min,取上清(即蛋白樣品)。使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。各組蛋白樣品加入5×上樣緩沖液,金屬浴100 ℃煮5 min使蛋白變性。煮好的蛋白按照每孔20 μg上樣,進行SDS-PAGE電泳并濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上,再用體積分數(shù)0.05的脫脂牛奶室溫封閉1.5 h,分別加入NLRP3(1∶1 000)、ASC(1∶1 000)、caspase-1(1∶500)、cleaved-caspase-1(1∶1 000)、GSDMD(1∶5 000)、GAPDH(1∶5 000)抗體,4 ℃過夜。以TBST溶液洗膜3次,分別加入稀釋好的山羊抗兔IgG(1∶5 000)或山羊抗鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1.5 h。以TBST溶液洗膜3次,ECL發(fā)光液顯影,掃描后用Image J 6.0分析相應(yīng)條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計算各目標蛋白的相對表達量。

1.2.8電鏡檢測 各組處理好的細胞以冷PBS洗滌2次后用細胞刮刀刮下置于離心管中進行離心(1 000 r/min,5 min),棄去上清液,將離心管中的細胞團塊置于體積分數(shù)0.025的戊二醛固定液(pH 7.3～7.4)中,4 ℃保存,最后用透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 氟西汀對Aβ25-35誘導的BV2細胞活力的影響

析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示,Aβ25-35的作用濃度與作用時間都對細胞存活率存在顯著影響,Aβ25-35在10～40 μmol/L濃度范圍內(nèi)處理BV2細胞24 h后,細胞活力均受到明顯的抑制,其中應(yīng)用20 μmol/L Aβ25-35時細胞的存活率接近50%,表明該濃度可對細胞造成有效傷害,因此選擇24 h和20 μmol/L作為Aβ25-35的干預(yù)時間和干預(yù)濃度。見表1。不同濃度氟西汀處理2 h后的細胞活力差異具有統(tǒng)計學意義(F=11.202,P<0.05),組間兩兩比較,與空白對照組相比,1～20 μmol/L氟西汀對細胞活力影響不明顯(P>0.05),40和60 μmol/L氟西汀則顯著降低了細胞活力(P<0.05)(圖1a),因此后續(xù)實驗中選擇5、10和20 μmol/L作為氟西汀的治療濃度?？瞻讓φ战M、Aβ25-35組和不同濃度氟西汀預(yù)處理組的細胞活力差異具有統(tǒng)計學意義(F=19.664,P<0.05),兩兩比較結(jié)果顯示,10和20 μmol/L氟西汀預(yù)處理細胞2 h逆轉(zhuǎn)了Aβ25-35誘導的細胞活力下降(P<0.05)(圖1b)。

a:氟西汀對BV2細胞活力的影響(n=6);b:氟西汀對Aβ25-35誘導的BV2細胞活力的影響(n=5)。與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與Aβ25-35組比較,#P<0.05,##P<0.01。圖1 氟西汀對Aβ25-35誘導的BV2細胞活力的影響

表1 不同濃度Aβ25-35作用不同時間對BV2細胞存活率的影響(n=30,χ/%)

2.2 氟西汀對Aβ25-35誘導的BV2細胞焦亡的影響

Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果顯示,20 μmol/L Aβ25-35顯著增加了PI陽性的BV2細胞數(shù)量,而不同濃度的氟西汀預(yù)處理降低了PI陽性的細胞數(shù)量,且呈劑量依賴性(圖2a)。PI陽性細胞的定量分析顯示,各處理組間焦亡程度差異具有統(tǒng)計學意義(F=35.938,P<0.01),兩兩比較結(jié)果顯示,高劑量(20 μmol/L)的氟西汀能夠顯著降低細胞焦亡比例(P<0.01), 但中低劑量的氟西汀對Aβ25-35誘導的細胞焦亡抑制不顯著(P>0.05)(圖2b)。各處理組間LDH釋放量差異也具有統(tǒng)計學意義(F=6.172,P<0.05),組間兩兩比較結(jié)果顯示,10和20 μmol/L氟西汀預(yù)處理降低了Aβ25-35誘導的BV2細胞中LDH的釋放(P<0.05)(圖2c)。在形態(tài)學上,利用透射電鏡可觀察到20 μmol/L Aβ25-35刺激后的BV2細胞出現(xiàn)腫脹變形、細胞膜完整性破壞及大量焦亡小體(空泡變性)等典型的細胞焦亡特征;與Aβ25-35組相比,20 μmol/L氟西汀處理組細胞焦亡緩解,細胞形態(tài)變化不明顯(圖2d)。以上結(jié)果表明,氟西汀的應(yīng)用,尤其是高劑量(20 μmol/L)氟西汀可以有效抑制Aβ25-35誘導的BV2細胞焦亡。

a:Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞焦亡;b:PI陽性細胞定量分析(n=3);c:各組LDH的釋放量比較(n=4);d:透射電鏡觀察BV2細胞焦亡形態(tài)變化,紅色箭頭所指為焦亡小體。與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與Aβ25-35組比較,#P<0.05,##P<0.01。圖2 氟西汀對Aβ25-35誘導的BV2細胞焦亡的影響

2.3 氟西汀對BV2細胞中Aβ25-35誘導的GSDMD表達影響

各處理組間GSDMD蛋白的表達差異具有統(tǒng)計學意義(F=4.001,P<0.05);與空白對照組相比較,Aβ25-35組細胞中GSDMD的表達顯著增加(P<0.01),而20 μmol/L氟西汀和10 μmol/L 雙硫侖(GSDMD特異性拮抗劑)處理后GSDMD蛋白表達均較Aβ25-35組明顯降低(P<0.05)(圖3a)。此外,雙硫侖對BV2細胞活力影響也具有統(tǒng)計學差異(F=44.778,P<0.01),其中10 μmol/L雙硫侖能夠逆轉(zhuǎn)Aβ25-35誘導的BV2細胞活力下降(P<0.05)和細胞焦亡(圖2a、3b～e)。

a:Western blot法檢測GSDMD蛋白的表達(n=5);b:透射電鏡觀察BV2細胞形態(tài)變化;c:雙硫侖對Aβ25-35誘導的BV2細胞活力的影響(n=5);d:各組LDH釋放量的比較(n=4,F=8.137,P<0.05);e:PI陽性細胞定量分析(n=3,F=59.766,P<0.01)。與空白對照組相比較,*P<0.05,**P<0.01;與Aβ25-35組比較,#P<0.05,##P<0.01。圖3 氟西汀對BV2細胞中Aβ25-35誘導的GSDMD表達影響

2.4 氟西汀對BV2細胞中Aβ25-35誘導的NLRP3炎性小體激活的影響

各處理組間的NLRP3(F=2.787,P<0.05)、ASC(F=5.832,P<0.05)、caspase-1(F=3.164,P<0.05)、cleaved-caspase-1(F=3.145,P<0.05)蛋白表達比較差異均具有統(tǒng)計學意義。兩兩比較結(jié)果顯示,與空白對照組相比,Aβ25-35組上述炎性小體相關(guān)蛋白的表達均顯著上調(diào)(P<0.05),但該上調(diào)作用在高劑量(20 μmol/L)氟西汀預(yù)處理后均得到了抑制(P<0.05)。見圖4、表2。

Western blot法檢測NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白的表達水平,以GAPDH為內(nèi)參。圖4 氟西汀對BV2細胞中Aβ25-35誘導的NLRP3炎性小體激活的影響

表2 各組細胞炎性小體和焦亡相關(guān)蛋白以及ROS產(chǎn)生的比較

2.5 氟西汀對炎性小體相關(guān)促炎因子表達影響

各組間IL-1β(F=9.189,P<0.05)、IL-18(F=6.680,P<0.05)表達比較差異均有顯著性。兩兩比較結(jié)果顯示,與空白對照組相比較,Aβ25-35組細胞上清液中IL-1β、IL-18的含量均顯著增加(P<0.01),而不同濃度的氟西汀(5、10、20 μmol/L)和雙硫侖(10 μmol/L)則抑制了IL-1β和IL-18的表達(P<0.05)。見表2。

2.6 氟西汀對Aβ25-35誘導的BV2細胞中ROS產(chǎn)生的影響

各處理組間ROS熒光強度比較差異具有顯著性(F=15.159,P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與空白對照組相比,Aβ25-35組ROS熒光強度明顯增強(P<0.01);而不同濃度的氟西汀均抑制了Aβ25-35誘導的ROS的生成,且呈劑量依賴性(P<0.05);但10 μmol/L雙硫侖處理組與Aβ25-35組相比,差異無顯著性(P>0.05)。見圖5、表2。

熒光顯微鏡檢測各組ROS的生成,熒光定量分析法測定ROS水平。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn),氟西汀能夠在多種疾病中通過抑制NLRP3炎性小體活化進而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)并改善神經(jīng)功能,如抑郁癥[13]、腦損傷[18]和萎縮性黃斑變性[19]。本研究結(jié)果證實,Aβ25-35能夠誘導BV2細胞NLRP3炎性小體的激活和細胞焦亡,促進炎性細胞因子IL-1β和IL-18的釋放,而這些都可以被外源性的氟西汀所抑制,提示氟西汀可能通過抑制NLRP3炎性小體激活、小膠質(zhì)細胞焦亡以及隨后的炎癥級聯(lián)反應(yīng)對AD發(fā)揮神經(jīng)保護作用。越來越多的證據(jù)表明,NLRP3信號通路在AD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[20]。關(guān)于Aβ如何介導小膠質(zhì)細胞NLRP3炎性小體激活目前已有多種假說被提出。有研究認為,Aβ作為NLRP3炎性小體的啟動或活化刺激物,最終導致由caspase-1介導的炎性因子(IL-1β、IL-18)的釋放[21],而且在特定條件下,活化的caspase-1將裂解下游的成孔蛋白GSDMD,從而促進小膠質(zhì)細胞發(fā)生焦亡[22-23]。本實驗結(jié)果表明,氟西汀的應(yīng)用,尤其是高劑量(20 μmol/L)的氟西汀可以有效緩解Aβ25-35誘導的BV2細胞焦亡,主要表現(xiàn)為LDH釋放量降低、PI陽性的BV2細胞數(shù)量減少以及細胞形態(tài)學上的變化;此外,氟西汀也可以逆轉(zhuǎn)Aβ25-35誘導的細胞活力下降。GSDMD不僅是焦亡的關(guān)鍵因子,也是焦亡成孔的候選蛋白之一[24-25]。為了明確GSDMD是否在Aβ25-35誘導的細胞焦亡中發(fā)揮作用,本研究使用10 μmol/L雙硫侖(GSDMD特異性拮抗劑)作為對照,實驗結(jié)果顯示,雙硫侖有效抑制了GSDMD的表達和細胞焦亡,初步證實了GSDMD在Aβ25-35誘導的細胞焦亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,高劑量(20 μmol/L)的氟西汀可以有效降低Aβ25-35誘導的BV2細胞GSDMD的表達進而改善焦亡。

本團隊前期研究顯示,氟西汀能夠通過抑制NLRP3炎性小體和caspase-1的活化改善蛛網(wǎng)膜下隙出血和抑郁[13,18]。AMBATI等[19]的研究顯示,氟西汀可直接與NLRP3蛋白結(jié)合并阻止NLRP3-ASC炎癥小體的組裝和激活,進而緩解萎縮性黃斑變性。本研究探討了氟西汀是否可靶向抑制Aβ25-35介導的NLRP3炎性小體激活,結(jié)果顯示,高劑量(20 μmol/L)氟西汀下調(diào)NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1、cleaved-caspase-1)的表達,提示氟西汀可能通過抑制NLRP3炎性小體激活對AD產(chǎn)生保護作用。已知IL-1β和IL-18在腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的啟動和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。與先前在抑郁模型中的研究結(jié)果一致[14],本研究結(jié)果表明,氟西汀的應(yīng)用能顯著抑制Aβ25-35誘導的IL-1β和IL-18產(chǎn)生。

ROS除了作為NLRP3炎性小體的重要上游活化信號外,還與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[27]。有研究結(jié)果表明,氟西汀能在多種情況下減少ROS的生成[28]。本文研究結(jié)果顯示,與Aβ25-35組相比較,不同濃度的氟西汀預(yù)處理顯著降低了細胞內(nèi)ROS含量,且該作用呈劑量依賴性。由此推測,氟西汀可能通過抑制Aβ25-35誘導的ROS生成抑制NLRP3炎性小體的活化。

綜上所述,氟西汀能夠抑制Aβ25-35誘導的BV2小膠質(zhì)細胞ROS產(chǎn)生、NLRP3炎性小體激活和細胞焦亡,進而改善神經(jīng)炎癥反應(yīng),氟西汀可能通過調(diào)節(jié)ROS/NLRP3/GSDMD信號通路在AD中發(fā)揮神經(jīng)保護作用,這為延緩AD發(fā)展提供了新的治療思路,值得進一步深入研究。