賈韓靜 童一心 黃哲華*

腦卒中在老年人群中較為常見，具有高發(fā)病率和高死亡率特點，其中87%為缺血性腦卒中，目前青年缺血性腦卒中的發(fā)病率已明顯增加［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）來源廣泛，有高度自我更新和多態(tài)分化能力，已被應(yīng)用于腦卒中移植治療以改善神經(jīng)功能［2］。但MSCs 移植的成功率較低，因此提高MSCs 細(xì)胞移植后的活力已成為MSCs 移植治療腦卒中的研究重點［3］。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 經(jīng)中風(fēng)患者血清培養(yǎng)后移植可提高MSCs 的治療效果［4］。基于此，本研究通過建立大鼠中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，探討缺血性腦卒中血清預(yù)處理的MSCs對MCAO 大鼠的神經(jīng)保護效果及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 85 只健康SD 大鼠，體重250～280 g，購于上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司［SCXK（滬）2017-0012）］，飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心［SYXK（浙）2020-0024）］。

1.2 材料與儀器 蘇木素染液（貨號：MD911467）購于MDL；伊紅染液（貨號：613101）購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司；Tunel 試劑盒（貨號：11684817910）購 于Roche；CD44、CD90、CD45抗 體（貨 號：85-12-0444、85-11-0900、85-11-0461）購于eBioscience；CD34抗體（貨號：AF6518）購于R&D；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA 試劑盒（貨號：MM-0209R1、MM-0187R1、MM-0152R1、MM-0179R1）購于酶免。Brdu 抗體（貨號：Ab8152）購于Abcam，BDNF、NGF 抗體（貨號：DF6387、DF6061）購于Affnity。C6 流式細(xì)胞儀（BD）；Micro 17R 高速離心機（Thermo），Nikon DS-U3 成像系統(tǒng)（日本尼康）。1.3 方法 （1）骨髓MSCs 的分離與培養(yǎng)：從大鼠股骨中抽取骨髓，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離法分離單核細(xì)胞。用10% 胎中血清（FBS）和含有1%雙抗（penicillin/streptomycin）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)分離的單核細(xì)胞并傳代2 次獲取MSCs。（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44、CD90、CD34、CD45抗原表達(dá)：PBS 清洗MSCs，離心，適量PBS 重懸底部細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×106～10×106/mL。吸取100μL 細(xì)胞懸液與流式管內(nèi)，各加抗體5 μL，混勻后室溫避光孵育15 min。清洗細(xì)胞（同上），500μL PBS 重懸細(xì)胞，流式上機檢測。（3）缺血腦組織預(yù)處理MSCs：分離5 只缺血性腦卒中大鼠和5 只正常大鼠血清，離心10 min 后分離上層液。腦卒中大鼠血清與細(xì)胞培養(yǎng)液混合后培養(yǎng)MSCs，標(biāo)記為SS-MSCs，正常大鼠腦組織血清與細(xì)胞培養(yǎng)液混合后培養(yǎng)MSCs，標(biāo)記為NS-MSCs；FBS 培養(yǎng)的MSCs，標(biāo)記為FBS-MSCs。（4）MCAO 大鼠模型的制備與分組：10%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，采用Zea Longa 線栓法制作MCAO 大鼠模型［5］。造模1 d 后，預(yù)處理MSCs 經(jīng)Brdu 熒光染色后靜脈注射到大鼠尾靜脈中，隨機分為MCAO 組（等體 積PBS）、MCAO+FBS-MSCs 組（2×106cells FBSMSCs）、MCAO+NS-MSCs 組（2×106cells NS-MSCs）、MCAO+SS-MSCs 組（2×106cells SS-MSCs），同時sham組注射等體積PBS。（5）MCAO 大鼠行為變化的監(jiān)測：MCAO 大鼠尾靜脈注射移植預(yù)處理的MSCs 第1、7、14天后觀察其行為變化，采用貼紙試驗（Adhesive-removal test）、改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）進行評估。mNSS 評判標(biāo)準(zhǔn)：輕型受損1～6 分；中型受損7～12 分；重型受損13～18 分。（6）TTC 染色：MSCs 移植14 d 后，麻醉處死大鼠，摘取腦組織，于-20 ℃冰箱凍存5 min，取出后稱重。將大鼠腦組織按1～2 mm 厚度切下5～6 片，TTC 溶液染色，37℃孵育15 min，4%多聚甲醛固定30 min，拍照；梗死區(qū)呈白色，正常區(qū)呈紅色，圖像處理和分析軟件處理以計算腦梗死面積占比（%）=腦梗死區(qū)面積/腦組織總面積×100%。（7）HE 染色：石蠟包埋腦組織，常規(guī)切片，烤片，脫蠟至水。按步驟進行HE 染色。同時行HE 半定量分析，0 分為無炎癥細(xì)胞浸潤、無神經(jīng)元萎縮，1～4 分分別為炎癥細(xì)胞浸潤范圍、神經(jīng)元萎縮面積＜25%、25%～50%、＞50%～75%、＞75%。（8）Tunel染色：標(biāo)本制作同上。蛋白酶K 修復(fù)工作液和破膜工作液預(yù)處理標(biāo)本。滴加TdT 與dUTP，37℃孵育2 h，避光室溫加入DAPI 復(fù)染細(xì)胞核10 min，PBS 洗滌，抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像以分析腦組織中細(xì)胞凋亡情況。陽性凋亡細(xì)胞核呈綠色。（9）ELISA 檢測：參照相關(guān)試劑盒說明，ELISA檢測大鼠腦組織BDNF、NGF、HGF、VEGF 等生長因子或營養(yǎng)因子的表達(dá)水平。（10）免疫組織化學(xué)染色：MCAO 造模后，大鼠腹腔內(nèi)定時注射50 mg/kg BrdU 連續(xù)3 d，14 d 后取腦組織行冠狀組織制備冷凍切片。按試劑說明書行免疫組織化學(xué)和DAPI 雙重染色。20 倍、40 倍顯微鏡下選取連續(xù)6 個視野計數(shù)陽性細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布計量資料以（±s）表示，多組間比較用方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs 的形態(tài)學(xué)特征 原代MSCs 經(jīng)過24 h 培育后，可見單個黏附貼壁細(xì)胞，呈紡錘狀或多邊形（見圖1A）；3～5 d MSCs 細(xì)胞迅速增殖所示，可見梭形、多突狀的成纖維樣克隆細(xì)胞（見圖1B）。

圖1 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

2.2 MSCs 細(xì) 胞 表 面 標(biāo) 志 物CD44、CD90、CD34、CD45的表達(dá) MSCs 細(xì)胞表面CD44和CD90分子陽性率達(dá)到92.17%±0.51% 和95.50%±0.95%；而CD34和CD45分子陽性率僅為1.31%±0.09%和1.95%±0.07%。見圖2。

圖2 MSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD34、CD45表達(dá)

2.3 MCAO 大鼠行為變化的情況 MSCs 移植第0、1 天各組大鼠貼紙去除時間和mNSS 評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。從MSCs 移植后第7 天開始，MCAO+FBS-MSCs 組、MCAO+NS-MSCs 組 與MCAO+SS-MSC 組大鼠的雙側(cè)貼紙去除時間、mNSS評 分 較MCAO 組 均 降 低（P＜0.05 或P＜0.01）；與MCAO+FBS-MSCs 組比較，MCAO+SS-MSC 組大鼠貼紙去除時間、mNSS 評分降低（P＜0.01）；與MCAO+NSMSCs 組比較，MCAO+SS-MSC 組大鼠貼紙去除時間、mNSS 評分降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 MCAO大鼠行為變化的情況 A：注射預(yù)處理MSCs第0、1、7、14 天后的貼紙試驗結(jié)果；B：注射預(yù)處理MSCs第0、1、7、14 天后mNss評分結(jié)果

2.4 TTC 染色觀察MCAO 大鼠腦梗死面積 與sham 組比較，MCAO 組大鼠腦梗死面積極升高（P＜0.01），與MCAO 組比較，MCAO+FBS-MSCs 組、MCAO+NS-MSCs組與MCAO+SS-MSC 組大鼠腦梗死面積降低（P＜0.05或P＜0.01）；與MCAO+FBS-MSCs 組比較，MCAO+SSMSC 組大鼠腦梗死面積降低（P＜0.01）；與MCAO+NSMSCs 組比較，MCAO+SS-MSC 組大鼠腦梗死面積降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 A. MCAO大鼠腦梗死面積（TTC染色×400）；B. 預(yù)處理MSCs對MCAO大鼠腦梗死率的影響

2.5 HE 染色觀察MCAO 大鼠腦組織恢復(fù)情況 sham組大鼠腦組織神經(jīng)元染色正常，結(jié)構(gòu)清晰，排列致密有序。MCAO 組腦組織結(jié)構(gòu)疏松，著色變淺，神經(jīng)細(xì)胞層次改變，可見明顯細(xì)胞碎片及組織空泡樣改變，HE 半定量評分較sham 組升高（P＜0.01）。與MCAO 組比較，預(yù)處理MSCs 組神經(jīng)元數(shù)目增加，空泡樣改變減弱，且神經(jīng)元損傷性病理變化減輕，大鼠腦組織HE 半定量評分均降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中MCAO+SS-MSCs 損害程度最低，接近于sham 組。見圖5。

圖5 A. MCAO大鼠腦組織恢復(fù)情況（HE染色×400）；B. MCAO大鼠腦組織HE半定量評分

2.6 Tunel 染色觀察腦組織中細(xì)胞凋亡情況 與sham組比較，MCAO 組腦組織細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01）。各預(yù)處理MSCs 組較MCAO 組凋亡率均顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01），其細(xì)胞凋亡程度由低到高依次為：MCAO+SS-MSC 組＜MCAO+FBS-MSCs 組＜MCAO+NSMSCs 組。見圖6。

圖6 A. MCAO大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)情況（Tunel染色×400）；B. MCAO大鼠腦組織細(xì)胞陽性凋亡率

2.7 預(yù)處理MSCs 對大鼠腦組織中BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平影響 與sham 組比較，MCAO 組腦組織中BDNF 水平升高（P＜0.01），VEGF 水平降低（P＜0.05）；與MCAO 組比較，MCAO+FBS-MSCs 組BDNF、HGF、VEGF 水平高（P＜0.05、P＜0.01），BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平在MCAO+NS-MSCs 組與MCAO+SS-MSC 組均升高（P＜0.05、P＜0.01）；與MCAO+FBS-MSCs 組比較，MCAO+SS-MSC 組BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平均升高（P＜0.05、P＜0.01）；與MCAO+NS-MSCs 組比較，MCAO+SS-MSC 組BDNF、HGF、VEGF 水平升高（P＜0.05、P＜0.01）。見圖7。

圖7 MCAO大鼠腦組織中BDNF、NGF、HGF、VEGF水平表達(dá)情況

2.8 免疫組化檢測大鼠腦組織中BrdU、BDNF 與NGF的表達(dá)水平 與sham 組比較，MCAO 組大鼠腦組織中BDNF、NGF 表達(dá)水平下降（P＜0.05），BrdU 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與MCAO 組比較，MCAO+NS-MSCs 組與MCAO+SS-MSC 組Brdu、BDNF、NGF 表達(dá)水平均上升（P＜0.05 或P＜0.01）；MCAO+FBS-MSCs 組僅BrdU表達(dá)水平升高（P＜0.01）。與MCAO+FBS-MSCs 組比較，MCAO+SS-MSCs 組BDNF、BrdU、NGF 表達(dá)水平均上升（P＜0.05、P＜0.01）；MCAO+NS-MSC 組NGF 表達(dá)水平上升（P＜0.01）。與MCAO+NS-MSCs 組比較，MCAO+SSMSCs 組BrdU、BDNF、NGF 表達(dá)水平均上升（P＜0.05）。見圖8。

圖8 A. 腦組織中BrdU、BDNF與NGF水平表達(dá)情況（免疫組化染色×200，×400）；B. 腦組織BrdU、BDNF與NGF表達(dá)水平

3 討論

MSCs 移植治療缺血性腦卒中主要機制為細(xì)胞替代，血管生成及神經(jīng)系統(tǒng)重建，并具有降低外周免疫抑制作用［2］。ASGARI 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中血清預(yù)處理MSCs 可通過CXCR4 和C-Met 信號遷移至梗死區(qū)，提高其治療效果；MOON 等［5］研究表明，MSCs 經(jīng)中風(fēng)患者血清預(yù)處理可通過血管生成提高MSCs修復(fù)腦損傷的作用。

本研究造模的MCAO 大鼠神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重，與ZHAI 等［6］研究結(jié)果相符，而MSCs 移植干預(yù)可降低雙側(cè)貼紙去除時間、mNSS 評分，其中MCAO+SS-MSC 組改善效果明顯，表明經(jīng)腦卒中血清預(yù)處理MSCs 移植改善神經(jīng)功能缺損效果最佳?？赡苁怯捎诖笫竽X卒中血清中培養(yǎng)擴增MSCs 可維持骨髓細(xì)胞特征，因而更利于神經(jīng)功能恢復(fù)［7］。

本研究結(jié)果顯示，與sham 組比較，MCAO 大鼠腦梗死面積明顯增加，腦組織及神經(jīng)元病理性損傷加重，而MSCs 移植干預(yù)可有效減少腦梗死面積，改善腦組織損傷，且MCAO+SS-MSC 組改善明顯。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF、BDNF 表達(dá)水平升高對缺血性腦卒中有明顯保護作用［8］。VEGF 參與調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞，在血管生成、神經(jīng)保護及建立側(cè)支循環(huán)方面均有重要作用［9］。BDNF 可改善神經(jīng)可塑性［10］，介導(dǎo)抗凋亡機制延緩神經(jīng)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)神經(jīng)再生［11］。NGF 為神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，在缺血缺氧狀態(tài)下，可促進神經(jīng)細(xì)胞增殖，修復(fù)受損神經(jīng)，維持神經(jīng)元正常生理功能。而HGF 為多效性生長因子，參與生長、再生及重塑等過程，其在梗死灶周圍表達(dá)呈上升趨勢。本研究中，MCAO+SS-MSC 組BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平較MCAO 組升高（P＜0.01），且高于MCAO+FBS-MSCs 組、MCAO+NS-MSCs 組。免疫組化結(jié)果顯示MCAO+SS-MSCs 組Brdu、BDNF、NGF表達(dá)水平較MCAO 組均上調(diào)，且高于MCAO+FBS-MSCs組、MCAO+NS-MSCs 組，表明腦卒中經(jīng)血清預(yù)處理的MSCs 更能向腦組織梗死區(qū)遷移。

綜上所述，經(jīng)腦卒中血清預(yù)處理的MSCs 移植成功率高，且神經(jīng)改善效果好，可能與腦卒中血清預(yù)處理能夠增強MSCs 的活力和遷移能力，抑制腦組織細(xì)胞凋亡，上調(diào)BDNF、NGF、HGF、VEGF 水平有關(guān)。