李亞楠，李絲雨，劉國秀，李易軒，季志紅 ，李柯翱 ，于靜 ，王燕平 ，翟華強(qiáng)，，王永炎

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥調(diào)劑標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，北京 102488；3.新奇康藥業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011；4.新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；5.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700

祖卡木顆粒收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊》，是《國家基本藥物目錄（2018版）》《國家急（搶）救藥品直接掛網(wǎng)采購示范藥品目錄》收錄的維藥重點(diǎn)品種，發(fā)展歷史悠久，臨床療效優(yōu)良，臨床價(jià)值突出[1]。祖卡木顆粒對上呼吸道感染療效良好，且被新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會列為治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的推薦方藥[2]。在COVID-19發(fā)生過程中，新型冠狀病毒感染會引起機(jī)體肺部免疫細(xì)胞的過度激活，導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[3]。ALI發(fā)病率和病死率高、預(yù)后差，給全球公共衛(wèi)生事業(yè)帶來巨大挑戰(zhàn)[4]。前期研究表明，祖卡木顆粒對肺損傷具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)制可能與TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路[5]及調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡有關(guān)[6]。

目前，系統(tǒng)生物信息學(xué)已成為一種成熟的方法用于在分子水平上系統(tǒng)揭示中藥復(fù)方治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效機(jī)制研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了多組分和多靶點(diǎn)模型，能夠更好地闡明疾病和藥物相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)和代謝物之間的復(fù)雜相互作用，十分適合研究中藥的復(fù)雜作用機(jī)制[7]。GEO數(shù)據(jù)庫具有真實(shí)臨床樣本的基因芯片數(shù)據(jù)，可通過篩選正常組和疾病組的差異表達(dá)基因（DEGs）反映疾病分子生物學(xué)特征[8]。本研究聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和GEO數(shù)據(jù)芯片，預(yù)測祖卡木顆粒治療ALI的主要生物活性化合物、潛在靶點(diǎn)和信號通路，揭示其可能的分子作用機(jī)制，并通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證，旨在闡釋祖卡木顆粒治療ALI可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 祖卡木顆?；瘜W(xué)成分及作用靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP （https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[9]查詢祖卡木顆粒中6味組方藥物薄荷、甘草、罌粟殼、大棗、山柰、大黃的化學(xué)成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行成分篩選。對于TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄的4味藥物睡蓮花、破布木果、蜀葵子、洋甘菊，通過中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺、PubMed數(shù)據(jù)庫檢索其化學(xué)成分，并以CAS號或標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)名稱于TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索，收集并整理其基本化學(xué)信息。通過TCMSP 和SwissTargetPrediction 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測祖卡木顆粒活性成分的靶點(diǎn)信息，匯總所有靶點(diǎn)信息，使用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）uqf 靶點(diǎn)蛋白信息轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名，設(shè)置靶點(diǎn)種屬來源為“Homo Sapiens”（人類），獲得祖卡木顆粒的作用靶點(diǎn)。

1.2 急性肺損傷相關(guān)靶點(diǎn)獲取

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫檢索“Acute lung injury”，并以相關(guān)性評分（relevance score）取3倍中位數(shù)為篩選條件選取GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得的靶點(diǎn)，對2個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)進(jìn)行合并、去重后得到ALI的疾病靶點(diǎn)。

1.3 GEO芯片數(shù)據(jù)分析急性肺損傷差異表達(dá)基因

在GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）以“Acute lung injury”為關(guān)鍵詞搜索，選擇種屬為“Homo Sapiens”（人類），下載編號為GSE10474[10]、GSE2322[11]、GSE3037[12]的芯片數(shù)據(jù)，以獲得ALI和正常樣本的mRNA表達(dá)譜。利用GEO2R在線分析平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)集的差異分析，并以|logFC|＞1、P＜0.05為條件篩選DEGs，對3個(gè)數(shù)據(jù)集的DEGs進(jìn)行合并和去重，獲得ALI 的DEGs。使用Sangerbox3.0（http://vip.sangerbox.com/login.html）的生信繪制工具包繪制DEGs火山圖和熱圖。

1.4 祖卡木顆粒治療急性肺損傷關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取

運(yùn)用jvenn 在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html）對祖卡木顆粒的潛在作用靶點(diǎn)與ALI相關(guān)靶點(diǎn)和顯著差異基因同時(shí)取交集，三者的交集基因即為祖卡木顆粒治療ALI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

使用STRING（https://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析，將Organism（種屬）設(shè)為“Homo Sapiens”（人類），置信度設(shè)置為0.4，下載蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的TSV 文件，并利用Cytoscape3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。通過MCODE插件進(jìn)行模塊分析，高級選項(xiàng)設(shè)置為節(jié)點(diǎn)評分cutoff=0.2、程度cutoff=2、K-core=2，最大深度=100。利用CytoHubba插件選取PPI網(wǎng)絡(luò)中最大團(tuán)中心度（MCC）排序前10位節(jié)點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.6 GO與KEGG通路富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，設(shè)置篩選條件為P＜0.05，分別選取生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組成（CC）中P值排名前10 位條目及P值排名前20 位KEGG信號通路，利用微生信網(wǎng)站進(jìn)行可視化分析。

1.7 中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)和靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)（成分、靶點(diǎn)、通路）的度值。

1.8 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.8.1 動(dòng)物

SPF級SD雄性大鼠42只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SYXK（京）2020-0033。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心恒溫（24～26 ℃）、恒濕（30%～40%）環(huán)境，自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（BUCM-4-2022011901-1098）。

1.8.2 儀器與試藥

WZ-0C6微量注射泵（浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司），SorvallST8R高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司），QB-9002 微量快速震蕩儀（Kylin-Bell Lab Instruments），EG1160 生物組織包埋機(jī)（德國Leica），2720型PCR儀（美國ABI），RM2016病理切片機(jī)（德國Leica），system electrophoresis Mupid（Mupid 2plus）電泳槽（日本TaKaRa），vortex mixer（Voltex-Genie2）漩渦混合器（美國SI），Roche LightCycler?480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（瑞士Roche），倒置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon）。

祖卡木顆粒（6 g/袋、無蔗糖，新奇康藥業(yè)股份有限公司，批號201140），醋酸地塞米松片（0.75 mg×100片，天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號CD200410b01），脂多糖（10 mg/瓶，Sigma，批號20220314），注射用青霉素鈉（160萬單位/瓶，江西省科達(dá)動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號20200917），組織細(xì)胞固定液（500 mL/瓶，北京百瑞極生物科技有限公司，批號20211213）。

1.8.3 分組及給藥

將42只大鼠隨機(jī)分為造模后6 h組和72 h組，再分別分成4個(gè)亞組，即假手術(shù)組、模型組、地塞米松組和祖卡木顆粒組，給藥組分別予相應(yīng)藥物進(jìn)行預(yù)防性治療。祖卡木顆粒組予祖卡木顆?；鞈乙海厮渲疲?.25 g/mL）1.62 g/kg灌胃，地塞米松組予醋酸地塞米松混懸液0.5 mg/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組均予生理鹽水灌胃（4 mL/kg），1次/d，連續(xù)5 d。

1.8.4 造模

末次給藥1 h后，除假手術(shù)組外，其余各組使用微量注射泵以脂多糖（5 mg/kg）氣管滴入法復(fù)制ALI模型，使藥物均勻分布于肺組織。假手術(shù)組予等量生理鹽水。造模結(jié)束后用醫(yī)用縫合針線縫合好傷口后，使用75%醫(yī)用酒精進(jìn)行消毒并腹腔注射青霉素鈉以防止感染。

1.8.5 取材

分別于造模后6、72 h進(jìn)行取材。使用1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）將大鼠麻醉后通過腹主動(dòng)脈取血的方式處死。摘取大鼠肺臟，用生理鹽水洗凈表層血跡并用濾紙吸干表層液體，于4%多聚甲醛固定液中固定右肺中葉，其余葉片于液氮中急凍后轉(zhuǎn)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8.6 HE染色觀察與評價(jià)

肺組織樣本固定24 h后制作HE染色切片，于顯微鏡下鏡檢并拍照。參照2011年美國胸科學(xué)會病理評分方法[13]對肺組織損傷進(jìn)行評分，評估指標(biāo)包括肺泡壁塌陷、肺泡間隔增厚、肺間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤和出血，按病變程度輕重分別計(jì)0～4分，計(jì)算總分。

1.8.7 RT-qPCR檢測

取存于-80 ℃肺組織，用Trizol提取樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR 分別檢測造模后6 h 肺組織CD14 mRNA表達(dá)和造模后72 h肺組織CD80、CD86 mRNA表達(dá)。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司提供，引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.8.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用-±s表示，符合正態(tài)分布樣本組間比較采用方差分析，并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 祖卡木顆?；钚猿煞旨捌浒悬c(diǎn)

通過TCMSP獲取薄荷、甘草、罌粟殼、大棗、山柰、大黃6味藥物化學(xué)成分信息，篩選得到各藥物活性成分，分別為薄荷10個(gè)、甘草92個(gè)、罌粟殼11個(gè)、大棗29個(gè)、山柰2個(gè)、大黃15個(gè)。通過檢索已發(fā)表文獻(xiàn)獲取睡蓮花、破布木果、蜀葵子、洋甘菊化學(xué)成分信息，經(jīng)過篩選獲得活性成分，分別為睡蓮花8個(gè)、破布木果9個(gè)、蜀葵子7個(gè)、洋甘菊5個(gè)。匯總10味藥物的所有活性成分，刪除重復(fù)成分，共獲得祖卡木顆粒活性成分174個(gè)。匯總174個(gè)成分的作用靶點(diǎn)，刪去重復(fù)靶點(diǎn)后共得到825個(gè)作用靶點(diǎn)，見表2。

表2 祖卡木顆粒藥物活性成分和靶點(diǎn)數(shù)

2.2 急性肺損傷相關(guān)靶點(diǎn)

通過OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫分別獲得ALI靶點(diǎn)354、7 504個(gè)，對relevance score取3倍中位數(shù)，得到990個(gè)靶點(diǎn)，合并、去重后獲得1 253個(gè)ALI相關(guān)基因。

2.3 GEO差異分析與交集分析

利用GE02R 在線工具對數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，GSE10474數(shù)據(jù)集共得到DEGs 231個(gè)（P＜0.05），其中上調(diào)基因146個(gè)，logFC＞1的有4個(gè)；下調(diào)基因85個(gè)，logFC＜-1的有8個(gè)。GSE3037數(shù)據(jù)集共獲取DEGs 438個(gè)（P＜0.05），其中上調(diào)基因283個(gè)，logFC＞1的有58個(gè)；下調(diào)基因155個(gè)，logFC＜-1的有3個(gè)。GSE2322數(shù)據(jù)集共得到差異基因1 370 個(gè)（|logFC|＞1、P＜0.05），上調(diào)基因485個(gè)，去重后得到365個(gè)；下調(diào)基因885個(gè)，去重后得到682個(gè)。匯總3個(gè)數(shù)據(jù)集的DEGs，去重后獲得1 084個(gè)。見圖1。

圖1 GEO數(shù)據(jù)庫3個(gè)數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因

2.4 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集基因

將祖卡木顆粒藥物靶點(diǎn)與ALI的疾病靶點(diǎn)、DEGs分別取交集，其中祖卡木顆粒藥物靶點(diǎn)與ALI疾病靶點(diǎn)有264個(gè)交集，交集靶點(diǎn)與DEGs取交集得到46個(gè)表達(dá)具有顯著差異的基因，作為祖卡木顆粒治療ALI關(guān)鍵靶點(diǎn)，韋恩圖見圖2。關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)信息見表3，顯著上調(diào)和下調(diào)的基因各23個(gè)。

圖2 祖卡木顆粒藥物靶點(diǎn)-ALI靶點(diǎn)差異基因韋恩圖

表3 祖卡木顆粒治療ALI關(guān)鍵靶點(diǎn)差異表達(dá)信息

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖3A）包含46 個(gè)靶點(diǎn)和487條邊。根據(jù)CytoHubba（MCC算法）篩選前10位靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)（見圖3B），得出該網(wǎng)絡(luò)核心蛋白質(zhì)。根據(jù)MCODE模塊分析得到2個(gè)模塊（見圖4）。模塊1包含26個(gè)靶點(diǎn)，得分為13.52分；模塊2包含11個(gè)靶點(diǎn)，得分為9分。

圖3 祖卡木顆粒治療ALI關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)

圖4 祖卡木顆粒治療ALI關(guān)鍵靶點(diǎn)MCODE模塊分析

2.6 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析得到394個(gè)條目，其中BP條目327個(gè)，涉及炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、凋亡、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)等；CC條目30個(gè)，與細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞外隙等有關(guān)；MF條目37個(gè)，與蛋白質(zhì)結(jié)合、金屬離子結(jié)合相關(guān)。P值前10位條目見圖5。

圖5 祖卡木顆粒治療ALI關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析

關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集分析得到137條信號通路（P＜0.05），包括晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）-17、Toll樣受體、NOD樣受體等信號通路，P值前20位信號通路見圖6。祖卡木顆粒治療ALI的機(jī)制可能與上述信號通路密切相關(guān)。

圖6 祖卡木顆粒治療ALI關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.7 中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

祖卡木顆粒治療ALI的活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)見圖7，根據(jù)度值大小對活性成分進(jìn)行排序，前3位活性成分為槲皮素、蘆丁、山柰酚，前10位活性成分信息見表4。關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)見圖8。

圖7 祖卡木顆粒治療ALI中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

圖8 祖卡木顆粒治療ALI關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

表4 祖卡木顆粒治療ALI中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)度值前10位活性成分

2.8 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.8.1 祖卡木顆粒對模型大鼠肺組織形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠肺組織形態(tài)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整、大小均一，肺泡腔內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)明顯塌陷，肺泡腔變小并伴有炎性細(xì)胞浸潤和肺間質(zhì)變厚；祖卡木顆粒組和地塞米松組大鼠肺組織形態(tài)與肺泡結(jié)構(gòu)變化較模型組有所減輕，表現(xiàn)為肺間質(zhì)充血減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少。見圖9、圖10。造模后6 h和造模后72 h，模型組肺組織損傷評分均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），祖卡木顆粒組和地塞米松組均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），祖卡木顆粒組與地塞米松組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

圖9 造模后6 h各組大鼠肺組織形態(tài)（HE染色，×200）

圖10 造模后72 h各組大鼠肺組織形態(tài)（HE染色，×200）

表5 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織損傷評分比較（±s，分）

表5 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織損傷評分比較（±s，分）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

造模后72 h 1.667±2.081**6.250±0.000 3.500±2.380**3.200±1.862**組別假手術(shù)組模型組祖卡木顆粒組地塞米松組只數(shù)4566造模后6 h 1.333±1.527**5.750±1.643 4.000±2.236*3.000±2.449*

2.8.2 祖卡木顆粒對模型大鼠肺組織CD14 mRNA表達(dá)的影響

造模后6 h，各組大鼠肺組織CD14 mRNA表達(dá)見表6。模型組大鼠肺組織CD14 mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），祖卡木顆粒組和地塞米松組明顯低于模型組（P＜0.05），祖卡木顆粒組與地塞米組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表6 各組大鼠造模后6 h肺組織CD14 mRNA表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠造模后6 h肺組織CD14 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與地塞米松組比較，#P＜0.05

CD14 0.096 7±0.028 9**0.938 0±0.060 6 0.792 0±0.289 6*#0.655 0±0.267 9*組別假手術(shù)組模型組祖卡木顆粒組地塞米松組只數(shù)4566

內(nèi)毒素是造成ALI的主要原因之一。CD14作為細(xì)胞表面的一種模式識別受體能夠識別、結(jié)合脂多糖復(fù)合物[14]。脂多糖與細(xì)胞表面的模式識別受體CD14受體結(jié)合后，活化細(xì)胞內(nèi)信號，釋放大量炎性細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)[15]。祖卡木顆粒能有效抑制ALI大鼠肺組織CD14 mRNA表達(dá)，從而減輕ALI炎癥反應(yīng)。

2.8.3 祖卡木顆粒對模型大鼠肺組織CD80、CD86 mRNA表達(dá)的影響

造模后72 h，各組大鼠肺組織CD80、CD86 mRNA 表達(dá)水平見表7。與假手術(shù)組比較，模型組CD80、CD86 mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，祖卡木顆粒組和地塞米松組CD80和CD86 mRNA表達(dá)均下降（P＜0.01，P＜0.05），祖卡木顆粒組與地塞米松組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表7 各組大鼠造模后72 h肺組織CD80、CD86 mRNA表達(dá)比較（±s）

表7 各組大鼠造模后72 h肺組織CD80、CD86 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組祖卡木顆粒組地塞米松組CD86 0.606 7±0.089 6**1.472 5±0.606 7 0.828 0±0.115 2*0.820 0±0.131 8*只數(shù)4566 CD80 0.620 0±0.087 2**3.020 0±1.436 0 1.148 3±0.493 4**1.181 7±0.595 1**

CD80和CD86是T淋巴細(xì)胞最重要的共刺激分子，主要表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞表面，與相應(yīng)配體（CD28）結(jié)合后促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)Th1、Th2和Th17反應(yīng)[16]。CD80和CD86誘導(dǎo)核因子-κB和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，在肺部炎癥和氣道反應(yīng)中起重要作用[17]。二者表達(dá)失衡會引起機(jī)體異常免疫應(yīng)答反應(yīng)[18]。祖卡木顆粒能有效抑制ALI大鼠肺組織CD80和CD86 mRNA表達(dá)升高，從而減輕肺部炎癥。

3 討論

ALI是由肺炎和吸入引起的直接損傷和全身感染、敗血癥、創(chuàng)傷引起的間接損傷引起的一種呼吸系統(tǒng)急危重癥[19]。ALI病因復(fù)雜，包括肺免疫穩(wěn)態(tài)失調(diào)、全身炎癥、器官炎癥和功能細(xì)胞凋亡障礙等，最終導(dǎo)致器官衰竭危及生命[20]。目前臨床采用生命維持和抗感染治療，主要分為機(jī)械通氣療法和藥物療法[21]。藥物包括皮質(zhì)醇類、他汀類藥物和β-激動(dòng)劑等，但常出現(xiàn)耐藥性、代謝紊亂、胃腸道紊亂等不良反應(yīng)[22]。因此，在分子水平上了解ALI發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)具有診斷和預(yù)后作用的生物標(biāo)志物，對于開發(fā)新的治療藥物十分關(guān)鍵[23]。中藥對免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，在膿毒癥并發(fā)ALI治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢[24]。ALI可歸屬中醫(yī)學(xué)“喘證”“暴喘”“喘脫”范疇，其病機(jī)可概括為熱、毒、痰、瘀，治以清熱解毒、祛痰化瘀，常用藥物包括大黃、甘草等[25]。

為闡明祖卡木顆粒對ALI的保護(hù)作用及機(jī)制，本研究利用系統(tǒng)生物信息學(xué)篩選祖卡木顆粒的有效入血成分，獲得174個(gè)藥物活性成分和46個(gè)差異基因，并構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、番瀉葉苷等是祖卡木顆?？怪嗵钦T導(dǎo)ALI的有效成分，說明祖卡木顆粒具有防治ALI的藥理成分基礎(chǔ)。槲皮素可通過抗炎、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、抗纖維化來保護(hù)內(nèi)毒素造成的ALI，其相關(guān)機(jī)制涉及JAK2/STAT3信號通路[26]、TLR4/NF-κB信號通路[27]、Nrf-2/ARE 信號通路[28]等。木犀草素能抑制TLR4/NF-κB和PI3K/Akt介導(dǎo)的MAPK信號通路保護(hù)ALI[29]。TNF、VEGFA、IL6、IL-1β、AKT1是祖卡木顆?？笰LI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子在ALI發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。VEGFA可誘導(dǎo)生理或病理性的新血管生成，進(jìn)而促進(jìn)肺血管通透性，加重肺水腫癥狀[30]。GO富集分析顯示，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)等在祖卡木顆粒抗ALI的生物過程中發(fā)揮重要作用。KEGG通路富集分析顯示，AGE-RAGE、IL-17、TNF、Toll樣受體、NOD樣受體等信號通路[31]在祖卡木顆粒治療ALI中發(fā)揮關(guān)鍵作用。晚期糖基化終末產(chǎn)物的可溶性受體（sRAGE）是肺上皮損傷的標(biāo)志。sRAGE 與表面活性蛋白（SP-D）聯(lián)合，可作為膿毒癥的生物標(biāo)志物[32]。IL-17可誘導(dǎo)肺部和氣道炎性介質(zhì)的釋放。Th17/Treg平衡是早期ARDS/ALI的重要風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)[33]。Th17細(xì)胞在急性呼吸窘迫綜合征患者外周血中顯著增加[34]。血清IL-17水平可反映ALI患者病情嚴(yán)重程度[35]。羅艷等[36]研究認(rèn)為，羅格列酮能顯著減輕脂多糖誘導(dǎo)的新生鼠ALI炎癥，其機(jī)制與降低IL-17A有關(guān)。Toll樣受體4（TLR4）參與先天免疫并通過識別脂多糖或細(xì)菌內(nèi)毒素介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，TLR4過度激活會觸發(fā)多種炎癥因子產(chǎn)生[37]。

ALI可以通過一系列免疫信號通路導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)失控。機(jī)體受到感染時(shí)，通過模式識別受體識別病原體的固有免疫系統(tǒng)作為第一道防線，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)共刺激分子表達(dá)和抗原提呈細(xì)胞成熟，活化T細(xì)胞從而引起機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[38]。CD14是模式識別受體中的一種，能單獨(dú)或與TLR4共同識別脂多糖，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[39]。金肇權(quán)等[40]研究表明，CD14-TLR4-NF-κB通路參與脂多糖誘導(dǎo)的ALI炎癥反應(yīng)。在膿毒癥患者體內(nèi)CD86明顯升高，可用于預(yù)測早期膿毒癥的發(fā)生[41]。脂多糖誘導(dǎo)的ALI小鼠的肺和脾樹突狀細(xì)胞上CD80和CD86表達(dá)升高，用白藜蘆醇預(yù)處理能降低共刺激分子的表達(dá)，減輕ALI[42]。因此，本研究通過氣管滴注脂多糖建立ALI大鼠模型對祖卡木顆粒進(jìn)行藥效學(xué)評價(jià)，結(jié)果表明，祖卡木顆粒能有效緩解脂多糖引起的ALI，并顯著抑制肺組織中CD14和共刺激分子CD80、CD86 mRNA表達(dá)，減輕機(jī)體免疫細(xì)胞的過度應(yīng)激反應(yīng)，避免細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測祖卡木顆粒抗ALI的活性成分、有效靶點(diǎn)和信號通路，并通過ALI大鼠模型進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果表明，槲皮素、木犀草素、山柰酚和番瀉葉苷可能是祖卡木顆?？笰LI的主要活性成分，祖卡木顆粒能夠有效抑制ALI大鼠肺組織CD14、CD80、CD86 mRNA表達(dá)，其機(jī)制可能與IL-17、Toll樣受體、NOD樣受體等免疫信號通路有關(guān)。本研究可為祖卡木顆粒的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供思路和依據(jù)，但仍存在一定的局限性。復(fù)方藥味眾多，成分復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并不能準(zhǔn)確反映復(fù)方君臣佐使的作用；數(shù)據(jù)庫篩選的成分未必與實(shí)際發(fā)揮作用者一致；脂多糖誘導(dǎo)的ALI大鼠模型在病理機(jī)制方面與臨床ALI患者不完全相同。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)未對更多信號通路進(jìn)行驗(yàn)證，后續(xù)將開展更深入的研究。