張國瑗，李磊，孟紅旭，王奧奧，王紫艷，胡廣，李瑛，馬彥雷，史躍，孫明謙，劉建勛

中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ㄒ韵潞喎Q“冠心病”），是多種危險因素所致的心臟疾病，由冠狀動脈血管發(fā)生粥樣硬化而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死。冠心病屬中醫(yī)學“胸痹”“真心痛”范疇，其病機為本虛標實，痰瘀互結(jié)證是冠心病的基本證型之一[1]。

疾病發(fā)展常伴隨某些代謝障礙，代謝組學可以對疾病誘導產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物變化進行分析，為中醫(yī)證型診斷的現(xiàn)代化發(fā)展提供基礎(chǔ)和方向。豬的心血管系統(tǒng)在解剖和病理機制等方面與人類相似，其實驗結(jié)果有利于推用到人，被認為是制備心血管疾病動物模型的合適動物[2]。而小型豬冠狀動脈系統(tǒng)與人類接近，本課題組在小型豬體內(nèi)建立冠心病痰瘀互結(jié)證模型，該模型既符合該病臨床發(fā)病特點，又滿足中醫(yī)學強調(diào)胸痹心痛的發(fā)病要求[3]。

人體血漿含有多種內(nèi)源性小分子代謝物，不同類別代謝物性質(zhì)復雜，增加了血漿樣品分析難度。磷脂是細胞膜的主要成分，存在于血液等生物基質(zhì)樣品中，因磷脂會與目標分析物共洗脫并離子化，引起質(zhì)譜信號的離子抑制，導致其他類成分檢測效率較低，故樣品前處理過程對實驗結(jié)果會產(chǎn)生重要影響。本研究采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLCQTOF-MS）技術(shù)和非靶向代謝組學方法，通過有機試劑沉淀蛋白與固相萃?。⊿PE）去除磷脂相結(jié)合的方法對冠心病痰瘀互結(jié)證小型豬血漿除磷脂外的代謝物進行代謝組學特征分析，探究冠心病痰瘀互結(jié)證小型豬血漿內(nèi)源性代謝物的變化。

1 材料與方法

1.1 動物

中國實驗小型豬12只，雌雄各半，體質(zhì)量15～20 kg，北京北七家美樂養(yǎng)殖場提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2018-0004。動物飼養(yǎng)、實驗操作均在中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院實驗動物中心進行，動物使用許可證號SYXK（京）2018-0018。本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院動物實驗倫理委員會審查批準（2021XLC037）。高脂飼料[4]（每100 kg含膽固醇2 kg、膽鹽0.5 kg、豬油10 kg），北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC 液相色譜系統(tǒng)、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS質(zhì)譜儀、MassLynxV4.1色譜工作站（美國Waters公司），3-18K型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），VORTEX GENIUS 3型渦旋振蕩器（德國IKA公司），Milli-Q gradient A-10純水儀（美國Millipore公司），96孔SPE裝置（美國Waters公司），Ostro 96孔SPE板（美國Waters公司）。乙腈、甲酸為色譜純，美國Fisher Scientific公司；蘇木素染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，貨號C201207），伊紅染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，貨號C200401）。

1.3 分組與造模

將小型豬隨機分為對照組和模型組，每組6只。采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合冠狀動脈血管內(nèi)皮損傷法建立冠心病痰瘀互結(jié)證小型豬模型：模型組以高脂飼料喂養(yǎng)（每只900 g/d）2周后，參照文獻[4]采用介入法行冠狀動脈血管內(nèi)皮損傷術(shù)，術(shù)后繼續(xù)予高脂飼料（劑量同前）喂養(yǎng)8周。對照組僅冠狀動脈造影，不進行介入損傷術(shù)，并予普通飼料喂養(yǎng)（每只900 g/d）。

1.4 取材

造模結(jié)束后，動物禁食14 h，鎖骨下靜脈采血 3 mL，置肝素鈉抗凝管中，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上層血漿，置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 組織病理學觀察

取心臟梗死區(qū)/非梗死區(qū)交界處心肌組織，置4%多聚甲醛溶液中固定，行HE和Masson染色后，顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)變化。

1.6 樣本處理

室溫解凍血漿樣本，充分混勻后取50 μL，加入96孔SPE板中，加入乙腈-甲醇（1∶1）混合液200 μL，劇烈振搖1 min，通過正壓裝置在板上施加約15 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）壓力，使樣品均勻流出至樣品接受盤中，直至完全排干，所接樣品溶液待測。

1.7 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：采用Waters BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫40 ℃，樣品室溫度4 ℃，流動相為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，30%B；1～10 min，30%～90%B；10～11 min，90%B；11～13 min，90%～30%B；13～15 min，30%B），流速0.3 mL/min，進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），信號采集分別采用正、負離子掃描模式，碰撞氣為高純氬，離子源溫度100 ℃，去溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣流量50 L/h，溶劑氣流量800 L/h。正離子模式下毛細管電壓+3 kV，負離子模式下毛細管電壓-2.5 kV。采用全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）模式進行centroid數(shù)據(jù)采集，一級掃描范圍m/z 50～1 200 Da，采集所有碎片信息，掃描時間0.2 s。采用甲酸鈉標準品建立質(zhì)量軸標準曲線。數(shù)據(jù)采集過程中，每3 s用Lockspray校正系統(tǒng)進行亮氨酸-腦啡肽（[M+H]+556.277 1、[M-H]+554.261 5）實時質(zhì)量校正。

1.8 數(shù)據(jù)處理

對收集的MSE數(shù)據(jù)采用Progenesis QI軟件處理，進行峰對齊、峰提取、峰鑒定等操作，使用HMDB（http://www.hmdb.ca/）對二級碎片特征進行比對并驗證，獲得代謝物信息，包括質(zhì)荷比、保留時間和峰面積等。將信息導入MetaboAnalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）并初步識別組間差異，通過模型參數(shù)Q2（模型的可預測性）和R2（模型的擬合性）評估模型質(zhì)量。將數(shù)據(jù)導入EZinfo 2.0，篩選第一主成分變量重要性投影（VIP）＞1的代謝物。以VIP＞1、差異倍數(shù)（FC）＞2且t檢驗P＜0.05 為條件篩選潛在差異代謝物。通過MetaboAnalyst 5.0結(jié)合KEGG（https://www.kegg.jp/）、HMDB數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異代謝物進行代謝通路分析，找出差異代謝物涉及的代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 模型豬心肌組織病理變化

HE染色顯示，對照組心肌組織、心肌細胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常，分布均勻且緊密，心肌纖維排列較整齊、橫紋清晰，未見纖維斷裂或變形；模型組心肌細胞肥大、排列紊亂，部分心肌細胞核增大、融合，心肌間質(zhì)水腫，裂隙明顯增寬且雜亂，心肌纖維排列無序，部分纖維斷裂，肌纖維束增寬。見圖1。

圖1 2組小型豬心肌組織形態(tài)（HE染色，標尺=100 μm）

Masson染色顯示，對照組心肌細胞呈紅色，膠原呈藍色，細胞間無明顯膠原纖維沉積，心肌細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰；模型組心肌細胞及間質(zhì)大量膠原纖維增生，心肌細胞排列扭曲，細胞腫脹、結(jié)構(gòu)模糊。見圖2。

圖2 2組小型豬心肌組織形態(tài)（Masson染色，標尺=100 μm）

2.2 血清代謝物分析

使用Progenesis QI軟件對2組數(shù)據(jù)進行峰提取和匹配，正離子模式下共識別出8 585個化合物，負離子模式下共識別出3 417個化合物。正、負離子模式下所得總離子流圖見本文OSID碼。

2.3 模式識別分析

將處理后的代謝物信息導入MetaboAnalyst 5.0，通過PLS-DA進行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，得到對照組與模型組PLS-DA得分見圖3、圖4。

圖3 2組小型豬血漿代謝物PLS-DA得分

圖4 2組小型豬血漿代謝物三維PLS-DA得分

PLS-DA結(jié)果顯示，正離子模式下，2組有明顯分離趨勢，R2=0.998，Q2=0.681；負離子模式下，模型組與對照組有明顯區(qū)別，R2=0.994，Q2=0.856。在PLS-DA得分圖（見圖3）中，橫坐標表示組間差異，縱坐標表示組內(nèi)差異，對照組與模型組分離趨勢明顯，表明模型動物血漿代謝物發(fā)生明顯改變。在相同模式下，對照組組內(nèi)差異較模型組組內(nèi)差異大，而模型組組內(nèi)差異不明顯，原因可能是去除磷脂后對照組比模型組受到的影響更為明顯。

2.4 差異代謝物篩選

通過HMDB數(shù)據(jù)庫確定代謝物結(jié)構(gòu)，以VIP＞1、FC＞2、P＜0.05為條件篩選潛在差異代謝物，正離子模式下篩選出9個代謝物，負離子模式下篩選出18個代謝物，差異代謝物主要為膽酸類、脂肪酸類、氨基酸類、?；鈮A類等（見表1）。膽酸類包括初級膽汁酸[7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸（7a,12a-dihydroxy-3-oxo-4-cholenoic acid）、3b,12a-二羥基-5a-膽酸（3b,12adihydroxy-5a-cholanoic acid）]和次級膽汁酸[（脫氧膽酸甘氨酸結(jié)合物（deoxycholic acid glycine conjugate）、別石膽酸（allolithocholic acid）]；脂肪酸類包括十六烷二酸（hexadecanedioic acid）、3-氧代十八烷酸（3-oxooctadecanoic acid）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid）等；?；鈮A類包括丁烯肉堿（butenylcarnitine）、3-羥基-9-十六碳烯酰肉堿（3-hydroxy-9-hexadecenoylcarnitine）、3-羥基十六烷基肉堿（3-hydroxyhex-adecanoylcarnitine）、(9E)-10-硝基十八烷-9- 烯酰肉堿（(9E) -10-nitrooctadec-9-enoylcarnitine）等。

表1 2組小型豬血漿潛在差異代謝物

2.5 差異代謝物相關(guān)代謝通路分析

將26個潛在差異代謝物通過MetaboAnalyst 5.0結(jié)合KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫進行代謝通路分析。結(jié)果顯示，多條代謝通路受到影響，主要包括肉堿穿梭代謝、內(nèi)源性大麻素代謝、花生四烯酸代謝、膽汁酸生物合成、亞油酸代謝、脂肪酸代謝、膽堿代謝、丙酮酸代謝、苯乙胺代謝等。

3 討論

本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合冠狀動脈血管內(nèi)皮損傷法建立冠心病痰瘀互結(jié)證小型豬模型，分析模型組與對照組血漿差異代謝物情況。

高分辨質(zhì)譜精準度受基質(zhì)效應的干擾，對血液樣品而言，主要受磷脂類物質(zhì)的干擾[5]，因此，樣本處理方法采用SPE去除磷脂。有機溶劑如乙腈、甲醇用于解離生物體液樣品，去除蛋白質(zhì)，該方法并不會去除磷脂[6]。前期研究表明，高脂飼料造模后，小型豬血漿中磷脂類成分含量較高，這類成分會對其他成分產(chǎn)生離子抑制，導致檢測成分種類相對較少，無法對冠心病痰瘀互結(jié)證的代謝途徑進行全面分析[7]。同時，磷脂類成分可以采用專門的脂質(zhì)組學方法進行深入研究，代謝組學方法很難系統(tǒng)地對小型豬脂質(zhì)組變化進行闡釋[8]。本研究樣品處理方法同時去除生物樣品中的蛋白和磷脂，著重觀察除磷脂以外的代謝物，可以降低小分子液相-質(zhì)譜分析受到的干擾，從而較為全面地分析非磷脂類差異代謝物的變化。研究結(jié)果顯示，模型組血漿內(nèi)源性小分子代謝物發(fā)生了變化：在正離子模式下，模型組與對照組3-羥基-9-十六碳烯酰肉堿、3-羥基十六烷基肉堿、2-花生四烯基甘油醚、α-亞麻酰乙醇酰胺、白三烯A4、20-COOH-白三烯E4、7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、N-肉豆蔻酰賴氨酸、吡啶啉含量有顯著差異；在負離子模式下，7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、丁烯肉堿、脫氧膽酸甘氨酸結(jié)合物、?；切苋パ跄懰帷⑹懰岣拾彼峤Y(jié)合物、甘膽酸、二十二碳六烯酸、L-乳酸、苯乙胺葡糖苷酸等含量有顯著差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血漿7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、脫氧膽酸甘氨酸結(jié)合物、3b,12a-二羥基-5a-膽酸、12-酮脫氧膽酸、?；切苋パ跄懰?、1β-羥基膽酸、石膽酸甘氨酸結(jié)合物、甘膽酸、別石膽酸含量升高，提示膽汁酸代謝增加。膽汁酸的生理作用是促進食物內(nèi)脂類的消化和吸收[9]，膽汁酸的生物合成是內(nèi)源性膽固醇的主要代謝去路，其形成是一個復雜的過程。初級膽汁酸（膽酸和鵝去氧膽酸）由膽固醇在肝細胞內(nèi)產(chǎn)生，并以?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合物的形式隨膽汁排出，再通過膽進入腸道。這些初級膽汁酸被腸道微生物去共軛、去羧基、脫氫、差向異構(gòu)，形成次級膽汁酸（脫氧膽酸和石膽酸）。本研究中模型組血漿膽酸含量整體上升，提示冠心病痰瘀互結(jié)證小型豬體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常。7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、3b,12a-二羥基-5a-膽酸這2種豬膽酸含量升高，有利于對體內(nèi)代謝異常進行調(diào)節(jié)。脫氧膽酸甘氨酸結(jié)合物、12-酮脫氧膽酸、?；切苋パ跄懰?、石膽酸甘氨酸結(jié)合物、別石膽酸5個次級膽酸含量升高，可能因為膽汁酸的重吸收障礙導致血漿中膽酸含量增加，從而引起繼發(fā)性損害。Chen等[10]研究顯示，12-酮脫氧膽酸、?；撬崦撗跄懰?、二十二碳六烯酸可作為腎臟損傷的標志物。石膽酸的酸毒性強，可引起肝膽系統(tǒng)障礙，Yang等[11]研究顯示，石膽酸能促使肝內(nèi)膽汁淤積，引起肝損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血漿?；鈮A類成分含量發(fā)生較明顯變化，其中4個為長鏈?；鈮A類成分。肉堿在線粒體脂肪代謝中起重要作用，酰基肉堿作為肉堿代謝的中間產(chǎn)物，是一類由肉堿與脂肪酸結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)相似的代謝物。在各種組織和體液中廣泛分布，能反映早期脂肪酸氧化失衡和線粒體應激狀況。其生物功能是將長鏈脂肪酸從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體基質(zhì)中進行β氧化。一些代謝性疾病也以產(chǎn)生和排出異常濃度的?；鈮A為特征。有研究表明，因線粒體脂質(zhì)過載、大量脂肪酸不完全氧化而導致線粒體應激，可能是造成體內(nèi)糖脂代謝異常的原因之一[12-14]。本研究中模型組血漿長鏈?；鈮A含量明顯增加，可能由于小型豬經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后，體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，脂肪酸氧化代謝受到干擾，進一步加劇體內(nèi)氧化應激損傷，從而導致疾病加重。

本研究還發(fā)現(xiàn)，十六烷二酸、3-氧代十八烷酸、二十二碳六烯酸3個成分含量出現(xiàn)異常，進一步提示該模型脂肪酸代謝異常。肉堿代謝紊亂導致體內(nèi)脂肪酸代謝途徑受阻，因此脂肪酸類成分含量也升高。20-COOH-白三烯E4為白三烯E4的脂質(zhì)氧化代謝物，屬于花生四烯酸類成分。白三烯E4是一種半胱氨酰白三烯，為強效炎癥介質(zhì)，可通過其受體與G蛋白和細胞內(nèi)信號通路偶聯(lián)，促進炎癥反應。這類成分含量升高提示模型小型豬體內(nèi)炎癥反應增強，可能與其脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應激壓力不斷增加、冠狀動脈內(nèi)皮拉傷有關(guān)。

目前采用代謝組學進行冠心病痰瘀互結(jié)證生物信息學分析的報道相對較少，本研究基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，采用有機溶劑沉淀蛋白和SPE相結(jié)合的樣品處理方法，對冠心病痰瘀互結(jié)證小型豬血漿除磷脂外的代謝物進行代謝組學特征分析，篩選出7a,12a-二羥基-3-氧代-4-膽氨酸、3b,12a-二羥基-5a-膽酸、脫氧膽酸甘氨酸結(jié)合物、別石膽酸、十六烷二酸、3-氧代十八烷酸、二十二碳六烯酸、丁烯肉堿、3-羥基-9-十六碳烯酰肉堿、3-羥基十六烷基肉堿、(9E)-10-硝基十八烷-9-烯酰肉堿等26個差異代謝物，涉及肉堿穿梭代謝、花生四烯酸代謝、膽汁酸生物合成、膽堿代謝、丙酮酸代謝等途徑。本研究對冠心病痰瘀互結(jié)證發(fā)病機制進行一定程度的闡釋，今后將繼續(xù)進行更深層次研究，為臨床治療提供更多依據(jù)。