王蘭蘭，薛惠天，孫夢(mèng)龍，阮磊，黃博，彭亮

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

骨骼肌損傷是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中的常見(jiàn)損傷，90%以上骨骼肌損傷由挫傷或肌肉過(guò)度拉傷造成[1]。骨骼肌損傷的快速恢復(fù)需要一系列細(xì)胞和調(diào)控因子參與，其中肌纖維的持續(xù)變性、炎癥和纖維化都是影響肌肉再生的重要因素[2-3]。病理性纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積引起正常組織被膠原瘢痕取代所致，導(dǎo)致組織功能障礙[3]。推拿對(duì)骨骼肌損傷纖維化相關(guān)疾病療效顯著[4-5]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的促炎因子，肌肉損傷后炎癥因子侵入損傷部位，炎癥反應(yīng)的性質(zhì)、持續(xù)時(shí)間和程度可對(duì)肌肉修復(fù)或纖維化產(chǎn)生重大影響[3，6-8]。鞘氨醇激酶-1（SphK1）屬于SphKs中的一員，主要位于細(xì)胞質(zhì)，在鞘脂代謝過(guò)程中發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶和關(guān)鍵限速酶的作用。SphK1能夠?qū)⑶拾贝嫁D(zhuǎn)化為1-磷酸鞘氨醇（S1P）[9]。S1P是一種多生物活性鞘脂，是真核細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要介質(zhì)。S1P與細(xì)胞膜上S1P受體（S1PR）結(jié)合后發(fā)揮作用，以調(diào)節(jié)對(duì)生物過(guò)程至關(guān)重要的信號(hào)通路，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫細(xì)胞運(yùn)輸和炎癥[10]。S1PR 是G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族成員，包括5個(gè)亞型。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞過(guò)程中，SphK1/S1PR3信號(hào)通路發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。此外，該信號(hào)通路軸也是結(jié)締組織生長(zhǎng)因子發(fā)揮促纖維化作用的途徑[12]。本研究通過(guò)推拿手法中的?法對(duì)股四頭肌急性鈍挫傷兔進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)股四頭肌組織形態(tài)和TNF-α含量及SphK1、S1PR3蛋白表達(dá)的影響，探討?法促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)的可能機(jī)制，并為?法的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

新西蘭兔15 只（雌性7 只、雄性8 只），體質(zhì)量2.5～3 kg，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2020-0005。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心普通級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境由實(shí)驗(yàn)室按最適溫度和濕度統(tǒng)一控制。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（LLBH-202206270004）。

1.2 主要試劑與儀器

兔TNF-α ELISA 試劑盒（湖南艾方生物，貨號(hào)AF-00660R1），DAPI（武漢Servicebio，貨號(hào)G1012），HE染液（武漢Servicebio，貨號(hào)G1005），Masson染液（武漢Servicebio，貨號(hào)G1006），中性樹(shù)膠（國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)10004160），SphK1一抗（武漢三鷹，貨號(hào)10670-1-AP），S1PR3 一抗（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab126622），β-actin 一抗（武漢Servicebio，貨號(hào)GB15001），戊巴比妥鈉（德國(guó)Merck 公司，貨號(hào)P3761）。病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)RM2016），組織攤片機(jī)（金華市科迪儀器，型號(hào)KD-P），包埋機(jī)（武漢俊杰，型號(hào)JB-P5），掌上離心機(jī)（武漢Servicebio，型號(hào)D1008E），脫色搖床（武漢Servicebio，型號(hào)TSY-B），勻漿儀（武漢康濤科技有限公司，型號(hào)KZ-Ⅱ），電泳儀（北京六一儀器廠，型號(hào)DYY-6C），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek，型號(hào)Epoch），顯微鏡（日本尼康，型號(hào)Eclipse E100），自制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?法器（授權(quán)公告號(hào)CN216365872U）。

1.3 分組及造模

將15只新西蘭兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和?法組，每組5只。參考文獻(xiàn)[13-14]方法并改進(jìn)，采用自制重力錘打擊裝置制備骨骼肌急性鈍挫傷模型。將兔仰臥位固定于兔架上，右后肢內(nèi)側(cè)剃毛，將厚約1 cm的脫脂棉墊于右后肢股四頭肌遠(yuǎn)心端下方，使其近心端和遠(yuǎn)心端在同一水平。選取右后肢股四頭肌肌腹（約髕底上3.5 cm）中段，以2 cm為直徑畫(huà)圓圈作為打擊部位，在打擊部位覆蓋一層紗布防止皮膚受損。打擊時(shí)實(shí)驗(yàn)人員雙手固定兔股四頭肌上下端，由專(zhuān)人控制重力錘，使重力錘沿導(dǎo)向管自由下落，同一部位連續(xù)打擊6次，高度40 cm，打擊面積約1.77 cm2，動(dòng)能3.33 J，沖量2.38 Ns。以打擊部位皮膚出現(xiàn)明顯腫脹及瘀血，無(wú)皮膚受損及骨折，觸碰打擊部位時(shí)有躲避反射為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)量并記錄造模后損傷部位距髕底距離。

1.4 干預(yù)及取材

造模后第7日，使用本團(tuán)隊(duì)前期設(shè)計(jì)的模擬?法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?法器（詳細(xì)介紹見(jiàn)本文OSID碼）對(duì)?法組兔股四頭肌損傷處進(jìn)行干預(yù)，最大壓力3 N，滾動(dòng)頻率140次/min，3 min/次，上下午各1次，連續(xù)3 d?？瞻捉M和模型組固定相同時(shí)間。末次干預(yù)24 h后取材，3%戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉處死兔，選取股四頭肌損傷最嚴(yán)重處病灶組織取材，若損傷不明顯，則選取造模標(biāo)記部位組織取材，將組織置于冰上快速分離肌肉和筋膜，并將肌肉組織分成3份，1份置于4%多聚甲醛，另外2份置于-80 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 HE染色

取出用4%多聚甲醛固定的股四頭肌組織，手術(shù)刀修剪，放入脫水盒，脫水機(jī)內(nèi)梯度乙醇進(jìn)行脫水，浸蠟，包埋機(jī)包埋，石蠟切片機(jī)切片（厚4 μm），將股四頭肌石蠟切片依次進(jìn)行脫蠟，蘇木素、伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5.2 Masson染色

股四頭肌石蠟切片依次進(jìn)行脫蠟（二甲苯2次，每次20 min；梯度乙醇2次，每次5 min；水洗），重鉻酸鉀染色，鐵蘇木素染色，麗春紅酸性品紅染色，磷鉬酸染色，苯胺藍(lán)染色，1%冰醋酸分化，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明5 min，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察，采集圖像進(jìn)行分析。

1.5.3 ELISA檢測(cè)

剪取適量股四頭肌組織，加入一定量PBS，勻漿器充分勻漿，3 000 r/min離心20 min，收集上清液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：加樣，加酶，溫育，配液，洗滌，顯色，終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，波長(zhǎng)450 nm測(cè)量各孔吸光度（OD值），計(jì)算組織中TNF-α含量。

1.5.4 Western blot檢測(cè)

PBS洗滌股四頭肌組織，剪碎后置于勻漿管中，加入勻漿珠、蛋白酶抑制劑、裂解液制成勻漿，冰上裂解30 min，振蕩使組織完全裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)過(guò)制膠、蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育（β-actin 一抗1∶2 000、SphK1一抗1∶3 000、S1PR3一抗1∶3 000，β-actin、SphK1、S1PR3二抗1∶5 000）、顯影曝光，以β-actin為內(nèi)參，AlphaEaseFC處理系統(tǒng)分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ?法干預(yù)對(duì)模型兔股四頭肌病理變化的影響

HE染色顯示，空白組兔肌纖維、肌束形態(tài)完整，肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核分布于肌膜下方，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組可見(jiàn)肌纖維變形、斷裂，肌細(xì)胞壞死嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，由大量結(jié)締組織填充，肌膜模糊、不完整，且肌纖維溶解形成空泡結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)少量細(xì)胞核居中的新生肌纖維；?法組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減輕，可見(jiàn)大量細(xì)胞核居中且大小不等的新生肌纖維和多核肌管，結(jié)締組織明顯減少，肌膜較完整。見(jiàn)圖1。

圖1 各組兔股四頭肌形態(tài)（HE染色，×200）

Masson染色中紅色表示肌纖維，藍(lán)色表示膠原纖維?？瞻捉M兔股四頭肌肌纖維排列整齊，可見(jiàn)少量膠原纖維；模型組肌纖維間隙明顯增大、排列分散，膠原纖維沉積明顯增多，纖維粗大，包繞于肌細(xì)胞、肌膜周?chē)?，表明纖維化已形成；?法組兔肌纖維間隙較模型組減小，肌細(xì)胞排列整齊，膠原纖維生成減少。見(jiàn)圖2。

圖2 各組兔股四頭肌形態(tài)（Masson染色，×200）

2.2 ?法干預(yù)對(duì)模型兔股四頭肌組織腫瘤壞死因子-α含量的影響

與空白組比較，模型組兔股四頭肌組織TNF-α含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，?法組兔股四頭肌組織TNF-α含量明顯減少（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組兔股四頭肌組織TNF-α含量比較（±s，pg/g）

表1 各組兔股四頭肌組織TNF-α含量比較（±s，pg/g）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

TNF-α 2 125.95± 47.47 3 122.25±298.07**2 615.26±365.82#組別空白組模型組?法組只數(shù)555

2.3 ?法干預(yù)對(duì)模型兔股四頭肌組織鞘氨醇激酶-1和1-磷酸鞘氨醇受體3蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組兔股四頭肌組織SphK1、S1PR3蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型比較，?法組兔股四頭肌組織SphK1、S1PR3蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

表2 各組兔股四頭肌組織SphK1、S1PR3蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組兔股四頭肌組織SphK1、S1PR3蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

S1PR3 0.434±0.103 0.956±0.190**0.739±0.114#組別空白組模型組?法組只數(shù)555 SphK1 0.301±0.134 1.034±0.127**0.775±0.138#

圖3 各組兔股四頭肌組織SphK1、S1PR3蛋白免疫印跡

3 討論

骨骼肌急性鈍挫傷是由鈍器造成的機(jī)械損傷，常引起肌細(xì)胞受損、毛細(xì)血管破裂及浸潤(rùn)性出血、水腫、炎癥等。此外，由于血管和周?chē)M織廣泛受損，氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法到達(dá)神經(jīng)和肌肉細(xì)胞，組織損傷將進(jìn)一步加重[15]。骨骼肌損傷包括炎癥、再生和纖維化3個(gè)階段[16]，損傷后的炎癥反應(yīng)和纖維化是骨骼肌修復(fù)的必經(jīng)過(guò)程。促炎因子過(guò)表達(dá)會(huì)加劇肌肉損傷，通過(guò)正反饋通路增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[17]。過(guò)度纖維化也是影響肌肉愈合的主要障礙，骨骼肌纖維化由細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積引起，導(dǎo)致骨骼肌功能和活動(dòng)受限，影響肌肉損傷后再生；此外，纖維化還增加了肌肉損傷的易感性，易發(fā)生再次損傷[18-20]。因此，降低骨骼肌炎癥反應(yīng)及纖維化，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞再生是促進(jìn)骨骼肌損傷后修復(fù)的重要研究方向。

TNF-α是參與炎癥反應(yīng)的促炎因子之一，在組織損傷初期，TNF-α水平升高，并且由于其對(duì)細(xì)胞壞死的作用而持續(xù)升高[17]。研究表明，高水平TNF-α可能導(dǎo)致成肌細(xì)胞和肌細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致肌肉萎縮[21]。SphK1/S1P/S1PR信號(hào)通路被認(rèn)為是治療癌癥和炎癥性疾病的關(guān)鍵通路[22]。TNF-α 能激活位于細(xì)胞質(zhì)的SphK1，活化的SphK1易位到質(zhì)膜上，催化鞘氨醇磷酸化生成S1P[23]。在L929成纖維細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞中，TNF-α誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2表達(dá)上調(diào)及促炎介質(zhì)前列腺素E2的產(chǎn)生依賴(lài)SphK1的激活和S1P的合成[24]。此外，TNF-α誘導(dǎo)特定細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子（如IL-6、RANTES、MCP-1和VCAM-1）的轉(zhuǎn)錄也需要SphK1 的激活[25]。TNF-α 受體相關(guān)因子2（TRAF2）是TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)的重要中間體，SphK1含有TRAF2 結(jié)合位點(diǎn)[26]，其直接與TRAF2 結(jié)合產(chǎn)生S1P，S1P在N端指環(huán)結(jié)構(gòu)域與TRAF2結(jié)合，促進(jìn)賴(lài)氨酸-63連接的受體相互作用蛋白多泛素化、IκB激酶和IκBα磷酸化及IκBα降解，從而導(dǎo)致核因子-κB激活[27]。因此，抑制TNF-α/SphK1/S1P信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)減輕炎癥具有重要意義。此外，SphK1與組織纖維化也密切相關(guān)，SphK1能夠促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1表達(dá)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解[28]；抑制SphK1表達(dá)導(dǎo)致TGF-β刺激膠原蛋白生成受阻，還可能誘導(dǎo)成纖維化細(xì)胞凋亡，從而減少纖維化[29-30]。S1P異常激活會(huì)促進(jìn)炎癥、纖維化等發(fā)生[30]，活化的S1P主要與S1PR發(fā)生一系列反應(yīng)[31]，敲除S1PR2、S1PR3或SphK1均可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的體外肌成纖維細(xì)胞分化[32]；S1P在臀肌攣縮患者肌肉中表達(dá)升高，外源性S1P刺激可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，增加膠原和其他纖維化因子的合成[33]。S1PR3參與不同組織如骨骼肌、肺臟和肝臟的纖維化發(fā)展[11，34-35]，S1PR3及其下游信號(hào)通路被認(rèn)為是成肌細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞的候選靶點(diǎn)[36]，而肌成纖維細(xì)胞在纖維化發(fā)生中起主要作用[37]。因此，纖維化的發(fā)生也與SphK1/S1P/S1PR3信號(hào)通路密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，骨骼肌損傷后，模型組兔股四頭肌組織TNF-α含量及SphK1、S1PR3表達(dá)明顯高于空白組，HE染色顯示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，肌纖維變形斷裂，肌細(xì)胞壞死嚴(yán)重，肌膜模糊不完整，且有肌纖維溶解后形成的空泡結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)少量新生肌纖維，Masson染色顯示大量膠原纖維，說(shuō)明造模成功。?法組兔股四頭肌組織TNF-α含量及SphK1、S1PR3表達(dá)明顯低于模型組，HE染色可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減輕，有大量新生肌纖維和多核肌管，Masson染色顯示膠原纖維較模型組明顯減少，提示?法可能通過(guò)降低TNF-α含量，減少SphK1激活和下游因子S1P產(chǎn)生，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)S1P介導(dǎo)的核因子-κB激活，并阻斷S1P與S1PR3的信號(hào)傳導(dǎo)，從而發(fā)揮減緩炎癥和纖維化的作用。

綜上所述，?法干預(yù)能抑制骨骼肌急性鈍挫傷兔受損組織TNF-α含量SphK1、S1PR3表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，減緩組織纖維化，促進(jìn)肌細(xì)胞新生，從而促進(jìn)骨骼肌損傷后修復(fù)。本研究可為?法治療骨骼肌損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，?法對(duì)TNF-α/SphK1/S1PR3信號(hào)通路的上下游調(diào)節(jié)機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。