楊洋，徐立軍，吳宗耀，黃明進(jìn)

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/石斛研究院/貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000）

手掌參又名掌參、佛手參或太平參[1]，蒙古名為額日赫騰乃一嘎日，藏名為旺拉嘎[2]，是蘭科植物手參[Gymnadenia conopsea（L.）R.Br]的干燥塊莖，因其地下根莖形似手掌而得名[3]。手掌參作為藏藥和蒙藥，是復(fù)方“手掌參八味湯”[4]和“蒙藥手掌參—37 味丸”[5]中的傳統(tǒng)藥方。本草文獻(xiàn)《西藏常用中草藥》記載其可治療慢性肝炎[6]；《東北藥植志》記載：“制成粘液，用于中毒和瀉下，泡酒為強(qiáng)壯、強(qiáng)精劑”；《中國(guó)植物志》[3]中記載：“手掌參有補(bǔ)腎益精、理氣止痛的功效?！薄吨兴幋筠o典》記載：“補(bǔ)血益氣、活血止痛及益腎健脾，主治肺虛咳喘，虛勞消瘦，腰腿酸軟、陽痿、尿頻、神經(jīng)衰弱、乳少、久瀉、慢性肝炎及跌打損傷等癥[7]”。手掌參有抗過敏、抗矽肺纖維化作用、促進(jìn)祖細(xì)胞增殖以及抑制乙型肝炎病毒表面抗原、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)和延緩衰老等作用[8-11]。手掌參在海拔265~4 700 m 的山坡林下、草地或礫石灘草叢中均能生長(zhǎng)，分布在朝鮮、日本、俄羅斯西伯利亞至歐洲一些國(guó)家，我國(guó)主要在黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、甘肅東南部、四川西部至北部、云南西北部和西藏東南部（察隅）等有一定野生資源存量[3]。因生長(zhǎng)環(huán)境的多樣性，手掌參初級(jí)代謝產(chǎn)物具有很大差異，研究報(bào)道西藏林芝手掌參營(yíng)養(yǎng)成分主要為糖、粗纖維和蛋白質(zhì)，總糖平均含量為39.27%、粗纖維為9.3 %、灰分為1.04%，必需氨基酸含量占氨基酸總量的34.19%[12]。因此，為分析評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地手掌參主要成分的組成及其含量，對(duì)研究培育高品質(zhì)藥材及其種植技術(shù)、指導(dǎo)藥材采收和評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

S-433D 氨基酸全自動(dòng)分析儀（日本W(wǎng)AKO 株式會(huì)社）、HGK-55 全自動(dòng)凱氏定氮儀（上海赫冠儀器有限公司）、HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市鴻科儀器廠）、PR224ZH 電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]、TANKPE030 純水機(jī)、ZD-A 臺(tái)式回轉(zhuǎn)振蕩器（太倉市華美生化儀器廠）、SX-5-12 型箱式電阻爐控制箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

手掌參藥材分別從西藏米林縣、波密縣、朗縣和昌都市以及四川理塘縣、阿壩縣和巴塘縣等各藥材市場(chǎng)的藥農(nóng)手中購買，經(jīng)西藏藏醫(yī)藥大學(xué)徐立軍鑒定為蘭科植物手參G. conopsea 的干燥塊莖。每個(gè)產(chǎn)區(qū)隨機(jī)購買3 份，取樣混合粉碎后進(jìn)行成分分析。

無水乙醇（重慶川東化工集團(tuán)有限公司）、鹽酸（重慶川東化工集團(tuán)有限公司）、石油醚（天津市富與精細(xì)化工有限公司）、硼酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、無水碳酸鈉（成都金山化學(xué)試劑有限公司）、氫氧化鈉（成都金山化學(xué)試劑有限公司）、濃硫酸[重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司]均為分析純，17 種氨基酸混合標(biāo)品（日本W(wǎng)AKO 株式會(huì)社）。

1.3 試驗(yàn)方法

手掌參粗蛋白質(zhì)、水分、灰分和多糖含量分析分別采用《中國(guó)藥典》2020 版通則0731 中全自動(dòng)凱式定氮儀法、0832 中烘干法、2302 中灰分測(cè)定法和黃精多糖含量測(cè)定法[13]；粗脂肪含量分析采用GB5009.6 2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》中的第二法——酸水解法；粗纖維含量的分析采用的酸性洗滌劑法（ADF)[14]；氨基酸采用GB5009.124 2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》。

手掌參粗蛋白質(zhì)等物質(zhì)組分含量采用最小顯著差數(shù)法，5 種物質(zhì)組分與13 種氨基酸進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，用組間連接法及平方歐式距離測(cè)量法分別對(duì)手掌參物質(zhì)組分及水解氨基酸進(jìn)行聚類分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 26 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗蛋白質(zhì)等物質(zhì)組分含量分析

7 批手掌參藥材物質(zhì)組分測(cè)定結(jié)果，見表1，以干燥品計(jì)，每100g手掌參中，各物質(zhì)組分平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為粗蛋白3.87g（3.08~4.44）、多糖5.88g（3.35~8.58）、粗脂肪0.37 g（0.25~0.53）、粗纖維5.54 g（4.25~8.20）、水分11.12 g（9.09~16.83）、灰分7.21 g（72.59~89.31）和總氨基酸含量平均為3.13%（2.46%~3.49%），括號(hào)內(nèi)分別為7 個(gè)（批）樣本檢測(cè)到的最小值和最大值。7個(gè)（批）手掌參藥材樣本的粗蛋白質(zhì)、多糖、粗脂肪和粗纖維含量差異極顯著（P ＜0.01），水分和灰分有顯著差異（P ＜0.05）。

表1 7 批手掌參藥材各物質(zhì)組分含量（n=3，±s）Table 1 Determination of components content in 7 batches of G.conopsea 單位：%

表1 7 批手掌參藥材各物質(zhì)組分含量（n=3，±s）Table 1 Determination of components content in 7 batches of G.conopsea 單位：%

注：同列不同肩標(biāo)小寫字母表示差異顯著（P ＜0.05）；同列不同肩標(biāo)大寫字母表示差異極顯著（P ＜0.01）。Note:Different shoulder markings in the same column have significant differences in lowercase letters (P ＜0.05);In the same column,there was a significant difference in the representation of different shoulder capitals(P ＜0.01).

批次Batch粗纖維Crude fiber 1阿壩 3.68±0.08C 8.29±0.18A 0.40±0.01AB 12.73±0.02a 87.95±0.00ab 5.29±0.26BC 2朗縣 3.93±0.02BC 6.97±0.54B 0.35±0.02AB 9.30±0.00a 89.12±0.00a 5.03±0.14BC 3波密 4.06±0.05B 3.57±0.12D 0.46±0.05A 10.81±0.00a 82.36±0.05b 6.06±0.25B 4巴塘 4.17±0.03AB 4.42±0.10D 0.37±0.04AB 11.27±0.00a 87.29±0.00ab 5.07±0.04BC 5米林 3.13±0.03D 5.75±0.19C 0.37±0.01AB 11.12±0.02a 89.24±0.00a 7.30±0.46A 6理塘 4.41±0.03A 5.92±0.17C 0.30±0.04B 11.66±0.00a 86.85±0.00ab 5.28±0.22BC 7昌都 3.68±0.10C 6.21±0.22BC 0.34±0.02AB 10.93±0.00a 87.63±0.00ab 4.74±0.25C平均值 3.87 5.88 0.37 11.12 87.21 5.54產(chǎn)區(qū)Product area粗蛋白質(zhì)Crude protein多糖Polysaccharide粗脂肪Crude fat水分Moisture content灰分Ash

2.2 水解氨基酸含量分析

水解氨基酸是通過酸解將待測(cè)植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、多肽等氨基酸鏈水解成單個(gè)氨基酸，因此水解氨基酸能夠反映樣品中單個(gè)氨基酸的種類和含量[15]。但酸水解法會(huì)使谷氨酰胺和天門冬酰胺分別轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼岷吞於彼醄16]。因此，本研究酸水解法僅能檢測(cè)17 種氨基酸，7批手掌參樣品各氨基酸含量測(cè)定結(jié)果，見表2。

表2 7 批手掌參水解氨基酸相對(duì)含量Table 2 Analysis of relative content of hydrolyzed amino acids in 7 batches of G.conopsea 單位：%

由表2 可知，米林縣的手掌參水解氨基酸種類最為豐富，有17 種；其次是理塘縣、阿壩縣、巴塘縣和昌都市4 個(gè)產(chǎn)地含有15 種，理塘縣、阿壩縣和昌都市未檢測(cè)出胱氨酸和甲硫氨酸，巴塘縣未檢測(cè)出胱氨酸和組氨酸；朗縣和波密縣的手掌參水解氨基酸種類豐富度較低，有14 種水解氨基酸，未檢測(cè)出胱氨酸、甲硫氨酸和組氨酸?？偘被岷科骄鶠?.13%（2.46%~3.49%），括號(hào)內(nèi)為7 批藥材范圍。水解氨基酸總質(zhì)量最高是巴塘縣（3.64%），最低是昌都市（2.5%）。手掌參含8 種藥用氨基酸，分別是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸和亮氨酸（因能維持機(jī)體氮平衡所需，故將其稱為藥用氨基酸[17]）。按照Zhao等[18]和Rotzoll 等[19]方法，將水解氨基酸分為鮮味、甜味、苦味和鹽味氨基酸4 種呈味氨基酸（Delicious Amino Acids,DAA）。7 批手掌參樣品中呈味氨基酸含有：（1）鮮味氨基酸（Umami、Glu 和Asp）2 種；（2）甜味氨基酸（Sweet、Ala、Gly、Pro、Ser 和Thr）5 種；（3）苦味氨基酸（Bitter、His、Lys、Val、Tyr、Phe、Ile、Leu 和Arg）8種；（4）鹽味氨基酸（Salty、Cys 和Met）2 種。含必需氨基酸有6 種，以及10 種非必需氨基酸，EAA 百分總含量最高為朗縣（1.30%），最低為昌都市（0.91%）。

2.3 相關(guān)性分析

將手掌參藥材中5 種物質(zhì)組分、13 種氨基酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析（Cys、Met、Tyr 和His 含量太低且不是7 批藥材所共有，不納入相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)）。部分水解氨基酸兩兩之間呈顯著性正相關(guān)或極顯著正相關(guān)，蛋白質(zhì)與天冬氨酸呈極顯著正相關(guān)，且與精氨酸呈顯著正相關(guān)，見圖1。

圖1 手掌參主要成分相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of primary metabolites of G.conopsea

天冬氨酸與蘇氨酸和賴氨酸均屬于天冬氨酸族，合成前體都是草酰乙酸，呈正相關(guān)關(guān)系；丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸均屬于丙氨酸族，都是以丙酮酸為起始物，呈正相關(guān)關(guān)系；絲氨酸與甘氨酸都是以3-磷酸甘油酸（來自糖酵解）為起始物，生成絲氨酸，再經(jīng)轉(zhuǎn)羥甲基酶（輔酶FH4）作用形成甘氨酸，因此兩者之間成極顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.4 聚類分析

以蛋白質(zhì)、多糖、粗脂肪、粗纖維和灰分含量為變量參數(shù)，利用系統(tǒng)聚類法，對(duì)7 批不同產(chǎn)地手掌參藥材進(jìn)行聚類，構(gòu)建譜系圖，將樣本劃分為不同產(chǎn)地類群進(jìn)行評(píng)價(jià)。由聚類圖2 可看出，在平方歐氏距離20 處可將手掌參7 個(gè)產(chǎn)地聚為3 類：第一類為朗縣、昌都市、理塘縣和阿壩縣；第二類為波密縣和巴塘縣；第三類為米林縣。在距離為1 時(shí)所有樣本完全分離，盡管7批藥材樣本采集自不同產(chǎn)區(qū)，但仍有較強(qiáng)的相似性。聚類分析表明，因產(chǎn)地生態(tài)氣候環(huán)境的不同，引起或?qū)е率终茀K莖物質(zhì)組分含量發(fā)生了變化，其產(chǎn)地環(huán)境是影響手掌參藥材質(zhì)量不可缺失的重要因素，測(cè)試分析結(jié)果可為培育高品質(zhì)及不同物質(zhì)類型手掌參藥材提供參考。

圖2 7批手掌參蛋白質(zhì)、多糖、粗脂肪、粗纖維和灰分含量聚類圖Fig.2 Cluster diagram of protein,polysaccharide,crude fat,crude fiber and ash content of 7 batches of G.conopsea

以13 種共有水解氨基酸含量為變量參數(shù)，用組間連接法、平方歐式距離測(cè)量法，對(duì)7 批不同產(chǎn)地手掌參藥材進(jìn)行聚類，構(gòu)建譜系圖（圖3）。當(dāng)間距為10 時(shí)，其聚為3 類，其中理塘縣、巴塘縣及波密縣聚為一類；昌都市、米林縣及阿壩縣聚為一類，朗縣單獨(dú)聚為一類。

圖3 7 批手掌參氨基酸聚類圖Fig.3 Amino acid cluster diagram of 7 batches of G.conopsea

2.5 不同根莖類藥材初級(jí)代謝物含量比較

植物初級(jí)（生）代謝產(chǎn)物也是動(dòng)物賴以生存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為動(dòng)物提供能量、滿足營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)及維持機(jī)體健康等方面有重要意義，世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的膳食纖維攝入量為成人每天27.0~40.0 g[20]，氨基酸能為動(dòng)植物補(bǔ)充能量，是動(dòng)植物所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。通過文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析（圖4），紫山藥[21,22]、丹參[23,24]、甘草[25-27]中多糖、纖維和氨基酸等物質(zhì)組分含量及其分配情況不同，但與手掌參一樣，都呈現(xiàn)高多糖、高蛋白、高纖維和低脂肪的特點(diǎn)。

圖4 根莖類藥材粗纖維、粗脂肪、蛋白質(zhì)、多糖和總氨基酸百分含量比較Fig.4 Comparison of crude fiber,crude fat,protein,polysaccharide and total amino acid content of rhizome medicinal materials

3 結(jié)論與討論

手掌參藥材物質(zhì)組成成分總體上呈現(xiàn)出低脂、富含多糖、蛋白質(zhì)和粗纖維等特點(diǎn)，水解氨基酸測(cè)定結(jié)果顯示，手掌參至少含有8 種藥用氨基酸、2 種鮮味氨基酸、6 種必需氨基酸和10 種非必需氨基酸，其中必需氨基酸、藥用氨基酸和鮮味氨基酸的含量較高；聚類分析，不同產(chǎn)地手掌參多糖、蛋白質(zhì)、粗纖維和粗脂肪等物質(zhì)組分可聚為3 類，分別具有富含多糖、纖維等特征；大多數(shù)物質(zhì)組分之間呈正相關(guān)關(guān)系。

植物在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)迥異并影響植物有機(jī)體生命活動(dòng)的初級(jí)（生）代謝產(chǎn)物，如糖、蛋白質(zhì)、脂類、氨基酸、酶和核酸等物質(zhì)組分。初級(jí)代謝產(chǎn)物是植物體的重要組成部分和維持生命活動(dòng)的重要載體，在植物適應(yīng)環(huán)境、調(diào)節(jié)生理功能等方面也發(fā)揮重要作用，還能產(chǎn)生多種次級(jí)（生）代謝產(chǎn)物[28]。植物生長(zhǎng)的溫度、光照、濕度和生長(zhǎng)年限等都是影響初級(jí)代謝產(chǎn)物形成的重要因素，李影影等[29]研究了南方紅豆杉在自然光照條件下初生代謝產(chǎn)物的含量比遮蔭條年下得到有效提高。本研究中，7 批手掌參樣品來自西藏朗縣、米林縣、波密縣、昌都市，四川巴塘縣、理塘縣和阿壩縣，分別從西向東分布，經(jīng)緯度逐漸增加，在海拔高度、降雨量、溫濕度和土壤類型等方面應(yīng)存在較大不同。分析結(jié)果表明，手掌參初級(jí)代謝產(chǎn)物出現(xiàn)不同組分含量差異，并分別表現(xiàn)出以多糖、粗纖維和氨基酸等為特征的手掌參藥材類型。多糖隨經(jīng)緯度增加呈現(xiàn)先降低、后升高的趨勢(shì)，但因樣本量較少，有待進(jìn)一步分析判斷。據(jù)研究表明，提取方法不同，氨基酸的含量也有差異，后續(xù)可進(jìn)一步研究手掌參采用不同提取方法測(cè)定氨基酸的含量差異[30]。手掌參是川藏道地藥材、民族藥材（藏藥和蒙藥），從初級(jí)代謝產(chǎn)物多糖、蛋白質(zhì)、灰分和氨基酸等含量可以反映不同產(chǎn)地來源手掌參藥材的質(zhì)量現(xiàn)狀，分析結(jié)果可為手掌參藥材的培育技術(shù)研究、質(zhì)量評(píng)價(jià)和資源開發(fā)利用提供一定參考。