王洪峰,關(guān) 雙,李 雪,房 良,夏 偉,梁與時(shí),孟相秋,張 劍,田志軍
(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,黑龍江哈爾濱 150069;2. 哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司,黑龍江哈爾濱 150069;3. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;4. 吉林正業(yè)生物制品股份有限公司,吉林吉林 132011)
豬偽狂犬?。≒seudorabies,PR)是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的一種急性傳染病,在豬群呈暴發(fā)流行,常引起妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、新生仔豬大量死亡,育肥豬發(fā)生嚴(yán)重的呼吸道癥狀和增重滯緩、種豬不育,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
免疫接種是防制豬偽狂犬病的主要策略,豬偽狂犬病活疫苗(Bartha K61 株)是上世紀(jì)60 年代匈牙利科學(xué)家通過(guò)細(xì)胞傳代培養(yǎng)獲得的基因缺失弱毒株,在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用和認(rèn)可。但2011 年下半年以來(lái),國(guó)內(nèi)許多免疫過(guò)豬偽狂犬病活疫苗(Bartha K61 株)的規(guī)?;i場(chǎng)出現(xiàn)了疑似豬偽狂犬病流行,本單位從14 個(gè)豬場(chǎng)采集樣品,均分離到PRV 強(qiáng)毒。gE 基因序列分析顯示最近流行的PRV 位于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支中,與以前分離的毒株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。豬偽狂犬病活疫苗Bartha K61 株免疫易感動(dòng)物綿羊和仔豬,用新分離的PRV HeN1 株進(jìn)行攻擊,證實(shí)免疫Bartha K61 株疫苗不能提供對(duì)PRV HeN1 株攻擊的完全保護(hù)。因此,我們認(rèn)為豬偽狂犬病病毒發(fā)生變異,亟待研發(fā)新的疫苗。
我們將PRV HeN1 株在細(xì)胞上連續(xù)低溫傳代培養(yǎng)和藥物篩選,獲得了一株在Us 區(qū)缺失gI、gE、Us9、Us2 及部分反向重復(fù)序列、UL 區(qū)的TK 基因內(nèi)部缺失716bp 的5 基因缺失病毒,命名為豬偽狂犬病病毒TP 株。動(dòng)物試驗(yàn)表明豬偽狂犬病病毒TP 株具有良好的安全性,且對(duì)國(guó)內(nèi)流行毒株的免疫保護(hù)效力優(yōu)于Bartha K61 株,是一株優(yōu)良的候選疫苗株。
為了使豬偽狂犬病活疫苗(TP 株)凍干制品物理性狀良好,病毒損失小,我們進(jìn)行了凍干保護(hù)劑優(yōu)化和凍干工藝的研究,摸索出了適合于該疫苗規(guī)模化生產(chǎn)的凍干工藝。
1.1 病毒液 豬偽狂犬病病毒TP 株病毒液,病毒含量為108.0 TCID50/mL,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所制備。
1.2 Vero E6 細(xì)胞 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定、保管和供應(yīng)。
1.3 細(xì)胞培養(yǎng)液 完全培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 U(μg)/mL 的DMEM 液;細(xì)胞維持液為含青、鏈霉素各100 U(μg)/mL 的DMEM液;DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清,均購(gòu)自GIBCO 公司。
2.1 凍干保護(hù)劑的篩選
2.1.1 保護(hù)劑的配制 按如下方法配制蔗糖明膠保護(hù)劑。
(1)不同濃度蔗糖保護(hù)劑的配制 在凍干保護(hù)劑中蔗糖的添加量分別為30%、35%、40%、45%和50%,明膠添加量均為8%。
(2)不同濃度明膠保護(hù)劑的配制 在凍干保護(hù)劑中明膠的添加量分別為6%、7%、8%、9%和10%,蔗糖添加量均為40%。
2.1.2 凍 干 將豬偽狂犬病病毒TP 株病毒液分別與不同的凍干保護(hù)劑均按照8∶1 的比例混合后,定量分裝,2 mL/瓶,進(jìn)行冷凍真空干燥。
2.1.3 檢 驗(yàn) (1)性 狀 觀察制品的顏色及狀態(tài),加入稀釋液后的溶解狀態(tài)。
(2)病毒含量測(cè)定 將不同保護(hù)劑凍干的病毒液分別用DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行10 倍系列稀釋?zhuān)?0-5、10-6、10-7、10-8、10-95 個(gè)稀釋度,分別接種長(zhǎng)成良好單層的Vero E6 細(xì)胞,每個(gè)稀釋度接種8 孔,100 μL/孔,置37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。每天觀察細(xì)胞病變,記錄細(xì)胞病變(早期可見(jiàn)細(xì)胞膨大、圓縮,逐漸形成網(wǎng)狀病灶)情況,按照Reed-Muench 法計(jì)算TCID50。
2.2 凍干比例的優(yōu)化 將豬偽狂犬病病毒TP 株病毒液與含8%明膠、含40%蔗糖的蔗糖明膠保護(hù)劑分別按5∶1、6∶1、7∶1、8∶1 和9∶1 的比例混合后,定量分裝,2 mL/瓶,進(jìn)行冷凍真空干燥。凍干后制品按2.1.3 的方法進(jìn)行性狀檢驗(yàn)及病毒含量測(cè)定。
2.3 凍干工藝的優(yōu)化 將豬偽狂犬病病毒TP 株病毒液與含8%明膠、含40%蔗糖的蔗糖明膠保護(hù)劑按8∶1 的比例混合后,定量分裝,2 mL/瓶,按如下方法進(jìn)行凍干曲線的優(yōu)化。凍干后制品均按2.1.3項(xiàng)進(jìn)行檢驗(yàn)。
2.3.1 預(yù)凍階段預(yù)凍速度的優(yōu)化 分別采用速凍法和慢凍法對(duì)制品進(jìn)行預(yù)凍,其他凍干環(huán)節(jié)采用既有曲線,篩選最優(yōu)的預(yù)凍方法。
2.3.2 預(yù)凍階段凍結(jié)時(shí)間的優(yōu)化 采用最佳預(yù)凍速度對(duì)制品進(jìn)行凍干,設(shè)定凍結(jié)時(shí)間分別為1 h、2 h 和3 h,篩選最優(yōu)的凍結(jié)時(shí)間。
2.3.3 升華階段一期干燥溫度的優(yōu)化 一期干燥分別設(shè)定升華溫度-10~10 ℃、5~10 ℃梯度、10℃進(jìn)行凍干,篩選最優(yōu)的干燥溫度。
2.3.4 升華階段一期干燥時(shí)間的優(yōu)化 一期干燥分別設(shè)定升華時(shí)間8 h、11 h 和14 h 進(jìn)行凍干,篩選最優(yōu)的干燥時(shí)間。
2.3.5 產(chǎn)品加熱最高許可溫度及時(shí)間的優(yōu)化 對(duì)產(chǎn)品加熱的最高許可溫度及時(shí)間進(jìn)行考察,設(shè)立三個(gè)梯度,即25 ℃加熱4 h、35 ℃加熱3.5 h、40 ℃加熱3 h,篩選產(chǎn)品加熱最高許可溫度及最優(yōu)時(shí)間。
3.1 凍干保護(hù)劑的篩選 分別對(duì)蔗糖明膠保護(hù)劑中蔗糖和明膠的添加量進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,蔗糖添加量為40%、明膠添加量為8%時(shí),凍干的制品性狀較好,病毒含量較高,詳見(jiàn)表1 和表2。
表2 不同明膠濃度凍干后樣品檢驗(yàn)結(jié)果
3.2 凍干比例的優(yōu)化 將病毒液與凍干保護(hù)劑按照不同比例混合后凍干,觀察制品的外觀,并測(cè)定病毒含量。結(jié)果表明,當(dāng)病毒液與凍干保護(hù)劑按8:1 的比例凍干后,病毒含量較高,且性狀較好,詳見(jiàn)表3。
表3 凍干比例優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果
3.3 凍干工藝優(yōu)化結(jié)果
3.3.1 預(yù)凍階段預(yù)凍速度的優(yōu)化 分別采用速凍法和慢凍法對(duì)制品進(jìn)行預(yù)凍,結(jié)果表明,采用速凍法凍干后制品性狀較好,病毒含量較高,詳見(jiàn)表4。
表4 預(yù)凍速度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果
3.3.2 預(yù)凍階段凍結(jié)時(shí)間的優(yōu)化 設(shè)定凍結(jié)時(shí)間分別為1 h、2 h 和3 h,對(duì)制品進(jìn)行凍干。結(jié)果表明,凍結(jié)時(shí)間2 h 和3 h,凍干制品的性狀較好,病毒含量較高,詳見(jiàn)表5。
表5 凍結(jié)時(shí)間優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果
3.3.3 升華階段一期干燥溫度的優(yōu)化 一期干燥分別設(shè)定升華溫度-10~10 ℃、5~10 ℃、10 ℃進(jìn)行凍干。結(jié)果表明,升華溫度為5~10 ℃,凍干后制品的性狀較好,病毒含量較高,詳見(jiàn)表6。
表6 一期干燥溫度優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果
3.3.4 升華階段一期干燥時(shí)間的優(yōu)化 一期干燥分別設(shè)定升華時(shí)間8 h、11 h 和14 h 進(jìn)行凍干。結(jié)果表明,升華時(shí)間11 h 和14 h,凍干后制品的性狀較好,病毒含量較高,詳見(jiàn)表7。
表7 干燥時(shí)間優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果
3.3.5 加熱最高許可溫度及時(shí)間的優(yōu)化 對(duì)產(chǎn)品加熱的最高許可溫度及時(shí)間進(jìn)行考察,設(shè)立三個(gè)梯度,即25 ℃加熱4 h、35 ℃加熱3.5 h、40 ℃加熱3 h。結(jié)果表明,25 ℃加熱4 h,凍干后制品的性狀較好,病毒含量較高,詳見(jiàn)表8。
表8 加熱最高許可溫度及時(shí)間優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果
明膠蔗糖保護(hù)劑是最為傳統(tǒng)最為常見(jiàn)的保護(hù)劑,并且廣泛應(yīng)用于獸用生物制品,不但價(jià)格低廉,而且生物活性存活率高,保存期長(zhǎng)。但蔗糖明膠保護(hù)劑的組分濃度、病毒液與保護(hù)劑配比對(duì)該凍干制品的物理性狀、病毒含量存在一定影響。我們通過(guò)調(diào)整蔗糖明膠保護(hù)劑中蔗糖和明膠的比例、調(diào)整病毒液和凍干保護(hù)劑的添加比例,確定蔗糖添加量為40%、明膠添加量為8%配制的保護(hù)劑,病毒液與其按8:1 的比例凍干的制品性狀較好,病毒含量較高。
分別采用速凍法和慢凍法對(duì)制品進(jìn)行凍干,結(jié)果表明,速凍法凍干后樣品性狀較好,病毒含量較高,因此確定采用速凍法對(duì)樣品進(jìn)行凍干。對(duì)預(yù)凍時(shí)間、一期干燥第一步干燥溫度、干燥時(shí)間、加熱的最高許可溫度及時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,預(yù)凍時(shí)間1 h、一期干燥第一步干燥溫度為5~10 ℃、干燥時(shí)間為14 h、干燥溫度25 ℃維持4 h,為最優(yōu)的凍干曲線。盡管凍干工藝摸索還不夠細(xì)致,數(shù)據(jù)還不盡詳實(shí),但對(duì)豬偽狂犬病活疫苗(TP 株)的生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。
在規(guī)?;a(chǎn)中,可以在我們已優(yōu)化的凍干曲線基礎(chǔ)上對(duì)預(yù)凍時(shí)間、升華階段(一期干燥)溫度和時(shí)間、解析干燥(二期干燥)最高許可溫度及時(shí)間進(jìn)行微調(diào),增加摻氣段并對(duì)摻氣真空度進(jìn)行調(diào)整,能夠降低干燥溫度,縮短干燥時(shí)間,從而縮短疫苗凍干周期,提高工作效率,降低能源(水、電)消耗,降低生產(chǎn)成本。
5.1 蔗糖明膠保護(hù)劑中蔗糖的添加量為40%、明膠添加量為8%。
5.2 病毒液與凍干保護(hù)劑的最佳比例為8∶1。
5.3 采用速凍法對(duì)樣品進(jìn)行凍干。
5.4 預(yù)凍時(shí)間 1h、一期干燥第一步干燥溫度為5~10℃、干燥時(shí)間為14 h、干燥溫度25 ℃維持4 h,為最優(yōu)的凍干曲線。