俞 月，何清湖,2，李 玲，邱麗婷，鄺 敏，姚昆鵬

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南 懷化 418000）

上呼吸道感染實質(zhì)上為鼻腔、咽或喉部急性炎癥的總稱，狹義的上呼吸道感染俗稱“感冒”“傷風(fēng)”[1]。上呼吸道感染約占所有呼吸道感染的87.5%，其發(fā)病主要涉及鼻、咽、喉等部位，表現(xiàn)為噴嚏、鼻塞、流鼻涕、咽喉腫痛等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。目前的治療方案多采用抗菌藥物、抗病毒藥物、鎮(zhèn)咳藥物、解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥物等[3]。然而，有部分人群容易反復(fù)罹患上呼吸道感染，或患病后遷延難愈，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一大難題。中醫(yī)學(xué)認為，此類“傷風(fēng)”“感冒”患者多有“肺氣不足”之征象，選用補益肺脾的方劑對防治上呼吸道感染有一定作用[4-5]。研究[6-7]表明，玉屏風(fēng)散能夠調(diào)節(jié)反復(fù)上呼吸道感染患者的機體免疫功能，減少復(fù)發(fā)次數(shù)，縮短病程，且無明顯不良反應(yīng)，但其具體效應(yīng)機制并不明晰。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)，探討玉屏風(fēng)散防治上呼吸道感染的潛在機制，以期為臨床用藥提供一定借鑒，并促進玉屏風(fēng)散的現(xiàn)代藥理學(xué)研究。

1 資料與方法

1.1 玉屏風(fēng)散活性成分、作用靶點獲取及中藥歸經(jīng)可視化 通過TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫分別以黃芪、白術(shù)、防風(fēng)為關(guān)鍵詞檢索玉屏風(fēng)散的活性成分。篩選條件：口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%，類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18。將有效成分導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取有效成分的作用靶點，將上述靶點導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），獲取靶點對應(yīng)的基因名。利用TCMIP數(shù)據(jù)平臺、2020年版《中華人民共和國藥典》收集并分析中藥歸經(jīng)信息，檢索中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫查閱相關(guān)文獻確定中藥歸經(jīng)，通過Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建玉屏風(fēng)散歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖，依據(jù)連接度值（Degree）大小對歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的各臟腑重要度進行排序，列出連接Degree值，分析玉屏風(fēng)散對經(jīng)絡(luò)的選擇性。

1.2 上呼吸道感染的疾病靶點檢索及“活性成分-作用靶點-疾病”作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）數(shù)據(jù)庫，獲取上呼吸道感染的疾病靶點。為明確玉屏風(fēng)散與上呼吸道感染靶點間的相互作用，使用TBtools軟件將活性成分的作用靶點與疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖。將交集靶點導(dǎo)入STRING（https://STRING-db.org），最低互動得分設(shè)置為0.9，去除游離節(jié)點，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction net-work，PPI）。將PPI導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，采用Network analyzer計算Degree值，構(gòu)建“活性成分-作用靶點-疾病”作用網(wǎng)絡(luò)模型，明確其有效成分。將交集基因?qū)隒ytoscape 3.8.0，利用其內(nèi)置的CytoNCA插件，進行拓撲分析后，篩選介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、借助度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（Eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity-based method，LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC），對靶標進行篩選，選擇大于所有指標中位數(shù)的基因進行后續(xù)分析。結(jié)合BioGPS數(shù)據(jù)庫進行組織特異性表達篩選，明確拓撲分析后的基因所屬組織特異性，剔除非特異性靶標，得到關(guān)鍵靶點。

1.3 功能和通路富集分析 取PPI中的靶點，利用R語言DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview等相關(guān)程序包對交集基因進行基因本體功能富集（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomics，KEGG）富集分析。GO分析選擇生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組成（CC）3個部分進行，通路分析選擇KEGG，并繪制相關(guān)條形圖和氣泡圖。

1.4 分子對接 選擇“活性成分-作用靶點-疾病”作用網(wǎng)絡(luò)模型中度值排名前10的活性化合物作為配體，取拓撲分析結(jié)合組織特異性表達篩選后的關(guān)鍵靶點作為受體，進行分子對接。通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載中藥成分的SDF文件，在PDB數(shù)據(jù)庫（http://www1.rcsb.org/）下載核心靶點相關(guān)蛋白的2D結(jié)構(gòu)，利用PyMOL 2.4.0軟件去除靶蛋白中的配體和非蛋白分子（如水分子）。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件對晶體結(jié)構(gòu)進行加氫處理，并計算蛋白質(zhì)電荷，所有配體和受體文件均保存為pdb格式。使用Autodock Vina 1.1.2軟件進行分子對接，計算最低結(jié)合能，使用PyMol 2.4.0軟件進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 玉屏風(fēng)散活性成分、作用靶點及中藥歸經(jīng)可視化 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，獲取玉屏風(fēng)散的活性成分45種，其中黃芪20種，防風(fēng)18種，白術(shù)7種。根據(jù)活性成分進行作用靶點篩選，刪除冗余和無靶點的成分，最終得到活性成分38種，對應(yīng)靶點193個。（見表1）根據(jù)TCMIP數(shù)據(jù)平臺、2020年版《中華人民共和國國藥典》、中國知網(wǎng)獲取玉屏風(fēng)散中藥的歸經(jīng)信息，構(gòu)建中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖。（見圖1）依據(jù)連接度值排序，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)連接度值最高的經(jīng)絡(luò)為脾經(jīng)，度值為3；其余依次為肺經(jīng)、膀胱經(jīng)、胃經(jīng)、肝經(jīng)，度值均為1。結(jié)果表明，玉屏風(fēng)散對機體脾經(jīng)、肺經(jīng)、膀胱經(jīng)等經(jīng)絡(luò)選擇性較高，其主要通過干預(yù)上述經(jīng)絡(luò)到達病位發(fā)揮治療作用。（見表2）

圖1 玉屏風(fēng)散中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 玉屏風(fēng)散的部分有效成分信息

表2 玉屏風(fēng)散中藥-歸經(jīng)表

2.2 上呼吸道感染的疾病靶點及“活性成分-作用靶點-疾病”作用網(wǎng)絡(luò) 通過GeneCards、OMIM、PharmGkb檢索上呼吸道感染的疾病靶點，依次得到7 694、118、611個靶點。刪除重復(fù)后，得到疾病靶點7 914個。再經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫進行轉(zhuǎn)化，將玉屏風(fēng)散活性成分對應(yīng)的193個靶點與上呼吸道感染7 914個靶點取交集，得到170個潛在靶標。（見圖2）將潛在靶標上傳到STRING平臺，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進行可視化。（見圖3）采用Cytoscape 3.8.0軟件進行分析，構(gòu)建“活性成分-作用靶點-疾病”作用網(wǎng)絡(luò)模型。該網(wǎng)絡(luò)中共有206個節(jié)點和512條邊。（見圖4）利用Cytoscape 3.8.0插件CytoNCA行拓撲分析，選擇介度中心性（BC）、接近中心性（CC）、借助度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、局部邊連通性（LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）對靶標進行篩選，選擇大于所有指標中位數(shù)的基因進行后續(xù)分析。兩次篩選標準如下。第一次：BC：72.67，CC：0.21，DC：7.00，EC：0.05，LAC：2.50，NC：3.33；第二次：BC：17.00，CC：0.57，DC：10.00，EC：0.14，LAC：4.86，NC：5.91。（見圖5）將篩選到的靶標逐個輸入BioGPS數(shù)據(jù)庫進行組織特異性表達篩選，篩選標準：（1）靶點為最高表達；（2）組織特異性表達水平>中位數(shù)的5倍。（見表3）最終得到11個關(guān)鍵靶點，即TP53、HIF1A、TNF、CDKN1A、MAPK14、FOS、AKT1、MAPK1、STAT1、RELA、MYC。（見表4）將上述靶標進行后續(xù)分子對接。

圖2 玉屏風(fēng)散活性成分靶點與上呼吸道感染靶點韋恩圖

圖3 玉屏風(fēng)散活性成分-主要靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 玉屏風(fēng)散“活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 交集靶點的拓撲分析

表3 BioGPS 數(shù)據(jù)庫組織特異性表達篩選結(jié)果

表4 關(guān)鍵靶點信息

2.3 功能和通路富集分析 對玉屏風(fēng)散防治上呼吸道感染的交集靶點進行GO/KEGG富集分析，限定P＜0.05，獲得2 768個GO條目及176條通路。相關(guān)信號通路包括AGE-RAGE、IL-17、TNF信號通路等。GO條目發(fā)現(xiàn)生物過程（BP）共2 362條，涉及細胞對活性氧的反應(yīng)、抗生素反應(yīng)、金屬離子反應(yīng)、活性氧代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)等；分子功能（MF）共197條，涉及蛋白激酶復(fù)合物、質(zhì)膜筏、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；細胞組成（CC）共209條，涉及磷酸酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、類固醇激素受體、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。（見圖6）

圖6 玉屏風(fēng)散活性成分-疾病靶點富集分析

2.4 分子對接 選取玉屏風(fēng)散“中藥成分-作用靶點-疾病”圖中度值排名前10的活性成分與11個關(guān)鍵靶點進行分子對接，并繪制熱圖。（見圖7～8）各活性成分與靶點的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，表明結(jié)合度較好。其中beta-sitosterol與AKT1的最低結(jié)合能數(shù)值最低，具有良好的擬合性。

圖7 中藥成分-關(guān)鍵靶點對接熱圖

圖8 活性成分-關(guān)鍵靶點分子對接示意圖

3 討論

玉屏風(fēng)散出自宋代醫(yī)家張松《究原方》，由防風(fēng)、黃芪、白術(shù)3味藥組成。方中黃芪甘溫，歸脾、肺經(jīng)，外可益氣固表止汗，內(nèi)可健運脾胃中氣，為君藥；白術(shù)甘溫，歸脾、胃經(jīng)，可健脾益氣，助黃芪益氣實衛(wèi)而密腠理，使汗不外泄，風(fēng)寒邪氣不得從肌膚而入；防風(fēng)辛甘溫，歸膀胱、肝、脾經(jīng)，有辛潤疏風(fēng)之功效?！鹅`樞·本臟》云：“衛(wèi)氣者，所以溫分肉，充肌膚，肥腠理，司開闔者也?！比幒嫌?，強衛(wèi)氣，溫分肉，充肌膚，肥腠理，助開闔，恰似御風(fēng)之屏障，有貴重如玉之本意，名為“玉屏風(fēng)散”。玉屏風(fēng)散的中藥歸經(jīng)主要為脾經(jīng)、肺經(jīng)、膀胱經(jīng)、胃經(jīng)、肝經(jīng)，其益氣固表的效用可能是通過作用至上述經(jīng)絡(luò)，從而起效。其方僅3味中藥，簡而效宏，多被用于治療反復(fù)上呼吸道感染、過敏性鼻炎、蕁麻疹屬肺脾氣虛而外感風(fēng)邪者，以及腎小球腎炎易于傷風(fēng)感冒而致病情反復(fù)者[8-10]。上呼吸道感染實際上為機體免疫失衡，感染病毒或細菌的表現(xiàn)。對于反復(fù)發(fā)作的患者而言，適逢受涼、天氣變化、過度疲勞均可誘發(fā)此病。對于大多數(shù)人群而言，本病并未影響健康狀況，但對于老幼體弱、患有慢性呼吸道疾病的人群而言，本病極易引發(fā)其他疾病，甚至出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥。增強免疫力，提高抗細菌、抗病毒能力是防治上呼吸道感染的關(guān)鍵，尤其是對于老年人與嬰幼兒而言[11-12]。

本研究共得出中藥成分38種，其中包括3β-乙酞氧基蒼術(shù)酮、8β-乙氧基蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、14-乙酰基-12-千里光?；?8-順式折術(shù)三醇、漢黃芩素、β-谷甾醇、5-O-甲基維斯阿米醇、槲皮素、山奈酚、芒柄花素等成分，表明上述成分可能是玉屏風(fēng)散發(fā)揮效用的物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步通過文獻檢索，探討了玉屏風(fēng)散各成分的藥理作用。臨床研究表明，玉屏風(fēng)散治療上呼吸道感染具有良好的療效，對其他呼吸道疾病也具有一定的防治作用[6,13-15]。黃芪在調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒、糖尿病、延緩衰老等方面具有重要作用，其具體成分以多糖、三萜、黃酮等成分為主[16-18]。周怡錦等[19]通過構(gòu)建肺脾氣虛反復(fù)呼吸道感染（recurrent respiratory tract infection，RRTI）大鼠模型，探究不同劑量黃芪甲苷對輔助性T細胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）平衡的影響，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可能通過抑制白細胞介素-6（IL-6）/酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）信號通路，促進肺脾氣虛RRTI模型大鼠Th17/Treg細胞的平衡，從而達到防治反復(fù)呼吸道感染的作用。黃芪甲苷Ⅳ可促進H1N1觸發(fā)的自噬體和溶酶體的形成，顯著降低白細胞介素-1β（IL-1β）的表達，減輕炎癥因子風(fēng)暴，從而可有效干預(yù)宿主H1N1感染[20]。白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的作用，為常見的菊科藥用植物[21]。其化學(xué)成分涵蓋半萜和三萜類、聚乙炔類、多糖類、香豆素和苯丙素類、黃酮和黃酮苷類、苯醌類、三萜類、甾體類及其他類，其生物學(xué)效應(yīng)主要集中在抗衰老、延緩神經(jīng)退行性疾病、抑制神經(jīng)細胞凋亡、抗腦缺血、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、抗血小板聚集、抗腫瘤、抗炎、保肝及改善胃腸道功能障礙等方面[22-25]。白術(shù)有健脾益氣之功效。在玉屏風(fēng)散的配伍組成中，白術(shù)通過補益脾胃、健運中洲，發(fā)揮“培土生金”、補益肺氣的功效[26]。有學(xué)者使用白術(shù)多糖干預(yù)硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠，并采用腸道微生物群分析和非靶向糞便和血漿代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明白術(shù)多糖可調(diào)整潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道微生物群，促進短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，還可以調(diào)節(jié)消化食物，從而起到調(diào)整腸道菌群代謝的作用[27]。曹艷霞等[28]研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖可降低運動應(yīng)激性潰瘍模型大鼠的胃潰瘍指數(shù)，提高胃黏膜組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低胃黏膜組織丙二醛（MDA）含量，促進B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）表達，抑制促凋亡蛋白（Bax）表達。白術(shù)多糖可有效提高胃黏膜的抗氧化能力，抵抗胃黏膜損傷所致的細胞凋亡[28]。防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)未抽花莖植株的干燥根，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效，現(xiàn)在多用于防治外感風(fēng)寒、周身疼痛、頭痛目眩、風(fēng)寒濕痹、骨節(jié)疼痛[29]。防風(fēng)中化學(xué)成分主要為多糖、色原酮、揮發(fā)油、香豆素等活性成分，具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、提高免疫力、抗凝血、抗過敏等藥理活性[30-31]。有研究表明，防風(fēng)提取物具有抗增殖和抗氧化活性，對慢性髓性白血病急變期細胞（K562）、白血病細胞（HL60）、乳腺癌細胞（MCF7）等人類腫瘤細胞株具有抗增殖作用，對人乳腺癌細胞（MDA-MB-468）具有拮抗作用，對脂多糖活化的單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）具有抗氧化、抗炎的特性[32]。

在得出170個交集基因后，本研究使用拓撲分析的方法，結(jié)合BioGPS數(shù)據(jù)庫進行組織特異性篩選，共得到11個關(guān)鍵靶點，即腫瘤蛋白p53（TP53）、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF1A）、腫瘤壞死因子（TNF）、周期素依賴性激酶抑制因子1A（CDKN1A）、絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、原癌基因（FOS）、蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、絲裂原激活蛋白激酶1（MAPK1）、信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、原癌基因（MYC）。GO/KEGG富集分析結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)散防治上呼吸道感染主要涉及細菌來源分子反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、抗生素反應(yīng)、缺氧、細胞凋亡等生物學(xué)過程及晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）、白細胞介素-17（IL-17）、TNF等信號通路。這表明玉屏風(fēng)散可能通過作用于AGE-RAGE、IL-17、TNF信號通路，調(diào)控TP53、HIF1A、TNF等靶點，從而發(fā)揮防治上呼吸道感染的作用。TP53是17號染色體的基因，TP53負責(zé)誘導(dǎo)細胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA修復(fù)或代謝改變，這與人類多種生物學(xué)過程密切相關(guān)[33]。有學(xué)者探討了TP53對SARS-CoV-2受體ACE2基因的調(diào)控作用，結(jié)果表明TP53的缺陷會導(dǎo)致組織和性別特異性的表達變化[34]。HIF-1普遍存在于人和哺乳動物細胞內(nèi)，常氧下也有表達，但合成的HIF-1蛋白很快即被細胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解，只有在缺氧條件下HIF-1才可穩(wěn)定表達。其涉及缺氧、免疫、炎癥反應(yīng)、胚胎發(fā)育等多種生物學(xué)進程[35-36]。SARS-CoV-2 ORF3a可誘導(dǎo)線粒體損傷和線粒體ROS的產(chǎn)生，從而促進HIF-1α的表達。這表明HIF-1α在促進SARS-COV-2感染和誘導(dǎo)COVID-19的炎癥反應(yīng)中起重要作用。此外，該研究亦發(fā)現(xiàn)，HIF-1α還可廣泛促進其他病毒的感染。HIF-1α可能是中藥治療呼吸道感染性疾病的重要靶標[37-38]。AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號通路均介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展，亦參與呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展[39-41]。

分子對接結(jié)果顯示，槲皮素、山奈酚、漢黃芩素與FOS、AKT1等靶點具有良好的切合度。FOS可與Jun家族的蛋白質(zhì)聚合，形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1，而AP-1調(diào)控了細胞的諸多進程，如分化、增殖、凋亡等。在應(yīng)對壓力、細菌和病毒的感染時，其通過調(diào)節(jié)自身及靶基因的表達量，從而發(fā)揮特定的效應(yīng)[42]。AKT1則是細胞凋亡與糖代謝的關(guān)鍵基因，目前對其的研究主要集中在肺癌、急性胰腺炎等疾病中，AKT1的異常激活可能是機體糖代謝障礙及細胞過度凋亡的關(guān)鍵因素[43-44]。分子對接結(jié)果顯示，TP53、HIF1A、TNF、CDKN1A、MAPK14、FOS、AKT1、MAPK1、STAT1、RELA、MYC等靶點與玉屏風(fēng)散中各中藥成分的結(jié)合度較好，可能是其防治上呼吸道感染的潛在靶標。

綜上所述，玉屏風(fēng)散可能通過調(diào)節(jié)自身免疫，介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗生素反應(yīng)、細胞凋亡等一系列生物學(xué)反應(yīng)，激活A(yù)GE-RAGE、IL-17、TNF等信號通路，調(diào)控TP53、HIF1A、TNF等靶點，從而發(fā)揮防治上呼吸道感染的作用。然而，由于本研究尚缺乏有效的實驗作為驗證，且目前受數(shù)據(jù)庫收錄靶點信息及疾病相關(guān)信息的限制，需開展體內(nèi)外實驗驗證預(yù)測靶點，以期進一步指導(dǎo)臨床治療。