賀宇文，黃勇，周汝順，李劍鋒，陳福華，李艷平，劉芬，周宇駿，李裕※

（1.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南 長沙 410006；2.寧鄉(xiāng)市動植物疫病預(yù)防控制中心，湖南 寧鄉(xiāng) 410600；3.湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009；4.湖南中科基因技術(shù)有限公司，湖南 長沙 410205）

豬喘氣病是一種豬場常見的疾病。豬喘氣病的病原微生物是豬肺炎支原體。治療豬喘氣病可使用支原體敏感的抗生素，但由于治療周期較長，易產(chǎn)生耐藥，往往治療效果一般。預(yù)防豬喘氣病可使用滅活疫苗或弱毒疫苗，但由于抗原靶位多且難以激活細(xì)胞免疫等多種因素，不能實現(xiàn)完美的免疫效果。豬場一旦有喘氣病的發(fā)生，很難根除，嚴(yán)重影響豬場生產(chǎn)效益。目前，豬場對豬喘氣病的防控是將疫苗接種、抗生素治療、環(huán)境消毒、淘汰陽性豬這四種手段聯(lián)合使用[1-2]。環(huán)境消毒是防控豬喘氣病病原體傳播的一個重要的環(huán)節(jié)。艾條熏蒸是我國傳統(tǒng)中醫(yī)的一種空氣消毒方法。艾條熏蒸的優(yōu)點是容易實施，可以帶豬消毒，成本低。有研究表明艾熏對某些細(xì)菌和病毒有較好的消毒效果[3-4]，并且發(fā)現(xiàn)艾熏消毒在某些方面優(yōu)于紫外消毒[5-7]。因此，我們通過艾熏試驗來檢測艾熏對環(huán)境中豬肺炎支原體的消毒效果。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肺炎支原體CD013 株，分離自湖南省常德地區(qū)某豬場。

自配KM2 液體培養(yǎng)基：10 g /L 水解乳蛋白Hank's 液400 mL；DMEM400 mL；豬血清200 mL；酵母浸液10 mL；青霉素200 IU/mL；酚紅4 g/L；pH值調(diào)至7.6。

200 μL、1000 μL research plus 可調(diào)移液器（可整支高壓滅菌），德國Eppendorf 公司出品。

定量分析濾紙，直徑9 cm，高壓滅菌。50 mL 具塞離心管，高壓滅菌。0.45 μm 針頭式細(xì)菌濾器。200 μL、1000 μL 移液器槍頭，高壓滅菌。生理鹽水，高壓滅菌。

1.2 試驗分組

在某專業(yè)養(yǎng)豬場，選擇相鄰兩棟豬舍的兩個位置等同的欄舍，分成A、B 兩組。

1.3 試驗設(shè)計

在A組、B組欄舍的四個角交叉固定繩子，用繩子和夾子將濾紙懸掛在欄舍四角和中間位置，每個位置兩張，濾紙底部離地面15~20 cm。共20 張濾紙。

將豬肺炎支原體CD013 株用KM2 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至飽和濃度。取飽和濃度的培養(yǎng)液，用無菌生理鹽水10 倍稀釋，充分混勻后，用移液器在放置好的每張濾紙上準(zhǔn)確滴加250 μL。

A 組采用艾條熏蒸，熏蒸時間2 小時。B 組不熏蒸。

1.4 CCU 測定方法

熏蒸完成后，將每張定量分析濾紙取下，分別放置于50 mL 具塞離心管中，加入10 mL 無菌生理鹽水浸泡、振蕩10 分鐘，用一次性注射器吸取約2 mL，用0.45 μm 細(xì)菌濾器過濾，得到20 份待測液，用于下一步操作。

每份樣品取10 支無菌試管，分別加入1.8 mL KM2 液體培養(yǎng)基。用無菌槍頭從待測液中吸取0.2 mL 混勻后的液體加入第1 支試管中，棄去槍頭。另取一支無菌槍頭將第2 支試管中的液體反復(fù)吹打均勻。第3 至第9 支試管按上述操作進(jìn)行。第9 支試管充分混勻后吸取0.2 mL 液體棄去。第10 支試管只加入1.8 mL KM2 液體培養(yǎng)基作為空白對照管。蓋上膠塞并用封口膜密封，37℃恒溫箱孵育1周。第8 天觀察試管中培養(yǎng)基的顏色變化情況，發(fā)生顏色變化的最高稀釋倍數(shù)一管為被測支原體的濃度（CCU）。

2 結(jié)果與分析

從表1 中可知，未熏蒸的濾紙中，豬肺炎支原體的CCU 可達(dá)108或107。經(jīng)過熏蒸1 小時的濾紙中支原體的CCU 大多為104或103，比未艾熏的對照組低3 個數(shù)量級或4 個數(shù)量級。結(jié)果表明艾熏對豬肺炎支原體有較好的殺滅效果。

表1 不同位置濾紙CCU 值結(jié)果

3 討論

豬喘氣病是豬場疫病難題之一，仍未被徹底解決?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體能黏附豬肺上皮細(xì)胞、豬腎細(xì)胞、豬肺巨噬細(xì)胞等多種豬源細(xì)胞[8,9]；其脂膜蛋白對豬肺泡上皮細(xì)胞有抑制作用[10]；能對多種豬源細(xì)胞造成氧化損傷等[11]。豬肺炎支原體的致病機制仍需大量的科研工作進(jìn)一步闡明。

面對豬喘氣病的現(xiàn)實問題，我們從實用角度出發(fā)，設(shè)想將艾條熏蒸作為帶豬消毒方法，對現(xiàn)有的防控手段進(jìn)行有效補充。艾條熏蒸易于操作、安全有效，在醫(yī)院和家庭都有著較廣泛的應(yīng)用[12,13]，但在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用的報道不多。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油有很好的殺菌效果。有學(xué)者認(rèn)為艾熏的消毒效果是由艾條燃燒生成的自由基中間體產(chǎn)生作用。寧佐偉等[14]嘗試歸納分析艾煙的消毒機制，例如艾熏時彌漫于空氣中的揮發(fā)油組分和產(chǎn)生的燃煙自由基對多種真菌（黑曲霉、青霉、白色念珠菌、白假絲酵母）、細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、奇異桿菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌）和病毒（甲型H3N2流感病毒、呼吸道合胞病毒）有抑制作用。本次試驗艾熏的良好效果可能也是其揮發(fā)油組分和燃煙自由基的作用產(chǎn)生的，但具體機制仍有待明確。

此次試驗的結(jié)果表明，艾熏對豬舍環(huán)境中豬肺炎支原體有較好的殺滅效果。艾條熏蒸在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)有很好的應(yīng)用價值?！?/p>