程大偉 綜述 鄭軍 審校

三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(宜昌市中心人民醫(yī)院)肝膽胰外科三峽大學(xué)肝膽胰外科研究所，湖北 宜昌 443003

原發(fā)性肝癌是目前我國(guó)第四位常見惡性腫瘤及第二位腫瘤致死病因，它主要包括肝內(nèi)膽管癌(ⅠCC)、肝細(xì)胞癌(HCC)和混合型(HCC-ⅠCC)三種常見的病理類型，以及兩類罕見的肝母細(xì)胞瘤和纖維狀肝細(xì)胞癌(FLC)[1-3]。目前作為肝癌篩查和診治的腫瘤標(biāo)志物有血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、異常凝血酶原(PⅠVKA-Ⅱ)[4-5]，且PⅠVKA-Ⅱ?qū)FP 陰性的肝癌具有重要的診斷價(jià)值，可與AFP 互補(bǔ)，進(jìn)而提高肝癌的早期診斷率[6]。雖然這些標(biāo)志物為眾多肝癌患者贏得了手術(shù)時(shí)機(jī)，但其依然有著較高的術(shù)后復(fù)發(fā)率。目前肝腫瘤的治療方案已由過(guò)去的手術(shù)和傳統(tǒng)化療藥物相結(jié)合的治療方法演變成現(xiàn)在的以手術(shù)為主的綜合治療策略，輔以肝癌轉(zhuǎn)化治療、新輔助治療、分子靶向藥物和傳統(tǒng)化療藥物相結(jié)合的綜合治療。于是肝癌的分子靶向治療已成為近年來(lái)臨床治療方案中的新突破口，而探尋一個(gè)精準(zhǔn)的分子靶點(diǎn)，是安全而有效治療肝臟惡性腫瘤的關(guān)鍵。相關(guān)研究表明人組織激肽釋放酶(human tissue kallikreins，KLKs)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為肝癌診斷、治療以及預(yù)后判斷的新型分子生物學(xué)靶點(diǎn)[7]。因此，本文就KLKs在肝癌中的表達(dá)調(diào)控、作用機(jī)理、化療敏感性及預(yù)后評(píng)估價(jià)值方面進(jìn)行綜述，以期為肝癌的分子靶向治療提供更精準(zhǔn)的治療決策。

1 KLKs家族基因介紹

20 世紀(jì)30 年代，由Kraut 等在胰腺組織中首次發(fā)現(xiàn)KLKs，KLKs 具有胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的特性，是人類基因組中最大的具有連續(xù)性的絲氨酸蛋白水解酶亞群。KLKs 由14 種激肽釋放酶相關(guān)肽酶(KLK2-KLK15)和人組織激肽釋放酶(KLK1)組成，其編碼基因存在于人類染色體的19q13.3-13.4 長(zhǎng)臂上，長(zhǎng)度為262 kbp，各成員之間的蛋白質(zhì)水平、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及基因序列極為保守，分別編碼出相對(duì)應(yīng)的KLK1-KLK15 蛋白[8]。目前有關(guān)研究顯示單個(gè)KLKs 基因的長(zhǎng)度為4～10 kbp，其不僅結(jié)構(gòu)排列緊密而且無(wú)假基因存在，KLK4與KLK5之間相鄰最遠(yuǎn)，距離為32.5 kbp，而KLK1 與KLK15 之間相鄰最近，二者僅間隔1.5 kbp[9]。著絲粒端與KLK1間有一個(gè)非KLKs基因—睪丸酸性磷酸酶(ACPT)，末尾基因KLK14 與末尾基因KLK14 端粒端之間也存在一個(gè)非KLKs 基因—唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素9 (Siglec9) (圖1)。KLKs基因編碼序列由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成，內(nèi)含子相位高度保守，總是遵循Ⅰ～Ⅱ～Ⅰ～0的模式；外顯子的長(zhǎng)度和數(shù)量基本相似，其長(zhǎng)度差異主要體現(xiàn)在內(nèi)含子上；編碼的絲氨酸蛋白酶均含保守的絲氨酸(Ser195)、天冬氨酸(Asp102)和三聯(lián)體催化殘基(組氨酸(His57)。此外，多數(shù)KLKs 基因會(huì)受到類固醇激素的調(diào)節(jié)，均有10～12 個(gè)半胱氨酸殘基，理論上可形成5～6個(gè)二硫鍵。

圖1 染色體19q13.4上人組織激肽釋放酶基因位點(diǎn)示意圖Figure 1 Schematic diagram of the human tissue kallikrein gene locus on chromosome 19q13.4

KLKs 有15 個(gè)成員(KLK1～KLK15)，廣泛表達(dá)于不同表達(dá)水平的各種組織中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、組織重塑等一系列生理過(guò)程，雖然KLKs在人體中廣泛表達(dá)，但由于其表達(dá)水平的顯著差異，使KLKs 在不同部位或組織中產(chǎn)生不同的生理作用[10]。Koumandou等[11]發(fā)現(xiàn)，KLKs在腫瘤微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用，與多類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且部分KLKs 已被當(dāng)作腫瘤標(biāo)志物，應(yīng)用于癌癥的早期診斷、治療方案的確立以及預(yù)后評(píng)估等臨床實(shí)踐中。臨床上將KLK3作為前列腺癌的標(biāo)志物，從而用于其篩查、診療及預(yù)后分析[12]；KLK5 與口腔鱗狀細(xì)胞癌的侵襲性相關(guān)[13]；KLK5的蛋白表達(dá)水平與人胃腺癌的侵襲深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，KLK5可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，則KLK5 表達(dá)較高的患者總生存期較差[14]；KLK6 是治療卵巢癌的潛在靶點(diǎn)，也是評(píng)估卵巢癌不良預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[15]；KLK7 在結(jié)腸癌等惡性腫瘤的異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在人體組織中的增殖與侵襲[16]；此外，KLK13 在乳腺腫瘤和卵巢腫瘤的預(yù)后評(píng)判中亦是關(guān)鍵的生物學(xué)標(biāo)志物，并且在預(yù)估胃癌細(xì)胞化療敏感性方面也具有潛在的臨床價(jià)值[17-18]。由此可見，KLKs與腫瘤的研究緊密相關(guān)。

2 KLKs對(duì)肝癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制

隨著學(xué)者對(duì)KLKs研究的不斷深入，KLKs基因在肝癌的發(fā)生與發(fā)展中的作用也日漸受到研究者們的重視。相關(guān)研究表明，KLKs 的異常表達(dá)基本存在于所有的激素依賴性腫瘤和實(shí)體瘤中，KLKs 表達(dá)失調(diào)并借助不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移[19-20]。如圖2 所示，KLKs可通過(guò)以下方式促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。

圖2 KLKs促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制Figure 2 Mechanism of KLKs promoting invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells

2.1 KLKs可通過(guò)蛋白酶激活受體通路介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的增殖 蛋白酶激活受體(protease-activated receptor，PAR)作為細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及傳遞信號(hào)，調(diào)控著多種腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[21]。Michel等[22]研究證實(shí)，KLKs可激活癌細(xì)胞中的PAR，通過(guò)PAR通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖作用。KLK6 可通過(guò)PAR2 依賴性表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的反式激活，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，KLK6 也可以介導(dǎo)PAR1 信號(hào)通路，使多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖能力增強(qiáng)[23]。

2.2 KLKs可通過(guò)介導(dǎo)生長(zhǎng)因子通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖 生長(zhǎng)因子(growth factor，GF)是一類由細(xì)胞分泌的信號(hào)分子，通過(guò)與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。KLKs 可通過(guò)調(diào)節(jié)GF的活性和生物利用度，進(jìn)而激活蛋白酶活化受體，從而調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的增殖[24]。有關(guān)研究報(bào)道，KLK12通過(guò)水解細(xì)胞間的GF信號(hào)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的活性，進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控[25]；Sano等[26]研究發(fā)現(xiàn)KLK11可水解大多數(shù)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，通過(guò)促進(jìn)活化的胰島素樣生長(zhǎng)因子的釋放來(lái)提高其生物利用度，進(jìn)而在肝癌的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。此外，KLKs還可通過(guò)間接激活GF相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)肝癌的惡性轉(zhuǎn)化。Mukai等[27]通過(guò)免疫組化法探究了肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)特異性受體酪氨酸激酶MET (mesenchymal epithelial transition factor，MET)和KLK4的表達(dá)及磷酸化情況，結(jié)果顯示KLK4可激活MET，間接將前體HGF分散因子轉(zhuǎn)化為磷酸化的形式，進(jìn)而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。

2.3 KLKs可通過(guò)調(diào)控雄激素受體促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖 在激素相關(guān)性腫瘤中，腫瘤細(xì)胞的增殖可受KLKs 活性調(diào)節(jié)的影響。Shang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，KLK2可通過(guò)雄激素受體(androgen receptor，AR)信號(hào)系統(tǒng)，與AR輔助調(diào)節(jié)因子ARA70相互結(jié)合從而誘導(dǎo)AR反式激活，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。與KLK2不同的是，KLK4 和KLK14 則是通過(guò)水解性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)來(lái)調(diào)控AR 的表達(dá)，KLK4 僅能水解部分游離的SHBG，而KLK14卻能使SHBG完全水解[29]。

2.4 KLKs 可通過(guò)水解細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞間連接蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移 有關(guān)體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明，KLKs 可介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，KLKs 可通過(guò)水解某些大分子物質(zhì)如細(xì)胞間連接蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)和細(xì)胞黏附分子等促使肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。Dong 等[30]的研究證實(shí)了KLKs 在肝癌細(xì)胞中的異常表達(dá)，可以降解絕大多數(shù)ECM 分子和黏附蛋白質(zhì)。也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，KLKs 促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制與其水解ECM 蛋白、重塑血管生成有關(guān)，KLK12 可通過(guò)促進(jìn)血小板衍生生長(zhǎng)因子B(platelet derived growth factor B，PDGF-B)的合成從而增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)的分泌，而這一過(guò)程恰與腫瘤血管生成中的內(nèi)皮分化和毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成密切相關(guān)[31]。ECM 的水解與重塑可使腫瘤細(xì)胞獲得局部擴(kuò)散和侵入血管的能力，更有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和黏附，例如在內(nèi)皮祖細(xì)胞中KLK1 的高表達(dá)使VEGF 分泌增加，并使血管內(nèi)皮細(xì)胞免受凋亡，KLKs基因通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和黏附進(jìn)而誘導(dǎo)新生血管形成[32]。Jiang 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在KLK5 高表達(dá)的癌細(xì)胞系SCC25 中，沉默KLK5 基因的表達(dá)后，橋粒黏蛋白1(desmoglein 1，Dsg1)的水解明顯受到抑制，同時(shí)細(xì)胞的聚集顯著增加，因此，KLKs可通過(guò)水解細(xì)胞間連接蛋白從而介導(dǎo)細(xì)胞間的聚集，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞遷移。而且，KLKs還可借助上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過(guò)程來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力[34-35]。在肝癌細(xì)胞中，EMT 是由ΔNp63β介導(dǎo)的，高表達(dá)的ΔNp63β蛋白可以使KLK6、PAR2的表達(dá)上調(diào)和PAR1的表達(dá)下調(diào)，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，并借助激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)促使腫瘤細(xì)胞的增殖；而當(dāng)ΔNp63β表達(dá)降低時(shí)，KLK6、PAR2的表達(dá)下調(diào)和PAR1表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)EMT 表型，通過(guò)降低侵襲前沿的ERK 信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[36]。

3 KLKs對(duì)肝癌化療敏感性的調(diào)控

眾多研究指出，化療藥物的臨床療效亦受KLKs異常表達(dá)的影響。KLKs的異常表達(dá)與腫瘤的放療效果也有一定的相關(guān)性，KLK5 對(duì)宮頸癌的放射抗性至關(guān)重要，KLK5 的過(guò)表達(dá)與放療后預(yù)后不良有關(guān)，下調(diào)KLK5 的表達(dá)會(huì)增加放射敏感性，從而為宮頸癌的放療提供新的靶點(diǎn)和標(biāo)志物[37]。在肝癌組織中，KLK10 的高表達(dá)與索拉非尼的化療抵抗顯著相關(guān)，KLK10 可作為索拉非尼治療反應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測(cè)標(biāo)志物[38-39]。Dong 等[40]研究表明，KLK4 高表達(dá)與侖伐替尼的耐藥存在著一定的相關(guān)性，在內(nèi)源性高表達(dá)KLK4 的OVCA432 細(xì)胞系和外源性過(guò)度表達(dá)KLK4的SKOV-3 細(xì)胞系中，KLK4 過(guò)表達(dá)導(dǎo)致多細(xì)胞團(tuán)簇(multicellular aggregates，MCAs)的形成，從而產(chǎn)生侖伐替尼化療抵抗；而抑制KLK4 的活性可不同程度地逆轉(zhuǎn)MCAs 的形成，從而增強(qiáng)化療敏感性。另有基于3D 球體的動(dòng)物模型研究報(bào)道，侖伐替尼和KLKs/MAPK 信號(hào)通路抑制的組合方法可能比單獨(dú)使用侖伐替尼化療對(duì)晚期肝癌更有效，表明部分KLKs 基因可能與化療藥物耐藥性的形成過(guò)程相關(guān)[41]。目前，尚缺乏關(guān)于KLKs在調(diào)控肝癌細(xì)胞化療藥物敏感性的機(jī)制及過(guò)程中的相關(guān)研究，因此開展深入研究或?qū)⒂兄谪S富以KLKs為靶點(diǎn)治療肝癌的新思路。

4 KLKs在肝癌表達(dá)和預(yù)后評(píng)估中的研究進(jìn)展

近年來(lái)KLKs在肝癌中的表達(dá)和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值引起了國(guó)內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注。絕大多數(shù)KLKs蛋白可在正常人體的肝臟組織中表達(dá)，其中在肝臟提取物中可觀察到相對(duì)濃度較高的KLK7、KLK9 和KLK12，其余KLK的家族成員則可在較低濃度下觀察到；但在mRNA 水平上，除了可以觀察到較低表達(dá)水平 的KLK11、KLK12 和KLK14 之 外，其 余KLKs mRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在肝臟中幾乎檢測(cè)不到[42-43]?，F(xiàn)階段關(guān)于KLKs與肝癌的研究報(bào)道尚不多見。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)KLK1 在ⅠCC 中的表達(dá)比健康對(duì)照組低[44]。KLK6、KLK7、KLK12 mRNA 基因在正常肝臟標(biāo)本中幾乎檢測(cè)不到，其在肝臟的表達(dá)僅見于腫瘤肝轉(zhuǎn)移，而KLK5、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14 mRNA基因不管是在正常肝組織還是在病理性肝組織中的表達(dá)均較弱[45]。Lu 等[46]研究指出KLK10 的高甲基化與丙型病毒性肝炎及肝硬化的感染呈正相關(guān)，而與乙型病毒性肝炎感染呈負(fù)相關(guān)；另外，KLK10 基因的表達(dá)恢復(fù)對(duì)HCC細(xì)胞的基質(zhì)非依賴性生長(zhǎng)產(chǎn)生阻礙作用，且增強(qiáng)其對(duì)細(xì)胞毒性劑的敏感性，這說(shuō)明KLK10基因的失活在肝癌進(jìn)展中產(chǎn)生著重要影響。但另有研究表明，KLK10 mRNA 在HCC 中的表達(dá)水平與腫瘤的數(shù)目、大小、臨床分期等呈顯著負(fù)相關(guān)，而表達(dá)水平明顯降低，這說(shuō)明KLK10的低表達(dá)或表達(dá)缺失與肝腫瘤的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移緊密相連，可考慮作為評(píng)估肝癌預(yù)后的良好指標(biāo)[47-48]。同時(shí)，內(nèi)源性KLKs 結(jié)合蛋白Serpin A4 還可通過(guò)拮抗KLKs 活性來(lái)阻礙血管生成，從而抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[49]。吳錦良[50]研究發(fā)現(xiàn)，與KLK9蛋白質(zhì)在癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)水平相比，其在肝癌組織中的表達(dá)水平更高，而KLK9 mRNA 在肝癌細(xì)胞株的表達(dá)水平也顯著高于正常肝細(xì)胞，說(shuō)明KLK9 基因可能與正常肝組織的癌變過(guò)程密切相關(guān)；該研究還發(fā)現(xiàn)KLK9 蛋白質(zhì)的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤的大小、分化程度、TNM 分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著的正相關(guān)，說(shuō)明KLK9 基因可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，是肝癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，KLKs在肝癌中表達(dá)異常，其可以通過(guò)蛋白酶激活受體通路、生長(zhǎng)因子通路和雄激素受體等信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，以及通過(guò)水解細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞間連接蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)，并介導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，參與肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。KLKs 在肝癌中的表達(dá)異常與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，未來(lái)可能作為新型生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于肝癌的早期篩查、個(gè)性化診治以及預(yù)后評(píng)估中，也有學(xué)者提出將KLKs作為肝癌潛在的分子靶點(diǎn)以期豐富肝臟腫瘤的臨床治療策略進(jìn)而改善患者預(yù)后。因此，進(jìn)一步探索相關(guān)KLKs基因在肝癌組織中的信號(hào)傳導(dǎo)通路、表達(dá)調(diào)控情況及蛋白的相互作用機(jī)理，結(jié)合大量的體內(nèi)外臨床研究，提出有針對(duì)性的干預(yù)策略，可為肝癌的分子靶向治療提供更加精準(zhǔn)的治療決策。