郭小丹 唐珊 余水靜

摘要：高效解磷菌的分離，可促進(jìn)實(shí)用型生物肥料的開(kāi)發(fā)，是實(shí)現(xiàn)對(duì)作物的可持續(xù)性供磷以維護(hù)環(huán)境健康與土壤生產(chǎn)力的有力保障。以江西省贛州市某果園臍橙根際土壤作為試驗(yàn)材料，用平板篩選法篩選分離12株具有解磷能力的菌株，并結(jié)合鉬銻抗比色法評(píng)估分離菌株的解磷能力，最終篩選出3株解磷菌（菌株編號(hào)為QCGJ-B01、QCGJ-B02、QCGJ-B04），這些菌株表現(xiàn)出高溶磷指數(shù)（范圍為1.71～2.50）、強(qiáng)解磷能力（范圍為280.75～317.48mg/L）、低pH值（范圍為4.08～4.77）。結(jié)果顯示，pH值與解磷量呈負(fù)相關(guān)，表明酸化是3株解磷菌解磷的主要機(jī)制。對(duì)解磷能力最強(qiáng)的QCGJ-B01進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，并基于管家基因鑒定得出，QCGJ-B01是新洋蔥伯克霍爾德菌。全基因組數(shù)據(jù)顯示，QCGJ-B01的基因組大小為8127322bp，G+C含量為66.98%，預(yù)測(cè)到7425個(gè)基因，所有預(yù)測(cè)和注釋的基因序列都分配到KEGG通路中，檢測(cè)了有機(jī)酸合成與磷酸鹽代謝相關(guān)基因。本研究發(fā)現(xiàn)，QCGJ-B01具有無(wú)機(jī)磷增溶基因（gdh、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、gltA）和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因（pstS、pstC、pstA、pstB、phoR-phoB、phoU）。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01缺乏礦化磷酸酯的基因和編碼磷酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，可能使其無(wú)法利用額外的有機(jī)磷源，不利于其在不存在有效磷的環(huán)境中生存。QCGJ-B01高效的解磷能力有益于將其用作生物肥料，并且其全基因組數(shù)據(jù)有助于更好地理解其解磷性狀的遺傳基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：臍橙；根際解磷菌；篩選分離；解磷能力；全基因組測(cè)序

中圖分類號(hào)：S154.3；S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）10-0039-09

磷（P）是植株生長(zhǎng)發(fā)育必需的養(yǎng)分之一，在植株的干質(zhì)量中占比約0.2%［1］。磷素不僅參與生物大分子的合成（核酸、ATP、酶、磷脂），也對(duì)植物的各種生命活動(dòng)（呼吸作用、光合作用和信號(hào)傳導(dǎo)）起著積極作用［2-4］。土壤中的總磷含量約占0.05%，可供植物吸收的有效磷含量則只占總磷含量的01%［5］，這與磷元素易被固定并且移動(dòng)性極差有關(guān)［6-7］。土壤中磷素儲(chǔ)備的匱乏通常通過(guò)施加大量磷肥來(lái)彌補(bǔ)，可以保證作物吸收到充足的磷，以營(yíng)求更高的產(chǎn)量，但是實(shí)際上作物對(duì)磷肥的利用率僅有5%～25%［8-9］，這是由于磷肥中的可溶性磷易與土壤中的陽(yáng)離子（Ca2+、Fe3+、Al3+或Zn2+）結(jié)合而沉淀，與土壤固相表面（碳酸鈣、氧化鋁、氧化鐵和硅酸鋁）相互作用而被吸附，且易被其他土壤生物吸收轉(zhuǎn)化成有機(jī)磷而固定［10-11］，使得磷肥中70%～90%的可溶性磷都無(wú)法被植株吸收利用［12］。磷肥的大量施用也將導(dǎo)致環(huán)境污染問(wèn)題，如有毒元素（硒、砷）的積累、土壤養(yǎng)分失衡甚至進(jìn)入地下水體引起水體富營(yíng)養(yǎng)化［13-15］。為了避免使用磷肥帶來(lái)的負(fù)面影響，尋求一種環(huán)境友好、資源節(jié)約且可持續(xù)為作物供磷的方法意義重大。

解磷菌（phosphatesolubilizingbacteria，PSB）可通過(guò)酸解、酶解、呼吸作用和NH+4同化作用等方式將土壤中的難溶性磷轉(zhuǎn)化成有效磷，并且能防止釋放出的有效磷再次轉(zhuǎn)化成難溶性磷［16-18］。因此，將PSB作為化學(xué)磷肥的替代品，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中有廣闊的應(yīng)用前景。PSB可以分泌低相對(duì)分子量的有機(jī)酸（檸檬酸、蘋果酸、丁二酸、草酸、葡萄糖酸等），而有機(jī)酸在環(huán)境基質(zhì)中自由擴(kuò)散，通過(guò)降低pH值和絡(luò)合金屬陽(yáng)離子，能夠把土壤中的不溶性無(wú)機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化成植物可利用的游離態(tài)磷酸鹽離子［19］。篩選出高效PSB并將其作為生物肥料回接入土壤中是促進(jìn)作物生長(zhǎng)和提高作物產(chǎn)量的有效方法［20］。在過(guò)去幾十年里，研究者從土壤和植物根際分離了大量PSB，如假單胞菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬、固氮菌屬、根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、不動(dòng)桿菌屬、黃桿菌屬、克雷伯氏菌屬和微球菌屬等菌株都是土壤中常見(jiàn)的高效PSB［8，21-22］。

基因的研究不僅能在更深層次理解生物個(gè)體的特殊性，也有助于揭示生物特殊功能的作用機(jī)制［23］。通過(guò)對(duì)菌株的全基因組測(cè)序可以獲得菌株的基因組序列，以此來(lái)注釋其重要的基因和蛋白，進(jìn)一步了解其功能、作用及調(diào)控機(jī)制。全基因組測(cè)序是目前研究微生物進(jìn)化和遺傳等機(jī)制及主要功能基因的關(guān)鍵工具［24］。眾多微生物都有解磷特性，但目前并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異的解磷基因。關(guān)于提升PSB解磷能力的研究大多集中于篩選條件的選擇和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。本研究基于篩選的高效解磷菌株的全基因組序列，對(duì)菌株的磷代謝途徑和溶磷有關(guān)基因進(jìn)行分析，明確其功能和作用及調(diào)控機(jī)制，以期為探究其解磷性狀和遺傳背景提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1土樣采集

土壤樣品于2021年10月采自江西省贛州市某臍橙果園（地理位置：26°12′30″N，115°11′11″E），將果園劃分成6個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域選取5棵優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)且對(duì)應(yīng)樹(shù)齡在10年以上的臍橙樹(shù)進(jìn)行取樣。在選定的臍橙樹(shù)滴水線區(qū)域向下挖20～30cm深度采集根際土壤，將采集的土壤樣品收納在滅菌塑料袋中，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2解磷菌的篩選

平板初篩：稱取5g過(guò)30目篩的土樣，加入95mL無(wú)菌水中，搖床振蕩30min（30℃，180r/min）制備母液。采用梯度稀釋法稀釋母液，取連續(xù)稀釋所得土壤懸浮液（稀釋倍數(shù)為103、104、105）100μL涂布到以磷酸三鈣（TCP）為唯一磷源的無(wú)機(jī)磷（IP）瓊脂培養(yǎng)基［含有10.00g/L葡萄糖、0.50g/L（NH4）2SO4、0.30g/LMgSO4·7H2O、0.30g/LNaCl、0.30g/LKCl、0.03g/LFeSO4·7H2O、0.03g/LMnSO4·H2O、5.00g/LCa3（PO4）2、5.00g/L瓊脂，pH值為7.0～7.5］上［25］。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，于（30±1）℃培養(yǎng)7d。出現(xiàn)清晰透明圈的菌落即認(rèn)為是具有溶解難溶性磷酸鹽能力的菌株［26-27］。將選中的菌株單獨(dú)以劃線法在IP瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)2～3代，純化后的菌落接種在IP斜面培養(yǎng)基上，于4℃保存以備進(jìn)一步的研究使用。

1.3菌株的溶磷能力分析

1.3.1菌株解磷能力的定性分析將分離所得菌株點(diǎn)接于IP瓊脂培養(yǎng)基上，在（30±1）℃培養(yǎng)7d，每個(gè)菌株設(shè)3次重復(fù)。隨著菌落的生長(zhǎng)，其周圍逐漸出現(xiàn)的透明區(qū)域代表TCP發(fā)生溶解。溶磷指數(shù)（SI）=透明圈直徑（D）/菌落直徑（d），用SI初步評(píng)估不同菌株的解磷能力［28］。

1.3.2菌株解磷能力的定量分析用LB液體培養(yǎng)基活化解磷菌株來(lái)制備菌懸液（D600nm=0.7），按照2%的接種量接入裝有IP液體培養(yǎng)基（不加瓊脂）的錐形瓶中。搖床培養(yǎng)［（30±1）℃，180r/min］7d后取樣，在6000r/min離心20min，取上清液，用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中的有效磷濃度［29］。每個(gè)處理重復(fù)3次，并以接種等量無(wú)菌水的IP液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照（CK）。

1.4菌株7d動(dòng)態(tài)溶磷量和pH值的測(cè)定

有效磷濃度的測(cè)定方法同“1.3.2”節(jié)，pH值用pH計(jì)測(cè)定，每24h測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定7d。

1.5全基因組的測(cè)序和注釋

基于denovo測(cè)序技術(shù)對(duì)QCGJ-B01基因組進(jìn)行測(cè)序，利用生物信息學(xué)手段從頭組裝得到基因組序列。采用二代+三代即IlluminaHiseq+PacBio的測(cè)序方式，要求每個(gè)樣品同時(shí)提供不低于基因組100倍的PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)和100×Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)，保證更完整更精確的組裝，得到細(xì)菌基因組完成圖。用FastQC、Trimmomatic（Version0.36）等軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，用SOAPdenovo（Version2.04）完成基因組的組裝，用Glimmer（Version3.02）、barrnap（Version0.9）、tRNAscan-SE（Version2.0）等軟件對(duì)基因組進(jìn)行預(yù)測(cè)，用CGView（Version2）軟件構(gòu)建圈圖，對(duì)解磷菌株QCGJ-B01的基因組進(jìn)行展示。對(duì)預(yù)測(cè)和注釋的基因序列進(jìn)行分析，并根據(jù)與KEGG途徑的比較，通過(guò)人工檢查分配的基因功能，以確定有機(jī)酸合成和磷代謝途徑的存在。全基因組測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

基于菌株的31個(gè)管家基因（house-keepinggenes：dnaG、frr、infC、nusA、pgk、pyrG、rplA、rplB、rplC、rplD、rplE、rplF、rplK、rplL、rplM、rplN、rplP、rplS、rplT、rpmA、rpoB、rpsB、rpsC、rpsE、rpsI、rpsJ、rpsK、rpsM、rpsS、smpB、tsf）序列，基于Blast+軟件在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，選擇在種屬水平上最接近的19株菌株，通過(guò)MEGA6.0軟件選擇鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理均設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1解磷菌的分離和篩選

將來(lái)自臍橙根際的菌株接種到IP瓊脂培養(yǎng)基上，菌株是否能生長(zhǎng)與其能否利用TCP形式的無(wú)機(jī)磷有關(guān)。從平板上生長(zhǎng)的66個(gè)菌落中挑取12個(gè)菌落結(jié)構(gòu)獨(dú)特的菌株，發(fā)現(xiàn)其周圍均產(chǎn)生了清晰的透明圈，這是由于菌落周圍區(qū)域的劇烈酸化導(dǎo)致TCP溶解。選擇其中4個(gè)菌落及其透明圈展示在圖1中。

由表1可以看出，12株P(guān)SB在菌落的形態(tài)特征上均有差異，根據(jù)菌落形態(tài)特征不同，認(rèn)為這12株菌株屬于不同菌種。這些分離株在IP瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7d后，形成了大小明顯不同的透明圈和菌落。由表2可以看出，各菌株表現(xiàn)出不同的解磷能力，各菌株的溶磷指數(shù)（SI）范圍為1.048～2.500，其中QCGJ-B01的SI最大（2.500），其次是QCGJ-B04（2.043）和QCGJ-B02（1.706）。QCGJ-B04的透明圈直徑（2.35cm）和菌落直徑（1.15cm）都最大。

7d解磷量是評(píng)價(jià)菌株溶磷能力的又一個(gè)重要指標(biāo)。用IP液體培養(yǎng)基對(duì)12株解磷菌的進(jìn)一步篩選試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，12株P(guān)SB的解磷量為6411～303.14mg/L，菌株QCGJ-B01具有最高的TCP溶解能力（解磷量為303.14mg/L），其次是QCGJ-B02（解磷量為280.84mg/L）。2個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均顯示，解磷菌株QCGJ-B01的解磷能力最強(qiáng)，其次是QCGJ-B02，而QCGJ-B04產(chǎn)生了直徑最大的透明圈和菌落，但其7d解磷量卻最低（64.11mg/L）。因此，將QCGJ-B01與QCGJ-B02、QCGJ-B04共3株P(guān)SB共同加入下部分試驗(yàn)中。

2.23株P(guān)SB7d的動(dòng)態(tài)解磷量和pH值

對(duì)菌株7d的動(dòng)態(tài)解磷量和pH值的測(cè)定有助于進(jìn)一步了解菌株的解磷能力和明確有效磷濃度與pH值之間的相關(guān)性，從而初步判斷酸化是否是菌株解磷的主要策略。在7d培養(yǎng)過(guò)程中，3株P(guān)SB培養(yǎng)基中的有效磷濃度和pH值的變化見(jiàn)圖3?？梢钥闯?，隨著菌株解磷量的上升，pH值也隨之下降。菌株QCGJ-B01在培養(yǎng)48h達(dá)到最大解磷量（317.48mg/L）和最低pH值（4.08）。菌株QCGJ-B02在培養(yǎng)96h達(dá)到最大解磷量（283.50mg/L）和最低pH值（4.77）。菌株QCGJ-B04在培養(yǎng)24h達(dá)到最大解磷量（280.75mg/L）和最低pH值（443）。表明菌株通過(guò)分泌有機(jī)酸降低培養(yǎng)基pH值，釋放了大量有效磷。3株菌株在培養(yǎng)前24h解磷量的增速最快，培養(yǎng)24h后QCGJ-B01、QCGJ-B02菌株解磷量的增速放緩，達(dá)到最大值后有小幅度波動(dòng)。與以上2株菌株不同的是，QCGJ-B04的解磷量在培養(yǎng)24h時(shí)達(dá)到最大值后便急劇下降，甚至比空白對(duì)照（CK）的解磷量（22.4mg/L）更低。QCGJ-B04的pH值也在培養(yǎng)24h后急劇上升，最高達(dá)8.25，高于空白對(duì)照的pH值（7.10）。在空白處理中檢測(cè)到很少的可溶性磷，pH值也十分穩(wěn)定，與初始pH值（7.08）相差不大。由圖4可知，解磷量與pH值間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r2=0.9433）。

2.3全基因組序列分析

2.3.1基因組特征與種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育分析測(cè)序結(jié)果顯示，菌株QCGJ-B01的基因組大小為8127322bp，G+C含量為67.58%，基因組特征的細(xì)節(jié)展示在圖5中。預(yù)測(cè)的QCGJ-B01基因總數(shù)為7425個(gè)，包括66個(gè)tRNA和4個(gè)rRNA編碼基

因。16SrRNA基因序列在同一細(xì)菌物種中高度保守，因此它們經(jīng)常用于識(shí)別和分類微生物。為了鑒定QCGJ-B01，使用BLASTn將16SrRNA基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，QCGJ-B01與洋蔥伯克霍爾德菌的相似性高達(dá)99.929%，QCGJ-B01與伯克霍爾德菌屬其他菌種的相似性匹配度也較高（99.788%～99.929%）。上述分析結(jié)果表明，菌株QCGJ-B01屬于洋蔥伯克霍爾德菌群，該菌群有不少于20種菌種，包括Burkholderiaanthina、新洋蔥伯克霍爾德氏菌（B.cenocepacia）、洋蔥伯克霍爾德氏菌（B.cepacia）、污染伯克霍爾德氏菌（B.contaminans）、B.lata、吡咯伯克霍爾德菌（B.pyrrocinia）和穩(wěn)定伯克霍爾德菌（B.stabilis）等。16SrRNA基因無(wú)法清楚地區(qū)分洋蔥伯克霍爾德菌群中的菌種，而使用管家基因可以更好地輔助細(xì)菌物種的分類，并且已經(jīng)由許多研究證實(shí)［30］。因此，本研究基于管家基因創(chuàng)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)通過(guò)鄰接法獲得相關(guān)分類群的代表性菌株。由圖6可以看出，QCGJ-B01和新洋蔥伯克霍爾德菌（B.cenocepacia）的親緣關(guān)系最接近，序列相似性達(dá)99.2%。

2.3.2有機(jī)酸合成與磷代謝基因分析QCGJ-B01有許多與有機(jī)酸合成和磷酸鹽代謝有關(guān)的基因，賦予菌株相關(guān)性狀的基因見(jiàn)表3。葡萄糖酸（GA）被認(rèn)為是大多數(shù)細(xì)菌中負(fù)責(zé)溶解無(wú)機(jī)磷酸鹽的主要有機(jī)酸之一［31］。GA可由醌蛋白葡萄糖脫氫酶（GDH）及其輔因子吡咯喹啉醌合成蛋白（PQQ）共同作用而合成。QCGJ-B01是一株高效解磷菌株，基因組分析結(jié)果表明，QCGJ-B01具有編碼GDH的基因，并攜帶氧化還原輔因子pqq基因，包括pqqB、pqqC、pqqD、pqqE基因，缺乏pqqA基因。

pqqA是一種由24個(gè)氨基酸組成的短肽，是轉(zhuǎn)化為PQQ的前體［32］。但Toyama等的研究發(fā)現(xiàn)，在甲基桿菌PQQ的生物合成過(guò)程中，由pqqA編碼的酶是非必需的［33］。此外研究者還發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01具有檸檬酸合成酶基因（gltA）。許多研究結(jié)果表明，磷酸酯的礦化是土壤有效磷的又一個(gè)主要來(lái)源，它是一種有機(jī)磷化合物，包含1個(gè)碳—磷（C—P）鍵，而不是眾所周知的磷酸酯鍵（C—O—P）［34］。phn基因簇指導(dǎo)合成的碳—磷鍵裂解酶可使菌株將磷酸酯水解成磷酸鹽和烷烴。QCGJ-B01具有phnA、phnB、phnW基因，其中phnA是膦酰乙酸降解所必需的，但是它缺失了大部分合成碳—磷鍵裂解酶復(fù)合物所需的基因，包括phnE～phnO，表明QCGJ-B01可能缺乏礦化磷酸酯的能力。

細(xì)菌對(duì)一般是通過(guò)質(zhì)膜上特定的磷化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成對(duì)磷的吸收，包含通過(guò)pstS、pstC、pstA、pstB編碼基因合成的無(wú)機(jī)磷酸鹽特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通過(guò)phnE、phnD、phnC編碼基因合成的磷酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。QCGJ-B01具有pstS、pstC、pstA、pstB基因但未攜帶phnE、phnD、phnC基因，pstS、pstC、pstA、pstB編碼基因的激活受到磷缺乏響應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)的控制。QCGJ-B01的磷缺乏響應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)由雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)phoR（磷酸鹽調(diào)節(jié)感應(yīng)激酶）-phoB（磷酸鹽調(diào)節(jié)反應(yīng)調(diào)控子）控制［35］。phoR通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子phoB來(lái)響應(yīng)磷酸鹽的缺乏，然后phoB與稱為phoBOX的DNA序列結(jié)合，以激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。除此之外，還發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01具有phoU基因，phoU是一種金屬結(jié)合蛋白，是在磷充足時(shí)進(jìn)行phoB的去磷酸化所必需的，以避免不受控制的磷酸鹽攝?。?5］。

3討論

本研究以臍橙根際土壤為材料分離解磷菌，這是因?yàn)榕c非根際土壤相比，根際土壤中的PSB種群數(shù)量要高得多［36］。本研究分離出了12株菌落周圍能產(chǎn)生透明圈的菌株。根據(jù)溶磷指數(shù)（SI＞1.5）和解磷能力（7d溶磷量＞250mg/L）指標(biāo)，篩選出了3株最佳菌株（QCGJ-B01、QCGJ-B02、QCGJ-B04），其中菌株QCGJ-B01的溶磷指數(shù)最大（SI=2.500）且解磷量最高（317.48mg/L）。進(jìn)一步對(duì)3株菌株在7d中的動(dòng)態(tài)解磷量和pH值變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01、QCGJ-B02的pH值分別在48、96h降到最小值，解磷量達(dá)到最大值，隨后在一個(gè)范圍內(nèi)波動(dòng)，總體呈下降的趨勢(shì)。這是由于菌株在適宜的pH值范圍內(nèi)才會(huì)展現(xiàn)出最佳的解磷活性，而偏酸性的環(huán)境不適合菌株的生長(zhǎng)，所以當(dāng)pH值下降到一定程度時(shí)，解磷過(guò)程將會(huì)受到限制，這與Qian等的試驗(yàn)結(jié)果［37］一致。QCGJ-B04與QCGJ-B01、QCGJ-B02的表現(xiàn)不同，在24h達(dá)到最大解磷量和最小pH值后，解磷量急劇下降，pH值急劇上升，隨后一直處于低溶磷量、高pH值的狀態(tài)。Pérez等也發(fā)現(xiàn)了類似的情況，這是因?yàn)榫晟L(zhǎng)迅速，在培養(yǎng)基中達(dá)到了高細(xì)胞密度，因此需要消耗大量磷來(lái)維持菌株的生長(zhǎng)［38］。而且QCGJ-B04在IP瓊脂培養(yǎng)基上表現(xiàn)出了比其他菌株更大的菌落。上述結(jié)果都證明QCGJ-B04生長(zhǎng)迅速，消耗了大量有效磷。菌株在細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中，pH值的下降伴隨著培養(yǎng)基中可溶性磷含量的上升，pH值的（4.08）最低值與最高的溶磷量（317.48mg/L）同時(shí)出現(xiàn)?？扇苄粤缀颗cpH值呈負(fù)相關(guān)（r2=0.9433）。這與Chen等的研究結(jié)果［39-40］一致。pH值的下降可能是由于有機(jī)酸的產(chǎn)生，表明酸化是該菌株溶解難溶性磷酸鹽的主要策略［41-42］。

有研究發(fā)現(xiàn)，土壤中的PSB數(shù)量十分可觀，無(wú)論是好氧菌株還是厭氧菌株均有被發(fā)現(xiàn)，如假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、根瘤菌屬、伯克霍爾德菌屬、無(wú)色桿菌屬、農(nóng)桿菌屬、微球菌屬等，并且新的PSB菌株也在不斷涌現(xiàn)。本研究對(duì)解磷能力最強(qiáng)的菌株QCGJ-B01進(jìn)行了全基因組測(cè)序，通過(guò)菌種鑒定，確定QCGJ-B01為新洋蔥伯克霍爾德菌株（B.cenocepacia）。B.cenocepacia是一種高GC含量的革蘭氏陰性菌，因其具有多條染色體、基因組島和大量插入序列，使其基因組具有高可塑性［43-44］。伯克霍爾德氏菌屬在許多研究中被發(fā)現(xiàn)具有溶解難溶性磷酸鹽的能力，但良好的磷酸鹽溶解能力不是新洋蔥伯克霍爾德菌的普遍性狀［45-50］。葡萄糖酸是革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)最多的關(guān)于溶解難溶性磷酸鹽的基因，研究發(fā)現(xiàn)B.cenocepaciaQCGJ-B01具有編碼gdh的基因，并攜帶氧化還原輔因子pqq基因［51-52］。You等分離出的B.cenocepaciaCR318中的醌蛋白葡萄糖脫氫酶編碼基因缺失并表現(xiàn)出更低的溶磷指數(shù)（SI=2.00）［50］，表明負(fù)責(zé)葡萄糖酸合成的基因可能是提升新洋蔥伯克霍爾德菌解磷能力的關(guān)鍵因素之一。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01具有檸檬酸合成酶基因（gltA），增強(qiáng)了菌株分泌有機(jī)酸的能力，從而增加了難溶性磷酸鹽的可用性。QCGJ-B01還攜帶pstS、pstC、pstA、pstB、phoR-phoB、phoU基因，QCGJ-B01通過(guò)基因組pstS、pstC、pstA、pstB負(fù)責(zé)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)部分吸收無(wú)機(jī)磷酸鹽。B.cenocepaciaQCGJ-B01缺乏礦化磷酸酯的基因（phnE～phnO）和編碼磷酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因（phnE、phnD、phnC），可能使其無(wú)法利用額外的有機(jī)磷源，不利于其在不存在有效磷的環(huán)境中生存。目前，關(guān)于具有溶解磷酸鹽能力的新洋蔥伯克霍爾德菌的全基因組測(cè)序鮮有報(bào)道，本研究數(shù)據(jù)可能有助于更好地理解這一性狀的遺傳基礎(chǔ)。

4結(jié)論

經(jīng)過(guò)篩選分離，本研究得到3株解磷能力尤其突出的菌株QCGJ-B01、QCGJ-B02、QCGJ-B04，它們?cè)卺尫糯罅坑行Я椎耐瑫r(shí)也降低了溶液pH值，初步確定酸化是其主要溶磷機(jī)制。此外，本研究得到了QCGJ-B01全基因組序列，其基因組大小為8127322bp，G+C含量為67.58%，預(yù)測(cè)到7425個(gè)基因，包括66個(gè)tRNA和4個(gè)rRNA編碼基因。基于管家基因鑒定QCGJ-B01為新洋蔥伯克霍爾德菌。并且在全基因組水平揭示了B.cenocepaciaQCGJ-B01具有無(wú)機(jī)磷增溶基因（gdh、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、gltA）和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因（pstS、pstC、pstA、pstB、phoR-phoB、phoU）。此外，發(fā)現(xiàn)QCGJ-B01缺乏礦化磷酸酯的基因和編碼磷酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，可能使其無(wú)法利用額外的有機(jī)磷源，不利于其在不存在有效磷的環(huán)境中生存。研究呈現(xiàn)了QCGJ-B01全基因組數(shù)據(jù)，特別是關(guān)于菌株的解磷基因，這將有助于進(jìn)一步了解QCGJ-B01和其他類似生物關(guān)于解磷與磷代謝的復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制，并可能進(jìn)一步深入了解該菌株作為生物肥料在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。

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