方光遠 談福利 張智敏 單星月 袁光蘇 王喜國 陳俊紅 胡志華 蔣加進 戴鼎震

摘要：為研究20日齡左右仔豬腹瀉發(fā)病機理，檢測仔豬腹瀉大腸桿菌耐藥性和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）基因種類，分析仔豬腹瀉大腸桿菌耐藥特性，為獸醫(yī)臨床更好地預防控制仔豬腹瀉大腸桿菌病提供參考，從腹瀉發(fā)病仔豬糞便中分離出34株致病性仔豬腹瀉大腸桿菌，用10種頭孢類抗生素藥敏紙片對其進行藥物敏感試驗，并設計針對ESBLs基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9的特異性引物，檢測34株仔豬腹瀉大腸桿菌ESBLs基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9存在情況。藥敏試驗結果表明，34株仔豬腹瀉大腸桿菌對10種頭孢類抗生素的敏感度不同，其中，對頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢呋辛的耐藥率為68%、65%和56%，敏感率為29%、15%和35%；對頭孢哌酮、氨曲南的耐藥率為15%、9%，敏感率為70%、79%。ESBLs基因檢測結果表明，34株仔豬腹瀉大腸桿菌全部檢測到TEM耐藥基因，檢出率為100%；檢測到1株細菌具有CTX-M-9耐藥基因，檢出率為2.8%。由于該養(yǎng)豬場分離出的仔豬腹瀉大腸桿菌對頭孢類抗生素普遍耐藥，并且全部檢測出ESBLs的TEM基因，因此建議對養(yǎng)豬場的頭孢類抗生素使用應定期進行耐藥性檢測和合理規(guī)范使用。

關鍵詞：仔豬腹瀉大腸桿菌；耐藥性；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因；檢測與分析

中圖分類號：S852.6文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）10-0053-04

大腸桿菌對頭孢菌素產(chǎn)生耐藥性的主要機理是產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases，ESBLs）。ESBLs是通過質粒介導使細菌對第3、4代頭孢菌素（主要包含頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶和頭孢吡肟等）及單環(huán)類內(nèi)酰胺抗生素氨曲南和青霉素類抗生素產(chǎn)生耐藥的一組酶［1-2］。自從19世紀80年代歐洲國家發(fā)現(xiàn)并報道了第1例產(chǎn)ESBLs菌株后，目前已發(fā)現(xiàn)由質粒介導的ESBLs基因亞型200多種，其中，TEM（Temoniera）、SHV（Sulphadrylvariable）和CTX-M（Cefotaxime）基因型非常普遍［2-3］。根據(jù)基因同源性的差異把ESBLs分成三大類：TEM型、SHV型、非TEM非SHV型，其中，TEM型和SHV型占大多數(shù)。最近，伴隨CTX-M型不斷增加，且本來屬于2d亞類β-內(nèi)酰胺酶OXA型中又出現(xiàn)了多種ESBLs，所以又把ESBLs分類為TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型、其他5種類型［4-5］。ESBLs最常見的基因型是TEM，至今已有168種，全球廣泛分布。目前，我國濫用抗生素現(xiàn)象非常普遍，對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的研究較晚，抗生素產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象比較普遍。本試驗通過檢測仔豬腹瀉大腸桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型種類，分析仔豬腹瀉大腸桿菌的耐藥機理，為獸醫(yī)臨床提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗時間：2021年12月10日至2022年4月10日；地點：金陵科技學院動物科學與食品工程學院獸醫(yī)微生物實驗室。

1.1.1病料南京某養(yǎng)豬場34份仔豬腹瀉糞便［3］。

1.1.2菌株34份腹瀉仔豬糞便進行細菌分離培養(yǎng)獲得34株細菌，經(jīng)鑒定均為仔豬腹瀉大腸桿菌［3］，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3試劑瓊脂糖、2×TaqPCRmix、DL2000DNAMarker等購自南京擎科生物有限公司；普通營養(yǎng)瓊脂平板、SS瓊脂平板、普通營養(yǎng)肉湯等自行配制。

1.2方法

1.2.1細菌復蘇純化培養(yǎng)取保存的34株仔豬腹瀉大腸桿菌凍干菌種，接種普通營養(yǎng)瓊脂平板、SS瓊脂平板和普通營養(yǎng)肉湯，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2細菌藥敏試驗購自杭州濱河微生物試劑有限公司10種頭孢類抗生素藥敏紙片為頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢西丁和氨曲南。藥敏試驗采用常規(guī)紙片法進行。菌液制備：挑選普通營養(yǎng)瓊脂平板上分離培養(yǎng)好的大腸桿菌菌落置于滅菌的0.9%氯化鈉溶液中，制成均勻懸液，使其濁度與0.5麥氏單位比濁管濁度一致。用滅菌棉簽蘸取制備好的菌液，均勻涂布整個平板表面。用滅菌鑷子夾取藥敏紙片1張，貼在平板表面，1塊平板上貼4種不同的藥敏紙片，各藥敏紙片間間隔≥30mm，且紙片距平板邊緣≥15mm。操作完成的平板放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃24h后，仔細觀察，并測量各藥敏紙片抑菌圈直徑。結果判定參考《抗微生物藥物敏感試驗執(zhí)行標準（CLSI-M100-S20）》。

1.2.3細菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因檢測

1.2.3.1細菌ESBLs耐藥基因PCR擴增引物根據(jù)已發(fā)表文獻的ESBLsTEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9基因序列，設計合成TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9上下游引物（表1）。

1.2.3.2細菌DNA模板制備及ESBLs耐藥基因PCR檢測取各仔豬腹瀉大腸桿菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1mL，4℃10000r/min離心3min，去除上清，加生理鹽水1mL搖勻；再同上離心洗滌1次，棄上清液，取1mL生理鹽水加入管中搖勻，作為細菌DNA模板。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；然后72℃延伸10min［3-6］。PCR基因片段檢測：用1倍TBE緩沖液配備1.2%瓊脂凝膠100mL，加入5μLGoldview倒板冷卻后，取各PCR產(chǎn)物10μL加樣后電泳。電泳儀設定電壓120V、電流130mA、時間45min，電泳后采用紫外檢測儀觀察結果。

2結果與分析

2.1細菌復蘇純化培養(yǎng)結果與分析

在普通營養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線接種34株仔豬腹瀉大腸桿菌菌種凍干粉，37℃培養(yǎng)24h后，菌落均生長良好，呈圓形、濕潤、無色半透明狀菌落［4-6］（圖1）。SS瓊脂平板上生長出圓形、光滑的紅色菌落［4-6］（圖2）。營養(yǎng)肉湯中呈均勻、渾濁狀態(tài)，底部出現(xiàn)黏性沉淀物，液面管壁出現(xiàn)菌環(huán)。

2.2細菌藥敏試驗結果與分析

由表2結合《抗微生物藥物敏感試驗執(zhí)行標準（CLSI-M100-S20）》的判斷標準可知，34株仔豬腹瀉大腸桿菌對頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢西叮、氨曲南10種抗生素的敏感度不同，其中，對頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢呋辛的耐藥率比較高，分別為68%、65%和56%，敏感率比較低，分別為29%、15%和35%，這可能與臨床使用上述3種抗生素較多有關；對頭孢哌酮、氨曲南的耐藥率比較低，分別為15%和9%，敏感率比較高，分別為70%和79%，這可能與臨床使用上述2種抗生素較少有關。

2.3細菌耐藥基因檢測結果與分析

34株仔豬腹瀉大腸桿菌菌株超廣譜β-內(nèi)酰胺酶TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9基因片段PCR檢測結果表明，其中34株仔豬腹瀉大腸桿菌均被檢測到超廣譜β-內(nèi)酰胺酶TEM基因片段，7號菌株細菌被檢測到CTX-M-9基因片段，其他基因片段未被檢測到。

2.3.1TEM耐藥基因檢測結果與分析由圖3、圖4可知，34株仔豬腹瀉大腸桿菌均檢測到TEM耐藥基因，該耐藥基因檢出率為100%。

2.3.2CTX-M-9耐藥基因檢測結果與分析

由圖5、圖6可知，34株仔豬腹瀉大腸桿菌7號菌株被檢測到CTX-M-9耐藥基因，該耐藥基因檢出率為2.8%。

3討論

頭孢類抗生素是獸醫(yī)臨床抗細菌感染治療中最常應用的抗生素，隨著3代頭孢類抗生素的大量應用，細菌對頭孢類抗生素耐藥現(xiàn)象越來越嚴重，細菌對此類藥物耐藥的很大一部分因素是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶和ESBLs。TEM型耐藥基因是ESBLs中最常見的基因型，至今已有168種，呈全球性分布，也是我國最常見的ESBLs［7］。本試驗結果表明，34株仔豬腹瀉大腸桿菌全部檢測到TEM耐藥基因，陽性率為100%；檢測到1株CTX-M-9耐藥基因，檢測率為2.8%。Kawamura等報道，TEM可水解羧芐西林、苯唑西林或頭孢菌素；SHV具有水解頭孢噻肟巰基的功能；CTX-M對頭孢噻肟水解作用很大，對頭孢他啶水解作用很?。?］。根據(jù)本試驗藥敏試驗和耐藥基因檢測結果可知，34株仔豬腹瀉大腸桿菌對10種抗生素耐藥性和敏感性情況差別較大，但檢測出CTX-M-9耐藥基因的7號菌株對頭孢噻肟的耐藥性明顯比其他未檢測出的菌株高。34株仔豬腹瀉大腸桿菌全部檢測到TEM耐藥基因，說明該豬場仔豬腹瀉致病性大腸桿菌對頭孢類抗生素均已經(jīng)產(chǎn)生耐藥，應重視。由于檢測的仔豬腹瀉大腸桿菌菌株數(shù)較少，檢測出的ESBLs基因類型也較少，仔豬腹瀉大腸桿菌具體的耐藥特性和ESBLs基因分布狀況有待更進一步探索。

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