汪 璐，楊純國(guó)，韓文凱，崔亞君*，高 峰，馬海光，隗立國(guó)

基于實(shí)時(shí)景深擴(kuò)展-大圖影像拼接與偏振光顯微鑒別技術(shù)的柴胡及其4種混淆品的生藥學(xué)研究

汪 璐1，楊純國(guó)2#，韓文凱1，崔亞君1*，高 峰3，馬海光3，隗立國(guó)4

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203 2. 山東一方制藥有限公司，山東 臨沂 276067 3. 河北百草康神藥業(yè)有限公司，河北 衡水 053800 4. 北京市房山區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，北京 102400

基于實(shí)時(shí)景深擴(kuò)展-大圖影像拼接與偏振光顯微鑒別技術(shù)，對(duì)柴胡2個(gè)基原品種柴胡或狹葉柴胡及4種市場(chǎng)常見(jiàn)混淆品（竹葉柴胡、藏柴胡var.、錐葉柴胡大葉柴胡）的性狀、微性狀及顯微鑒別特征進(jìn)行系統(tǒng)的對(duì)比研究，為柴胡的鑒別及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。性狀鑒別研究采用性狀及微性狀鑒別法，顯微鑒別研究采用普通光明場(chǎng)與偏振光暗場(chǎng)對(duì)比觀察法，結(jié)合實(shí)時(shí)景深擴(kuò)展成像、大圖影像拼接技術(shù)，拍攝獲取藥材組織橫切面全息彩色影像圖。獲取了柴胡及其混淆品的性狀及微性狀影像數(shù)據(jù)，首次獲取了該類藥材橫切面顯微鑒別普通光及偏振光全息彩色影像數(shù)據(jù)。對(duì)柴胡2個(gè)基原品種及其4種混淆品進(jìn)行了系統(tǒng)的生藥學(xué)研究。與《中國(guó)藥典》2020年版相比，性狀鑒別補(bǔ)充研究了精細(xì)微性狀鑒別特征，對(duì)柴胡藥材根或根莖的上、中、下部位橫切面進(jìn)行對(duì)比觀察，確定了柴胡藥材根或根莖上部橫切面組織構(gòu)造最具特征性，為最佳的橫切面顯微研究部位。可以綜合應(yīng)用性狀、微性狀、橫切面及粉末顯微鑒別特征鑒定柴胡及其4種混淆品，特別是藥材橫切面組織偏振光全息彩色影像顯微特征具有顯著鑒別意義。

柴胡；混淆品；北柴胡；南柴胡；竹葉柴胡；藏柴胡；錐葉柴胡；大葉柴胡；性狀鑒別；顯微鑒別；偏振光

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名茈胡，列為上品[1]，為傘形科植物柴胡DC. 或狹葉柴胡Willd.的干燥根，前者習(xí)稱“北柴胡”，又名硬柴胡、鐵腳柴胡、黑柴胡，后者習(xí)稱“南柴胡”，又名狹葉柴胡、紅柴胡、軟柴胡、香柴胡、軟苗柴胡[2-5]。柴胡藥材同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重，本研究為避免名稱混亂，皆使用“北柴胡”、“南柴胡”。柴胡具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣的作用，現(xiàn)代藥理研究表明柴胡具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒等作用[6-10]。

柴胡屬植物全球約120種，我國(guó)現(xiàn)有42個(gè)種、17變種及7個(gè)變型，其中作為民間用藥的約20種，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，北柴胡主產(chǎn)于河北、甘肅、陜西、山西、東北等地區(qū)，南柴胡主要種植區(qū)為陜西、河北、內(nèi)蒙古、東北等地，安徽、江蘇等地區(qū)亦有分布[11-12]。目前商品市場(chǎng)除藥典收載品種外，尚有多種混淆品流通或作為地方用藥。常見(jiàn)的混淆品有竹葉柴胡Wall. ex DC.，又名膜緣柴胡、竹葉防風(fēng)，在西南等地區(qū)廣泛種植，多全草入藥，其根制成飲片后，性狀與北柴胡相似，鑒別難度高，是最常見(jiàn)的混淆品[13]；大葉柴胡Turcz.又名長(zhǎng)白山野生柴胡，主產(chǎn)于東北地區(qū)，有毒，曾被摻入商品柴胡飲片中使用，引起藥物中毒事故[14-15]；錐葉柴胡Helm.又名海拉爾柴胡、黑柴胡；藏柴胡Wall. ex DC. var.(Wolff) Shan et Y.Li又名窄竹葉柴胡，成分與藥典品種差異較大[14, 16-17]。由此可見(jiàn)藥材市場(chǎng)上柴胡品種混亂現(xiàn)象嚴(yán)重。近20年來(lái)，對(duì)柴胡的研究主要集中在化學(xué)成分及含有柴胡組方的藥理作用等方面[18]，真?zhèn)舞b別研究文獻(xiàn)較少，研究方法及結(jié)果呈現(xiàn)大多停留在文字和墨線圖階段，而柴胡藥材橫切面多以墨線圖簡(jiǎn)圖的形式展示，即便最新研究資料也僅停留在低像素的顯微影像圖階段，缺少日新月異的現(xiàn)代數(shù)碼顯微鑒定新技術(shù)的研究，故亟需對(duì)柴胡及其混淆品鑒別進(jìn)行系統(tǒng)的現(xiàn)代生藥學(xué)研究。

本研究針對(duì)《中國(guó)藥典》2020年版柴胡項(xiàng)下收載的2個(gè)基原品種及市場(chǎng)常見(jiàn)的混淆品竹葉柴胡、藏柴胡、大葉柴胡及錐葉柴胡的性狀、微性狀及顯微鑒別進(jìn)行系統(tǒng)的生藥學(xué)研究，其中性狀鑒別研究采用性狀及微性狀鑒別法，顯微鑒別研究采用普通光明場(chǎng)與偏振光暗場(chǎng)對(duì)比觀察法，拍攝方法采用大圖影像拼接法結(jié)合實(shí)時(shí)景深擴(kuò)展成像技術(shù)，獲取藥材橫切面全息彩色影像圖[18-19]，總結(jié)主要鑒別特征，以期為柴胡的真?zhèn)舞b別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)藥材為野外采收、市場(chǎng)購(gòu)買及部分院?？蒲性核?zèng)送，由上海中醫(yī)藥大學(xué)崔亞君教授鑒定為北柴胡DC.、南柴胡Willd.、竹葉柴胡Wall. ex DC.、藏柴胡Wall. ex DC. var.(Wolff) Shan et Y.Li，錐葉柴胡Helm.、大葉柴胡Turcz.。樣品信息見(jiàn)表1。

本實(shí)驗(yàn)選擇具有代表性特征的藥材進(jìn)行性狀、顯微圖像拍攝作為影像研究數(shù)據(jù)，所選藥材批號(hào)為北柴胡（批號(hào)CH20191003）、南柴胡（批號(hào)XY20200626）、竹葉柴胡（批號(hào)MY20210720）、藏柴胡（批號(hào)Z20200910）、大葉柴胡（批號(hào)DY201906124）、錐葉柴胡（批號(hào)ZY20201008）。

1.2 試劑

蒸餾水、水合氯醛（分析純）、甘油（分析純）、冰醋酸（分析純）、乙醇（分析純）、氫氧化鉀、石蠟、番紅染色劑、固綠染色劑，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器

Leica DM6 B顯微鏡、Leica DMC6200數(shù)碼成像系統(tǒng)，德國(guó)徠卡公司；Nikon 80I顯微鏡、DS-Ri1數(shù)碼成像系統(tǒng)、尼康相機(jī)，日本Nikon公司；XTL-850高清體視顯微鏡、Image View成像系統(tǒng)，上海光密儀器有限公司；M50無(wú)反相機(jī)、EF 50 mmF/1.8 stm鏡頭，日本Canon公司；BJ-150多功能粉碎機(jī)，德清拜杰電器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀-微性狀鑒別研究

從完整藥材的形狀、大小、顏色、表面、質(zhì)地、折斷面、橫切面、縱切面、氣、味等方面進(jìn)行系統(tǒng)的性狀、微性狀特征觀察研究；利用數(shù)碼相機(jī)和體視顯微鏡，結(jié)合大圖影像拼接技術(shù)及實(shí)時(shí)景深擴(kuò)展成像技術(shù)采集影像數(shù)據(jù)。

2.1.1 北柴胡 呈長(zhǎng)圓錐形，根頭膨大，多殘留2～15個(gè)莖基，常有少數(shù)短纖維狀葉基，下部多分枝，長(zhǎng)多為5～15 cm，直徑多為0.3～1 cm。表面黑褐色至淡棕色，具縱皺紋及皮孔。質(zhì)硬而韌，不易折斷，折斷面不平坦，具長(zhǎng)條狀纖維，呈強(qiáng)纖維性。根中上部及中部橫切面多具3～8輪同心環(huán)，向下環(huán)紋漸少，至下部無(wú)明顯同心環(huán)；縱切面木質(zhì)部呈片狀纖維性。韌皮部淡棕色，木質(zhì)部黃白色。氣微香，味微苦。家種北柴胡根頭膨大不明顯，分支較少，表面顏色較淺，橫切面環(huán)紋不明顯（圖1）。

2.1.2 南柴胡 呈長(zhǎng)圓錐形，根頭多殘留1莖基，少見(jiàn)2～3個(gè)莖基，具毛刷狀葉柄殘基，俗稱“掃帚頭”，主根發(fā)達(dá)，下部多不分枝或少分枝，長(zhǎng)多為4～12 cm，直徑多為0.2～0.6 cm。表面紅棕色至棕褐色，近根頭處多具橫環(huán)紋，下部具有縱皺紋，可見(jiàn)支根痕。質(zhì)脆，易折斷，折斷面較平坦，纖維性不明顯。體視顯微鏡下，根中上部橫切面中心有裂隙，木質(zhì)部呈放射狀；根縱切面中上部具有彎曲紋理，下部較平坦。具敗油氣，味淡（圖2）。

A-藥材 B-橫切面（B1-中上部 B2-中部 B3-下部） C-折斷面 D-縱切面 E-表面特征

A-藥材 B-橫切面（B1-中上部 B2-中部 B3-下部） C-折斷面 D-縱切面 E-橫環(huán)紋

2.1.3 竹葉柴胡 呈長(zhǎng)圓錐形，根頭多殘留1個(gè)莖基，少見(jiàn)2～3個(gè)莖基，部分稍彎曲，主根發(fā)達(dá)，支根較多而細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)多為5～15 cm，直徑多為0.3～0.8 cm。表面紅棕色至黃棕色，具細(xì)密縱皺紋及少數(shù)細(xì)小橫向突起皮孔。質(zhì)堅(jiān)韌，不易折斷，折斷面不平坦，具細(xì)長(zhǎng)條狀纖維，纖維性較強(qiáng)。體視顯微鏡下，根中上、中、下部橫切面均致密，木質(zhì)部放射狀排列；縱切面較平坦。氣微香，味淡（圖3）。

A-藥材 B-橫切面（B1-中上部 B2-中部 B3-下部） C-折斷面 D-縱切面 E-表面特征

2.1.4 藏柴胡 呈長(zhǎng)圓錐形，根頭多殘留2個(gè)莖基，最多可至8個(gè)莖基，主根明顯，細(xì)長(zhǎng)，下部多分枝，長(zhǎng)多為20～30 cm，直徑多為0.5～1.2 cm。表面黃棕色，具縱皺紋，橫長(zhǎng)突起皮孔較多。質(zhì)地較柔韌，不易折斷，折斷面不平坦，具片狀纖維，纖維性較強(qiáng)。體視顯微鏡下，根橫切面韌皮部可見(jiàn)明顯斷續(xù)的黃棕色或黑棕色環(huán)紋；中上部至中部形成層明顯；木質(zhì)部大多呈2輪同心環(huán)排列；縱切面可見(jiàn)黃白色與棕黃色交錯(cuò)排列的縱紋。氣濃郁，味微辛辣（圖4）。

A-藥材 B-橫切面（B1-中上部 B2-中部 B3-下部） C-折斷面 D-縱切面 E-表面特征

2.1.5 大葉柴胡 入藥多為根莖部位，頂端多殘留1～3個(gè)莖基，呈不規(guī)則圓柱形，稍彎曲，長(zhǎng)為5～8 cm，直徑多為0.3～0.8 cm。表面黃棕色至深棕色，具密生橫環(huán)紋，根莖環(huán)節(jié)上多須根。質(zhì)較輕，易折斷，折斷面不平坦，具長(zhǎng)條狀纖維，纖維性較強(qiáng)。體視顯微鏡下，根莖中上部橫切面髓多中空，木質(zhì)部1～3輪同心環(huán)排列，中下部橫切面木質(zhì)部呈3～5輪同心環(huán)狀排列；縱切面中上部多中空。具芹菜香氣，味微苦澀，有麻舌感（圖5）。

2.1.6 錐葉柴胡 呈長(zhǎng)圓錐形，根頭部膨大，多殘留1個(gè)莖基，最多可達(dá)4個(gè)，具棕黑色至棕褐色毛刷狀葉柄殘基，主根較發(fā)達(dá)，不分支或少分支，長(zhǎng)多為5～10 cm，直徑多為0.4～0.8 cm。表面黑褐色至黑棕色，上部常見(jiàn)“疙瘩狀”突起。木栓層較厚，易脫落。質(zhì)較硬，易折斷，折斷面較平坦，無(wú)明顯纖維性。體視顯微鏡下，根中上部橫切面木質(zhì)部放射狀，形成“羽毛狀花瓣”樣，根中下部呈“菊花心”樣；縱切面中上部木質(zhì)部微彎曲、質(zhì)地疏松，下部平直、緊密。略具敗油氣，味微甜（圖6）。

A-藥材 B-橫切面（B1-中上部 B2-中部 B3-下部） C-折斷面 D-縱切面 E-表面特征

柴胡及常見(jiàn)混淆品的性狀-微性狀主要鑒別特征為入藥部位是否帶有根莖、根莖是否密生環(huán)節(jié)、殘存莖基的數(shù)量、根頭部特征、表面顏色、折斷面纖維性及橫切面中上部特征。北柴胡殘留莖基2～15個(gè)，表面黑褐色至淡棕色，根中上部橫切面木質(zhì)部呈3～8輪同心環(huán)狀；南柴胡根皮紅棕色至棕褐色，根頭部具“掃帚頭”狀葉柄殘基；竹葉柴胡與家種北柴胡相似，表皮紅棕色至黃棕色，殘留莖基多為1個(gè)，2～3個(gè)少見(jiàn)，但根中上部橫切面不呈同心環(huán)狀；藏柴胡橫切面韌皮部具黃棕色或黑棕色環(huán)紋，木質(zhì)部多呈2輪同心環(huán)狀；錐葉柴胡中上部橫切面木質(zhì)部呈“羽毛狀花瓣”樣；大葉柴胡入藥部位多為根莖，表面密生環(huán)節(jié)。性狀-微性狀鑒別特征具體見(jiàn)表2。

A1-藥材（帶纖維狀毛刷） A2-藥材（纖維狀毛刷脫落） B-根橫切面（B1-中上部 B2-中部 B3-下部） C-折斷面 D-縱切面 E-表面特征

2.2 橫切面顯微鑒別

選取藥材根中上部或根莖（大葉柴胡），番紅固綠染色，制備永久石蠟切片，油管及油室的確認(rèn)研究采用橫切面結(jié)合縱切面徒手切片法。觀察方法采用普通光明場(chǎng)與偏振光暗場(chǎng)對(duì)比觀察法，拍攝方法采用大圖影像拼接技術(shù)結(jié)合實(shí)時(shí)景深擴(kuò)展成像技術(shù)，獲取藥材橫切面顯微全息彩色影像圖。顯微標(biāo)注使用手性對(duì)標(biāo)法標(biāo)注（同一部位普通光、偏振光分別拍攝，偏振光圖像做橫向180度翻轉(zhuǎn)，與普通光圖像形成手性對(duì)稱圖），普通光（normal）明場(chǎng)下采集的圖像標(biāo)注為“N”，偏振光（polarization）暗場(chǎng)下拍攝的圖像標(biāo)注為“P”。

2.2.1 北柴胡根橫切面 木栓細(xì)胞6～10列，類方形或類多角形，長(zhǎng)約25～75 μm，寬約7～14 μm。皮層窄，少數(shù)油管散在。韌皮部狹窄，約占橫切面1/5，常見(jiàn)裂隙，油管3～7輪，稀疏環(huán)狀排列。形成層成環(huán)。木質(zhì)部寬廣，約占橫切面的2/3；導(dǎo)管較少，單個(gè)散在或徑向排列；木纖維發(fā)達(dá)，與木薄壁細(xì)胞排成斷續(xù)的3～8輪同心環(huán)；木射線明顯。木纖維和導(dǎo)管在偏振光下有明顯偏光現(xiàn)象（圖7、8）。

2.2.2 南柴胡根橫切面 木栓細(xì)胞8～16列，類方形或類多角形，長(zhǎng)15～49 μm，寬7～18 μm；皮層狹窄，少數(shù)油管散在。韌皮部較寬，約占橫切面的1/3，具較大油管1～3輪，稀疏環(huán)狀排列。形成層環(huán)狀。木質(zhì)部約占橫切面1/2；導(dǎo)管眾多，徑向排列，次生木質(zhì)部呈2到多歧狀分支，與木薄壁細(xì)胞排列成單環(huán)狀；木纖維較少，木射線寬廣。導(dǎo)管及木纖維在偏振光下有明亮的彩色光澤（圖9～10）。

2.2.3 竹葉柴胡根橫切面 木栓細(xì)胞4～7列，扁長(zhǎng)方形，長(zhǎng)30～55 μm，寬7～16 μm。皮層窄，少數(shù)油管散在。韌皮部較窄，約占橫切面的1/5，油管3～5輪，稀疏環(huán)狀排列。形成層環(huán)狀。木質(zhì)部約占橫切面的2/3；木質(zhì)部?jī)?nèi)側(cè)呈多歧狀分支，導(dǎo)管單個(gè)散在或徑向排列，徑向排列，內(nèi)側(cè)木纖維不發(fā)達(dá)，外側(cè)近形成層處木纖維發(fā)達(dá)，排列緊密，呈窄單環(huán)狀，約占橫切面1/5，內(nèi)側(cè)木射線寬廣。木纖維與導(dǎo)管高度木質(zhì)化，具有強(qiáng)烈偏振光現(xiàn)象（圖11、12）。

表2 柴胡及其混淆品性狀-微性狀鑒別主要特征

1-木栓層 2-皮層 3-油管 4-韌皮部 5-形成層 6-木質(zhì)部 7-裂隙 8-木纖維 9-導(dǎo)管 10-木射線

1-木栓層 2-皮層 3-油管 4-裂隙 5-韌皮部 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-導(dǎo)管 9-木纖維 10-木射線

2.2.4 藏柴胡根橫切面 木栓細(xì)胞4～8列，類方形，長(zhǎng)為25～60 μm，寬為14～20 μm。皮層較窄，少數(shù)油管散在。韌皮部較寬，約占橫切面的1/3，油管較多，5～8輪，密集環(huán)狀排列。木質(zhì)部較發(fā)達(dá)，約占橫切面的1/2；導(dǎo)管較少，單個(gè)散在或徑向排列；外側(cè)近形成層處木纖維發(fā)達(dá)，排列緊密，呈單環(huán)狀，約占橫切面2/5，內(nèi)側(cè)木射線寬廣。木纖維與導(dǎo)管強(qiáng)烈木化，偏振光現(xiàn)象明顯（圖13～14）。

1-木栓層 2-皮層 3-油管 4-韌皮部 5-裂隙 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-導(dǎo)管 9-木纖維 10-木射線

1-木栓層 2-油管 3-皮層 4-裂隙 5-韌皮部 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-木射線 9-導(dǎo)管 10-木纖維

1-木栓層 2-皮層 3-裂隙 4-油管 5-韌皮部 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-導(dǎo)管 9-木纖維 10-木射線

1-木栓層 2-皮層 3-裂隙 4-油管 5-韌皮部 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-導(dǎo)管 9-木射線 10-木纖維

2.2.5 大葉柴胡根莖橫切面 木栓細(xì)胞5～9列，類長(zhǎng)方形，長(zhǎng)為20～40 μm，寬為10～18 μm。皮層窄，有大型油室斷續(xù)環(huán)列，少數(shù)油管散在。韌皮部較寬，約占橫切面1/3，油管偶見(jiàn)。形成層環(huán)狀。木質(zhì)部發(fā)達(dá)，約占橫切面2/3；導(dǎo)管較少，徑向排列或斷續(xù)成環(huán)列；木纖維發(fā)達(dá)，與木薄壁細(xì)胞交互排列成3～5輪斷續(xù)的同心環(huán)狀；初生木射線呈輻射狀；髓部外側(cè)可見(jiàn)油管。木纖維和導(dǎo)管強(qiáng)烈木化，具有明顯的偏振光現(xiàn)象（圖15、16）。

2.2.6 錐葉柴胡根橫切面 木栓細(xì)胞15～22列，狹長(zhǎng)方形，長(zhǎng)為25～67 μm，寬為5～10 μm。皮層較窄，少數(shù)油管散在。韌皮部較窄，約占橫切面的1/6，油管較多，散在。射線部位形成層不明顯。木質(zhì)部較寬，約占橫切面2/3；導(dǎo)管較多，多徑向排列；木纖維較少；次生木射線呈多歧狀分支，微彎曲，使木化的導(dǎo)管及木纖維構(gòu)成“羽毛狀花瓣”。導(dǎo)管及木纖維木化，偏振光現(xiàn)象明顯（圖17、18）。

1-木栓層 2-皮層 3-裂隙 4-油管 5-韌皮部 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-導(dǎo)管 9-木纖維 10-木射線

1-木栓層 2-皮層 3-裂隙 4-油管 5-韌皮部 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-導(dǎo)管 9-木纖維 10-木射線

1-木栓層 2-皮層 3-油室 4-裂隙 5-韌皮部 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-木纖維 9-導(dǎo)管 10-油管 11-木射線 12-髓

1-木栓層 2-皮層 3-油室 4-韌皮部 5-裂隙 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-導(dǎo)管 9-木纖維 10-木射線 11-油管 12-髓

1-木栓層 2-皮層 3-裂隙 4-油管 5-韌皮部 6-形成層 7-木質(zhì)部 8-木纖維 9-導(dǎo)管 10-木射線

柴胡及常見(jiàn)混淆品的橫切面顯微主要鑒別特征為木纖維、導(dǎo)管、油管的數(shù)量與分布規(guī)律及是否存在大型油室。北柴胡木纖維發(fā)達(dá)，與木薄壁細(xì)胞成3～8輪同心環(huán)；南柴胡導(dǎo)管較多，徑向排列，次生木質(zhì)部呈2到多歧狀分支，與木薄壁細(xì)胞排列成單環(huán)狀；竹葉柴胡根橫切面木纖維發(fā)達(dá)，排列緊密，呈窄單環(huán)狀，約占橫切面1/5。藏柴胡木纖維束環(huán)較寬，約占木質(zhì)部約2/3；大葉柴胡根莖橫切面皮層有大型油室環(huán)列，韌皮部油管少見(jiàn)，髓部具數(shù)個(gè)油管；錐葉柴胡根橫切面導(dǎo)管眾多，徑向排列，外側(cè)多歧狀分支，稍彎曲，呈“羽毛狀花瓣”樣。橫切面顯微鑒別特征具體見(jiàn)表3。

2.3 粉末顯微鑒別

按照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2001顯微鑒別法項(xiàng)下粉末制片法制片。其特定部位粉末顯微鑒別特征的歸屬采用定位徒手刮取藥材粉末取材法取樣；油管及油室的確認(rèn)研究采用橫切面結(jié)合縱切面徒手定位取材法取樣；木質(zhì)部纖維及導(dǎo)管特征研究利用5%氫氧化鉀溶液進(jìn)行組織解離后制片觀察。取適量粉末置于載玻片上，水合氯醛加熱透化，滴加稀甘油，蓋上蓋玻片，置于偏振光顯微鏡下，在普通光明場(chǎng)和偏振光暗場(chǎng)下對(duì)比觀察，采用大圖影像拼接法結(jié)合實(shí)時(shí)景深擴(kuò)展成像技術(shù)獲取藥材粉末全息彩色影像數(shù)據(jù)。

表3 柴胡及其混淆品橫切面顯微主要鑒別特征

2.3.1 北柴胡 粉末黃棕色。木栓細(xì)胞無(wú)色或紅褐色，類長(zhǎng)方形或多角形，長(zhǎng)為30～60 μm，寬為10～20 μm。木纖維較多，長(zhǎng)梭形，末端漸尖，直徑為8～20 μm，壁厚為2～8 μm，成束或散在，木化，初生壁破碎成短須狀，紋孔稀疏，層紋不明顯。導(dǎo)管較少，多為網(wǎng)紋及螺紋導(dǎo)管。油管碎片長(zhǎng)條形，較多，內(nèi)含黃褐色分泌物（圖19）。

2.3.2 南柴胡 粉末紅棕色。木栓細(xì)胞無(wú)色或紅褐色，類長(zhǎng)方形，長(zhǎng)為30～50 μm，寬為8～30 μm。木纖維長(zhǎng)梭形，末端漸尖或鈍圓，直徑為8～20 μm，壁厚為2～8 μm，成束或散在，微木化，具孔溝，表面有稀疏螺狀或雙螺狀裂縫。葉基部纖維長(zhǎng)梭形，末端漸尖或鈍圓，較寬，直徑為15～50 μm，壁厚為3～10 μm，淡黃色，表面具緊密的螺狀交錯(cuò)裂縫。導(dǎo)管碎片多見(jiàn)，為螺紋及網(wǎng)紋導(dǎo)管。油管碎片長(zhǎng)條形，較少，內(nèi)含紅褐色或淡黃色分泌物（圖20）。

A-木栓細(xì)胞 B-油管 C-木纖維 D-導(dǎo)管

2.3.3 竹葉柴胡 粉末黃白色。木栓細(xì)胞黃褐色，類長(zhǎng)方形或多角形，壁稍厚，長(zhǎng)為30～60 μm，寬為20～30 μm。木纖維較多，長(zhǎng)梭形，末端尖細(xì)，邊緣光滑，直徑為7～20 μm，壁厚為3～10 μm，成束或散在，木化，可見(jiàn)孔溝，層紋不明顯。導(dǎo)管較少，多為螺紋型，偶見(jiàn)網(wǎng)紋。油管碎片長(zhǎng)條形，較多，內(nèi)含黃褐色分泌物（圖21）。

A-木栓細(xì)胞 B-油管 C1-木纖維 C2-葉基部纖維 D-導(dǎo)管

A-木栓細(xì)胞 B-油管 C-木纖維 D-導(dǎo)管

2.3.4 藏柴胡 粉末黃褐色。木栓細(xì)胞黃褐色，類長(zhǎng)方形或多角形，壁稍厚，長(zhǎng)為30～60 μm，寬為20～30 μm。木纖維較多，長(zhǎng)梭形，邊緣光滑，末端漸尖，直徑為7～20 μm，壁厚為3～10 μm，成束或散在，木化，可見(jiàn)孔溝。導(dǎo)管較少，多為螺紋和網(wǎng)紋導(dǎo)管。油管碎片呈斷續(xù)長(zhǎng)條形，較多，內(nèi)含黃褐色分泌物（圖22）。

2.3.5 大葉柴胡 粉末黃褐色。木栓細(xì)胞黃褐色，類方形，長(zhǎng)為25～40 μm，寬為15～30 μm。木纖維較多，長(zhǎng)梭形，兩端急尖或斜尖狀，直徑為7～18 μm，壁厚為3～6 μm，成束或散在，木化，可見(jiàn)孔溝。導(dǎo)管較少，多為網(wǎng)紋及螺紋導(dǎo)管?？梢?jiàn)大型油室碎片及長(zhǎng)條形油管碎片，內(nèi)含黃褐色分泌物（圖23）。

A-木栓細(xì)胞 B-油管 C-油室碎片 D-木纖維 E-導(dǎo)管

2.3.6 錐葉柴胡 粉末黑棕色。木栓細(xì)胞黃褐色，類方形或多角形，壁稍厚，長(zhǎng)為30～45 μm，寬為15～25 μm。木纖維較少，較細(xì)長(zhǎng)條形，末端多平截，成束或散在，直徑為10～15 μm，壁厚為3～5 μm，木化，壁稍厚，有孔溝。導(dǎo)管較多，多為螺紋導(dǎo)管，偶見(jiàn)網(wǎng)紋導(dǎo)管。油管碎片長(zhǎng)條形，較多，內(nèi)含深褐色至黃褐色分泌物（圖24）。

柴胡及其4種混淆品粉末顯微鑒別主要鑒別特征異同點(diǎn)見(jiàn)表4。粉末顯微特征差異較小，主要鑒別點(diǎn)為為木纖維特征、油管多少及是否存在油室大型油室碎片。北柴胡，木纖維眾多，長(zhǎng)梭形，末端漸尖，初生壁破碎成短須狀，油管較多。南柴胡木纖維長(zhǎng)梭形，末端漸尖或鈍圓，表面具稀疏螺狀或雙螺狀裂縫，油管較少。竹葉柴胡木纖維末端尖細(xì)，邊緣光滑，油管較多。藏柴胡木纖維長(zhǎng)梭形，邊緣光滑，末端漸尖，油管較多。大葉柴胡木纖維長(zhǎng)梭形，末端急尖或斜尖狀。錐葉柴胡木纖維細(xì)長(zhǎng)，末端多平截，油管較多。大葉柴胡木纖維長(zhǎng)梭形，末端漸尖或斜尖狀，可見(jiàn)油管及大型油室碎片。粉末顯微特征具體見(jiàn)表4。

A-木栓細(xì)胞 B-油管 C-木纖維 D-導(dǎo)管

表4 柴胡及其混淆品粉末顯微主要鑒別特征

3 討論

本實(shí)驗(yàn)基于實(shí)時(shí)景深擴(kuò)展-大圖影像拼接技術(shù)，結(jié)合偏振光顯微鑒別技術(shù)，對(duì)柴胡2個(gè)基原品種及其4種混淆品進(jìn)行了系統(tǒng)的生藥學(xué)研究。與《中國(guó)藥典》2020年版相比，性狀鑒別補(bǔ)充研究了精細(xì)微性狀鑒別特征，對(duì)柴胡藥材根或根莖的上、中、下部位橫切面進(jìn)行對(duì)比觀察，確定了柴胡藥材根或根莖上部橫切面組織構(gòu)造最具特征性，為最佳的橫切面顯微研究部位?！吨袊?guó)藥典》2020年版等文獻(xiàn)均未獲取柴胡藥材精細(xì)微性狀及完整橫切面顯微圖，存在組織切片影像碎片化問(wèn)題，難以呈現(xiàn)完整的組織構(gòu)造全貌；并且傳統(tǒng)拍攝多單次拍攝，對(duì)于顯微組織切片不平及大型組織聚焦點(diǎn)不同等情況，無(wú)法同時(shí)兼顧多個(gè)焦點(diǎn)，存在虛化、不清晰、不能聚焦整個(gè)平面的問(wèn)題，從而無(wú)法良好地呈現(xiàn)橫切面組織構(gòu)造的真實(shí)狀態(tài)，部分信息特征缺失。本實(shí)驗(yàn)微性狀及橫切面顯微鑒別利用實(shí)時(shí)景深擴(kuò)展-大圖影像拼接技術(shù)首次獲取了普通光下柴胡及其混淆品的完整植物組織橫切面高清數(shù)碼影像圖及植物組織橫切面顯微全息彩色數(shù)碼影像數(shù)據(jù)，解決了傳統(tǒng)顯微影像碎片化及無(wú)法兼顧影像清晰度和完整性的問(wèn)題，完整清晰地展示了組織顯微特征。其中，橫切面顯微鑒別還采用了普通光明場(chǎng)與偏振光暗場(chǎng)對(duì)比觀察法。具有雙折射性的組織，如木纖維、導(dǎo)管等，偏振光下，猶如黑夜里的景觀燈，色彩明亮、清晰易見(jiàn)；不具有雙折射性的組織，即單折射性的組織，如未木化的薄壁細(xì)胞，則呈現(xiàn)為黑色，融入黑色背景中，無(wú)法被觀察到。該方法可以快速定位導(dǎo)管、纖維等，并快速發(fā)現(xiàn)其分布規(guī)律，提高了柴胡組織顯微鑒定的效率并降低了鑒定難度。另外，本實(shí)驗(yàn)粉末顯微鑒別利用定位取材法確定各部位顯微鑒別特征，對(duì)于成束的纖維采用解離法制片，更加清晰完整地觀察到其細(xì)胞顯微特征。本實(shí)驗(yàn)總結(jié)了柴胡2個(gè)基原品種及其4種混淆品性狀微性狀、植物組織顯微橫切面及粉末的主要鑒別特征。本研究結(jié)果可為中藥柴胡及其常見(jiàn)混淆品的鑒別及《中國(guó)藥典》2020年版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)顯微鑒別項(xiàng)的提升提供科學(xué)依據(jù)，為柴胡及其混淆品的研究方法提供借鑒。

目前，藥材市場(chǎng)柴胡品種混亂現(xiàn)象嚴(yán)重。除本研究的4種常見(jiàn)混淆品外，部分地區(qū)還使用柴胡屬其他植物作為地方用藥或摻雜，甚至非柴胡屬植物，如花生根、瞿麥根、蠅子草根等摻入柴胡飲片中[14, 20]；經(jīng)調(diào)研，藥材市場(chǎng)上北柴胡栽培品雜交現(xiàn)象嚴(yán)重，雜交種的父本及母本不清，使用傳統(tǒng)生藥學(xué)研究方法進(jìn)行鑒別存在一定局限性，需要利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)鑒別法進(jìn)行有效補(bǔ)充研究。為保障種植柴胡基原的準(zhǔn)確，亟需從國(guó)家層面規(guī)范柴胡的種原供應(yīng)，做好種植中藥的種子資源保障工作。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification ofand its four adulterants based on extended depth of field imaging, image stitching and polarized microscopy techniques

WANG Lu1, YANG Chun-guo2, HAN Wen-kai1, CUI Ya-jun1, GAO Feng3, MA Hai-guang3, WEI Li-guo4

1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Shandong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd., Linyi 276067, China 3. Hebei Baicao-Kangshen Pharmaceutical Co., Ltd., Hengshui 053800, China 4. Department of Pharmacy, Fangshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine, Beijing 102400, China

To systematically study on the traits, micro-characters and microscopic identification characteristics of the two authentic varieties of Chaihu () and its four adulterants (,var.,,) in the market, based on extended depth of field imaging, image stitching and polarized microscopy techniques, which would provide a reference basis for identification and quality control.Morphological and micro-character identification methods were used in the character identification, and the normal bright field and polarized dark field contrast observation methods were used in the microscopic identification, combined with extended depth of field imaging and large image stitching techniques, to obtain holographic color images of cross-sections.The image data of the characters and micro-characters ofand its adulterants were obtained, and the normal light and polarized light holographic color image data of cross-section ofwere obtained for the first time.Systematic biopharmacological studies were conducted on the two basal species ofand its four adulterants. Compared with the 2020 edition of the, the character identification was supplemented with a study of the fine microscopic trait identification features. A comparative observation of the upper, middle and lower cross-sections of the roots or rhizomes of the herb identified the upper cross-section of the roots or rhizomes of the herb as the most characteristic tissue structure and the best site for cross-sectional microscopic study.and its four adulterants can be identified by using characters, micro-characters and microscopic identification comprehensively, especially the microscopic character under polarized light of the cross-section, which has obvious identification significance.

; chaotic varieties;DC.;Willd.;Wall. ex DC.;Wall. ex DC. var.(Wolff) Shan et Y. Li;Helm.;Turcz.; morphological identification; microscopic identification; polarized light

R286.2

A

0253 - 2670(2023)12 - 3999 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.026

2022-12-06

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”重點(diǎn)專項(xiàng)中藥國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)示范研究項(xiàng)目（2018YFC1707900）

汪 璐（1998—），女，在讀碩士，研究方向?yàn)橹兴幖吧幍馁|(zhì)量評(píng)價(jià)研究。Tel: 18721073720 E-mail: 183484939@qq.com

通信作者：崔亞君，女，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail: janney808@sina.com

馬海光，男，執(zhí)業(yè)中藥師。E-mail: 603843996@qq.com

#共同第一作者：楊純國(guó)，男，執(zhí)業(yè)中藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評(píng)價(jià)。

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]