田敬宇,高 雁,高興旺,曾 軍,趙鵬安,蘇比努爾·居來提

(1.新疆大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院,烏魯木齊 830046;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,烏魯木齊 830091;3.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗室,烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】連作往往導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降、土傳病害加重等[1]。新疆哈密瓜屬于甜瓜種下、長毛亞種下的夏甜瓜變種[2]。目前,在哈密、五家渠等哈密瓜主產(chǎn)區(qū)存在不同程度的連作障礙現(xiàn)象。連作障礙發(fā)生的根源是連作導(dǎo)致作物根際微生態(tài)失衡,研究大田種植哈密瓜后根際微生態(tài)的變化規(guī)律,對探究哈密瓜連作障礙機(jī)理,以及為進(jìn)一步開展哈密瓜連作障礙的防治有重要意義。【前人研究進(jìn)展】徐小軍等[3]發(fā)現(xiàn)隨甜瓜種植年限的增加,根際土壤營養(yǎng)元素失衡,土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷含量發(fā)生顯著變化。周艷麗等[4]和唐小付等[5]采用平板培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)甜瓜連作導(dǎo)致可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著變化。鄭立偉等[6]研究發(fā)現(xiàn)甜瓜連作導(dǎo)致全氮、速效氮、速效鉀含量和pH值顯著增加,以及假單胞菌、根瘤菌等有益菌屬豐度降低?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根際微生態(tài)失衡是連作障礙發(fā)生的根本原因,現(xiàn)有研究主要探究了甜瓜多年連作根際土壤的微生態(tài)變化規(guī)律,但瓜農(nóng)多采用休耕和輪作的短期種植方式緩解甜瓜連作障礙,關(guān)于甜瓜短期種植情況下根際土壤微生態(tài)變化規(guī)律的相關(guān)研究鮮見報道。需研究哈密瓜種植對根際土壤細(xì)菌群落組成和多樣性的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究在新疆五家渠市103團(tuán)選取3個哈密瓜種植大田,采集哈密瓜根際土和非根際土,通過細(xì)菌擴(kuò)增子測序技術(shù),分析不同樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),檢測土壤理化性質(zhì),并對土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)性分析,從土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)視角解析該區(qū)種植哈密瓜后根際微生態(tài)變化規(guī)律,為開展哈密瓜連作障礙的防控研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

2022年7月在新疆五家渠市103團(tuán)選取3片哈密瓜結(jié)實(shí)初期大田,分別標(biāo)記為W1(87°31′52″E, 40°23′27″ N)、W2(87°31′33″E, 44°20′33″N)和 W3(87°31′51″E, 44°19′29″N)。在每個樣地用土鉆隨機(jī)采集35個行間土壤[7]混作非根際土(采樣深度為0～20 cm),分別記為W10、W20和W30。隨機(jī)選取35株健康哈密瓜植株,采用抖根法采集哈密瓜根際土壤[8],分別記為W11、W21和W31。每個樣地采集5個土樣,裝入無菌袋后低溫運(yùn)回實(shí)驗室。每個土樣分成兩部分,一部分儲存于-80℃用于細(xì)菌擴(kuò)增子測序,另一部分自然風(fēng)干、研磨、過篩后用于理化性質(zhì)的測定。

1.2 方 法

1.2.1 土壤理化因子測定

土壤pH值采用PHS-3C型精密酸度計測定,EC值采用FE30電導(dǎo)率儀測定,全氮(TN)采用凱氏定氮法測定,全磷(TP)采用NaOH熔融-鉬銻抗比色法測定,全鉀(TK)采用NaOH熔融-火焰光度法測定,堿解氮(AN)采用堿解擴(kuò)散法測定,速效磷(AP)采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定,速效鉀(AK)采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定,土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)采用重鉻酸鉀滴定法測定,方法參照《土壤農(nóng)化分析》[9]。

1.2.2 土壤DNA提取

采用磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒提取土壤樣本中的基因組DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性后擴(kuò)增子測序分析。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增子測序

細(xì)菌16S rDNA基因的V3-V4區(qū)擴(kuò)增和測序,上游引物序列為341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3,下游引物序列為806R:5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3[10-11]。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物,Universal DNA純化回收試劑盒回收目的條帶。純化樣本使用NEB Next?Ultra DNA Library Prep Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,檢測合格后上機(jī)測序(北京諾禾致源科技有限公司)。測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(PRJNA898128)。

1.2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分,截去Barcode和引物序列后用FLASH[12]軟件拼接,獲得原始數(shù)據(jù)。用Vsearch[13]軟件將測序數(shù)據(jù)與物種注釋數(shù)據(jù)庫比對檢測,去除嵌合體序列,獲得有效數(shù)據(jù)。利用QIIME2軟件中的DADA2模塊過濾掉有效數(shù)據(jù)中豐度小于5的序列,獲得ASVs(Amplicon Sequence Variants,即擴(kuò)增子序列變異)數(shù)據(jù)集及特征表。用QIIME2軟件中的classify-sklearn模塊將ASVs與數(shù)據(jù)庫silva138.1比對進(jìn)行物種注釋,得到門綱目科屬種各分類水平上物種及豐度信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子測序,每個樣本獲得原始數(shù)據(jù)8×104條左右,剔除古菌ASVs,抽平后進(jìn)行后續(xù)分析。繪制門和屬水平百分比堆積圖;基于bray_curtis距離進(jìn)行PCoA (Principal Co-ordinates Analysis) 分析;使用LEfSe(LDA Effect Size)進(jìn)行LEfSe分析以闡釋各樣地標(biāo)志性差異物種(Biomarker);通過db-RDA(distance based redundancy analysis)分析環(huán)境因子與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系。除LEfSe分析外,所有數(shù)據(jù)分析和圖片繪制均利用R語言完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

研究表明,與非根際土壤比較,3個哈密瓜樣地的根際土壤理化性質(zhì)均發(fā)生了不同程度的變化,總體均表現(xiàn)出甜瓜種植后土壤pH顯著增加,而SOM、TP、TK、AN總體呈下降變化(P<0.05)。W1樣地:根際土的pH、EC和AP顯著增加(P<0.05),SOM、TK和AK顯著下降(P<0.05),AN無變化。W2樣地:根際土的pH和AK顯著增加(P<0.05),EC、SOM、TP、AN顯著下降(P<0.05),TN、TK無變化。W3樣地:根際土的pH和AK顯著增加(P<0.05),EC、TP、TK、AN和AP均顯著下降(P<0.05),SOM、TN無變化。表1

表1 3個哈密瓜樣地根際土/非根際土的土壤理化性質(zhì)

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 哈密瓜根際土和非根際土壤細(xì)菌α多樣性

研究表明,W1樣地中,根際土W11的細(xì)菌豐富度指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均低于非根際土W10;W2和W3樣地與W1樣地總體變化趨勢相反,但均無顯著性差異。表2

表2 3個哈密瓜樣地根際土/非根際土細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)

2.2.2 哈密瓜根際土和非根際土細(xì)菌β多樣性

研究表明,根據(jù)3個樣地中非根際土(W10、W20和W30)和根際土(W11、W21和W31)樣本所獲ASVs的豐度信息,進(jìn)行PCoA分析。3個樣地中哈密瓜種植根際土和非根際土細(xì)菌β多樣性,哈密瓜種植顯著改變了原有土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。圖1

圖1 3個哈密瓜樣地根際土/非根際土細(xì)菌群落主坐標(biāo)(PCoA)

2.2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

研究表明,共檢測到細(xì)菌43門、103綱、271目、440科、820屬。3個樣地細(xì)菌豐度排名前10的細(xì)菌門中,共有的優(yōu)勢細(xì)菌門有9個:變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、擬桿菌門(Bacteroidota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)和粘球菌門(Myxococcota);W1和W2樣地還有Entotheonellaeota,W3樣地還有藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)。圖2

圖2 3個哈密瓜樣地根際土/非根際土細(xì)菌群落相對豐度

對于W1樣地,種植后,厚壁菌門和粘球菌門相對豐度分別增加62.32%、10.27%,擬桿菌門和疣微菌門的相對豐度分別降低38.19%、23.05%。對于W2樣地,種植后,厚壁菌門和變形菌門相對豐度分別增加27.46%、7.21%,芽單胞菌門、擬桿菌門和酸桿菌門的相對豐度分別降低18.24%、19.79%和4.91%。W3樣地,種植后,藍(lán)細(xì)菌門和厚壁菌門相對豐度分別增加176.12%、70.56%;芽單胞菌門和酸桿菌門的相對豐度分別降低27.37%、16.93%。3個樣地的厚壁菌門相對豐度隨哈密瓜的種植而增加,酸桿菌門和綠彎菌門相對豐度隨哈密瓜的種植而下降。在屬水平上,W1樣地中,種植后假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假紅桿菌屬(Pseudarthrobacter)相對豐度分別增加444.74%、69.13%和34.65%,Vicinamibacteraceae屬的相對豐度降低22.59%。W2樣地中,種植后芽孢桿菌屬、假紅桿菌屬和假單胞菌屬相對豐度分別增加27.76%、18.75%和4.17%,Candidatus_Entotheonella屬和RB41屬相對豐度分別降低16.71%、12.85%。W3樣地中,種植后假單胞菌屬相對豐度增加665.56%,Vicinamibacteraceae屬、假紅桿菌屬、Skermanella屬和RB41屬相對豐度分別降低23.34%、21.32%、11.33%和3.83%。3個樣地的Pedosphaeraceae屬、Vicinamibacteraceae屬、Acidibacter屬、JG30-KF-CM45屬和Skermanella屬相對豐度隨哈密瓜的種植而下降,假單胞菌屬、芽孢桿菌屬相對豐度隨哈密瓜種植呈上升趨勢。另外, 3個樣地均發(fā)現(xiàn)在哈密瓜種植后特有的葡萄球菌屬(Staphylococcus)。圖2,表3

2.2.4 哈密瓜根際土和非根際土細(xì)菌差異標(biāo)志物種分析

研究表明,篩選出各樣地中的標(biāo)志性差異物種(Biomarker)。W1樣地中,W10中具有顯著性差異的生物標(biāo)志物主要包括擬桿菌門、擬桿菌綱(Bacteroidia)、Vicinamibacteria綱、噬纖維菌目(Cytophagales)、Vicinamibacterales目、Microscillaceae科、Vicinamibacteraceae屬;而W11中具有顯著性差異的生物標(biāo)志物主要包括厚壁菌門、芽孢桿菌綱(Bacilli)、芽孢桿菌目(Bacillales)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、芽孢桿菌屬。W2樣地中,W20中具有顯著性差異的生物標(biāo)志物主要包括芽單胞菌門、擬桿菌門、擬桿菌綱、芽單胞菌綱、噬纖維菌目、芽單胞菌目、Hymenobacteraceae科、芽單胞菌科、Pontibacter屬;W21中具有顯著性差異的生物標(biāo)志物主要包括γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬。W3樣地中,W30中具有顯著性差異的生物標(biāo)志物主要包括芽單胞菌門、芽單胞菌綱、Vicinamibacteria綱、芽單胞菌目、Vicinamibacterales目、芽單胞菌科、Vicinamibacterales科、Vicinamibacteraceae屬;W31中具有顯著性差異的生物標(biāo)志物為厚壁菌門。圖3

表3 3個樣地哈密瓜根際土/非根際土細(xì)菌在門、屬水平上的相對豐度

注:設(shè)定LDA閾值為3.5。紅色和綠色分類分別代表每個樣地根際土和非根際土中起重要作用的生物標(biāo)志物

2.3 土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌多樣性相關(guān)性

研究表明,db-RDA分析解釋了土壤細(xì)菌群落73.5%的總方差,土壤理化性質(zhì)會對土壤細(xì)菌群落組成造成不同影響,其中TP(R2=0.44)和pH(R2=0.21)是影響土壤細(xì)菌群落組成最主要的土壤環(huán)境因子。圖4

圖4 3個哈密瓜樣地根際土/非根際土 細(xì)菌門水平種類與理化因子基于 距離的冗余分析(db-RDA)

“TP+pH+TK+AK+TN+AP+AN”的組合對土壤中細(xì)菌群落的變化的影響最為明顯,相關(guān)系數(shù)為0.742 7,該組合對土壤細(xì)菌群落變化的影響具有極顯著性(P=0.001)。表4

表4 3個樣地哈密瓜根際土/非根際土中不同 環(huán)境因子組合與細(xì)菌群落的相關(guān)關(guān)系

3 討 論

3.1 大田種植哈密瓜后土壤理化性質(zhì)變化規(guī)律

3.2 大田種植哈密瓜后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)及植株健康狀況密切相關(guān)。作物種植往往引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。研究主要從門和屬水平分析哈密瓜種植后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。

在門水平上,變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是各樣本中細(xì)菌群落的優(yōu)勢門,鄭立偉等[6]發(fā)現(xiàn)甜瓜根際土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌門變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門,土壤優(yōu)勢物種種類和豐度的差異可能是由于土壤類型、管理模式等諸多因素導(dǎo)致。3個樣地中,厚壁菌門相對豐度均隨哈密瓜種植平均增加了53.5%,酸桿菌門和綠彎菌門相對豐度均隨哈密瓜種植呈下降趨勢,分別降低7.88%和5.06%。厚壁菌門能促進(jìn)作物生長發(fā)育,ZHU等[21]發(fā)現(xiàn)厚壁菌門是苧麻種植根際土壤中優(yōu)勢門,并且與連作苧麻的莖長、莖粗和纖維產(chǎn)量呈正相關(guān),這可以被視為是一種環(huán)境處于惡劣時期的自我調(diào)節(jié)過程[22]。酸桿菌門被列為潛在益生菌,具有降解復(fù)雜碳水化合物和促進(jìn)氮代謝的基因,在碳循環(huán)和氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用[23]。綠彎菌門包含可利用光照的菌種[24],哈密瓜種植一定程度降低根際土壤光照強(qiáng)度,從而使綠彎菌門的相對豐度降低。與非根際土壤相比,哈密瓜種植后導(dǎo)致根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)失衡,其中優(yōu)勢細(xì)菌門厚壁菌門相對豐度增加,酸桿菌門和綠彎菌門相對豐度降低,可能對下一茬哈密瓜的正常生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響。

在屬水平上,與空白對照組相比,在3個樣地中哈密瓜種植后根際土壤中Pedosphaeraceae屬、Vicinamibacteraceae屬、Acidibacter屬、JG30-KF-CM45屬和Skermanella屬的相對豐度呈降低趨勢,分別降低21.41%、15.64%、14.74%、12.33%和7.19%。Pedosphaeraceae屬參與有機(jī)碳積累和氮儲存等重要生態(tài)功能[25],哈密瓜種植后其豐度降低可能會導(dǎo)致營養(yǎng)元素失衡從而直接影響下一茬作物的生長發(fā)育及器官建成。Sarkar等[26]研究發(fā)現(xiàn)Vicinamibacteraceae屬是干旱土壤中的關(guān)鍵細(xì)菌種群,Vicinamibacteraceae屬相對豐度的差異可能歸因于哈密瓜種植降低了根際土壤的持水能力,這還需要進(jìn)一步驗證。Acidibacter屬是酸性條件耐受物種[27],其相對豐度的降低可能歸因于哈密瓜種植后根際土壤堿化。JG30-KF-CM45屬與土壤氮元素含量密切相關(guān),并且SHEN等[28]研究表現(xiàn)為促進(jìn)煙草生長的有益細(xì)菌屬。Badri等[29]研究發(fā)現(xiàn)Skermanella屬與擬南芥根際土壤中γ-氨基丁酸含量密切相關(guān),γ-氨基丁酸可為微生物提供碳源和氮源并且抑制土壤病原菌[30]。在3個樣地中均發(fā)現(xiàn)哈密瓜種植導(dǎo)致Pedosphaeraceae屬、Vicinamibacteraceae屬、JG30-KF-CM45屬和Skermanella屬等有益屬相對豐度降低。鄭立偉等[6]也發(fā)現(xiàn)溶桿菌屬 (Lysobacter)、Steroidobacter、Thioprofundum等與有害物質(zhì)分解和促生長物質(zhì)分泌相關(guān)的益生菌屬相對豐度隨甜瓜種植而降低,但具體益生菌屬變化趨勢不同,可能歸因于土壤微生物變化受種植作物、土壤類型、田間管理等諸多因素的影響。此外,在3個樣地中哈密瓜根際土中假單胞菌屬、芽孢桿菌屬的相對豐度呈增加趨勢,分別增加372.88%、32.81%;并且葡萄球菌屬單獨(dú)存在于哈密瓜根際土。芽孢桿菌屬與哈密瓜種子貯藏組織對刺激種子萌發(fā)和植物生長產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)及增強(qiáng)對病原真菌如貴腐霉菌等的抗性[31]。假單胞菌屬分泌多種抗生素、多糖及鐵載體,在生物防治中表現(xiàn)出巨大潛力[32]。葡萄球菌屬能夠合成生長素,表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)植物生長特性[33]。芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和葡萄球菌屬等益生細(xì)菌屬的相對豐度的增加可以被視為是一種環(huán)境處于惡劣時期的自我修復(fù)反應(yīng),或者說是有益細(xì)菌通過與病原微生物競爭和招募拮抗益生菌以改善根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu),增強(qiáng)植物對不利環(huán)境的適應(yīng)性[22]。

3.3 大田種植哈密瓜后土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群里結(jié)構(gòu)相關(guān)性規(guī)律

土壤細(xì)菌及功能群對環(huán)境因子的變化具有敏感性。哈密瓜種植導(dǎo)致土壤環(huán)境因子變化,會直接導(dǎo)致土壤微生物變化[6]。對照組和哈密瓜根際土在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上存在明顯差異。db-RDA分析顯示,土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境因子的改變密切相關(guān),土壤pH值與TP含量是影響哈密瓜根際土與非根際土細(xì)菌優(yōu)勢類群分布的主要因素。研究采用Mantel檢驗發(fā)現(xiàn)“TP+pH+TK+AK+TN+AP+AN”的組合對土壤中細(xì)菌群落的變化的影響最為明顯,相關(guān)系數(shù)為0.7427,這表明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)除主要受pH和TK影響外,還受多種理化因子共同影響。鄭立偉等[6]研究發(fā)現(xiàn)pH值對甜瓜根際土壤細(xì)菌群落解釋變異度最高,并且土壤pH、TN、AN、AP與鞘脂單胞菌屬、假單胞菌屬、芽單胞菌屬、Mycothermus屬等優(yōu)勢菌呈正相關(guān)。

4 結(jié) 論

4.1哈密瓜種植后會導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)變化,TP、TK、AN、AP、AK、SOM、pH和EC均發(fā)生顯著性變化,其中在3個樣地中pH值均隨哈密瓜的種植而顯著增加。

4.2哈密瓜種植后導(dǎo)致土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)存在差異,在3個樣地中哈密瓜種植后酸桿菌門和綠彎菌門相對豐度降低,厚壁菌門相對豐度增加;Vicinamibacteraceae屬、Pedosphaeraceae屬、Skermanella屬、JG30-KF-CM45屬等有益屬相對豐度降低,假單胞菌屬和芽孢桿菌屬相對豐度增加。

4.3土壤pH值與TP含量是影響哈密瓜根際土和非根際土細(xì)菌優(yōu)勢類群分布的主要因素。