唐碧徽,張俐華,李海英,張 沖,蔣廷浩,趙曉鈺,蔣 騰,丁雅文,吳盈萍,趙全莊

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,烏魯木齊 830052;2.新疆額敏縣國家級飛鵝保種場,新疆額敏 834606)

0 引 言

【研究意義】伊犁鵝是新疆特有的優(yōu)良地方禽種,耐粗放飼養(yǎng),肉質(zhì)優(yōu)良,但產(chǎn)蛋性能較低,且就巢性強,成年母鵝年均產(chǎn)蛋僅為6～15枚[1]?；魻柖喟图Z繁殖能力優(yōu)于伊犁鵝,且無就巢性,成年母鵝平均年產(chǎn)蛋為30～50枚[2]?；魻柖喟图Z在生產(chǎn)中可作為雜交親本對于提高雜交后代的生產(chǎn)性能具有顯著的雜交優(yōu)勢[3]。有效提高伊犁鵝的繁殖性能,對伊犁鵝的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】鵝的生產(chǎn)和繁殖特性在很大程度上取決于遺傳因素,其在品種之間的遺傳差異較為明顯[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5],鵝的基因型和品種對鵝的重要經(jīng)濟性狀有影響,如體重、飼料利用率、產(chǎn)蛋量、繁殖能力以及對飼養(yǎng)條件的適應性等。在鵝的生產(chǎn)中,經(jīng)常通過品種間雜交的方法充分利用各品種間的雜交優(yōu)勢提高生產(chǎn)性能。目前在已報道的文獻中,伊犁鵝只與豁眼鵝進行過雜交[6],左瑞華等[7]以皖西白鵝為父本與霍爾多巴吉鵝進行雜交試驗發(fā)現(xiàn),雜交后代的平均產(chǎn)蛋量和種蛋的受精率顯著高于純種皖西白鵝(P<0.05)。黃炎坤等[8]以浙東白鵝公鵝作為父本與霍爾多巴吉鵝進行雜交試驗,發(fā)現(xiàn)雜交后代的生產(chǎn)性能優(yōu)于純種浙東白鵝?；魻柖喟图Z在作為雜交親本時的優(yōu)勢表現(xiàn)較明顯?！狙芯壳腥朦c】伊犁鵝與霍爾多巴吉鵝在產(chǎn)蛋數(shù)量上存在較大差異,且有關于鵝種間繁殖性能比較研究的報道較少。基于霍爾多巴吉鵝在雜交改良方面的優(yōu)勢,結(jié)合伊犁鵝現(xiàn)階段需要得到繁殖性能的改良,亟需研究伊犁鵝與霍爾多巴吉鵝在繁殖性能方面的差異?！緮M解決的關鍵問題】比較伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝在相同飼養(yǎng)管理條件下的繁殖性能、生殖激素濃度和BMP2、BMP6、MIS、ENO1和EP300基因表達水平的差異,為霍爾多巴吉鵝改良伊犁鵝繁殖性能的可能性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗鵝

試驗選取健康狀況良好、飼養(yǎng)條件一致、處于產(chǎn)蛋期的2歲伊犁鵝母鵝和霍爾多巴吉鵝母鵝為研究對象,其中伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝各120只(公母比例為1∶4,公鵝24只,母鵝96只),以兩個品種為單位分組,每個品種的鵝群體分為24個重復,試驗周期為2022年3月～6月,試驗動物均由新疆額敏縣國家級新疆飛鵝保種場提供。

1.1.2 飼養(yǎng)管理

試驗在新疆額敏縣國家級新疆飛鵝保種場進行,對伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝進行分群,采用平地圈養(yǎng)的飼養(yǎng)方式,鵝舍內(nèi)設有料槽、產(chǎn)蛋窩、運動場和水池。在試驗期間飼喂產(chǎn)蛋期全價飼糧,飼糧營養(yǎng)水平參考美國NRC(1994)[9],試驗期每天于08:00、16:00各投料1次,投料后進行撿蛋,試驗期間鵝只自由采食和飲水。飼糧營養(yǎng)水平中,預混料為每千克飼糧提供:VA 8 250 IU,VD33 000 IU,VE 20 mg,VK32 mg,VB11.5 mg,VB26.25 mg,VB62.45 mg,VB120.02 mg,煙酸 29.5 mg,D-泛酸鈣 8 mg,葉酸 1 mg,生物素 0.08 mg,鐵 81 mg,銅 5.8 mg,鋅 63 mg,猛 95.5 mg,硒 0.41 mg,碘 0.72 mg,鈷 0.36 mg。表1

1.2 方 法

1.2.1 產(chǎn)蛋性能

每天準確記錄生產(chǎn)數(shù)據(jù),記錄日投料量、剩料量、產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、長徑、短徑及不合格蛋數(shù)(畸形蛋、沙皮蛋等),根據(jù)試驗期記錄的基礎數(shù)據(jù),計算平均日采食量、產(chǎn)蛋率、平均蛋重、日產(chǎn)蛋量、料蛋比、種蛋合格率以及蛋形指數(shù)。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.2.2 孵化性能

每日收集種蛋并進行編號,剔除不合格種蛋,分組放入蛋庫,每7 d入孵一批種蛋,入孵前記錄各重復的入孵蛋數(shù),試驗期內(nèi)進行8批孵化。在入孵第7、14 d進行照蛋,挑出不合格蛋(無精蛋、死精蛋以及死胎蛋),記錄每次入孵蛋數(shù)、受精蛋數(shù)、出雛數(shù)及健雛數(shù),并計算受精率、受精蛋孵化率以及健雛率。

1.2.3 血清生殖激素

隨機選取處于產(chǎn)蛋期的伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝母鵝各40只,翅下靜脈采血5 mL于無抗凝劑的真空采血管中,3 000 r/min離心10 min,吸取上層血清于1.5 mL離心管中,置于-20℃冰箱保存用于血清生殖激素的測定。

用雙抗體夾心法ELISA試劑盒對伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝的血清生殖激素水平進行測定,包括促黃體素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P4)、催乳素(PRL)和促性腺激素釋放激素(GnRH)的濃度。

1.2.4 基因表達量

隨機選取處于產(chǎn)蛋期的伊犁鵝母鵝和霍爾多巴吉鵝母鵝各4只,屠宰后快速采集下丘腦、垂體、卵巢及輸卵管組織,經(jīng)PBS沖洗處理后,放入含有RNA保存液的凍存管中標記,4℃靜置過夜,隨后再放到-80℃保存,用于各組織樣品中總RNA的提取。

選取5個候選基因為檢測對象,采用實時熒光定量PCR定量檢測下丘腦、垂體、卵巢和輸卵管中基因BMP2、BMP6、ENO1、EP300和MIS的表達。以GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)為內(nèi)參基因作為對照,根據(jù)GenBank中目標基因的mRNA序列,基因特異性引物采用Primer5.0設計,通過NCBI比對引物特異性,并委托上海生工生物技術有限公司合成。使用總RNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)從各個組織中提取總RNA。通過凝膠電泳評價RNA的提取質(zhì)量。使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)cDNA合成試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)按照制造商的說明逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。反應體系(20 μL)為:cDNA(適度稀釋)2.5 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)10 μL,ddH2O 6.7 μL。反應程序為:95℃ 5 min;95℃ 10 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達水平[10]。表2

表2 熒光定量PCR引物信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件整理,所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件分析。其中繁殖性能和血清激素濃度使用獨立樣本T檢驗,各組織中基因表達水平使用單因素方差和獨立樣本T檢驗,繁殖性能和血清激素濃度的結(jié)果均使用平均值±標準差(Mean±SD)來表示,各組織中基因表達水平的結(jié)果使用平均值±標準誤(Mean±SEM)表示,以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異不顯著,使用GraphPad Prism8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝生產(chǎn)和孵化性能的比較

研究表明,伊犁鵝的產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋量、平均日采食量、平均蛋重、蛋形指數(shù)、受精率和受精蛋孵化率分別顯著或極顯著低于霍爾多巴吉鵝45.79%(P<0.01)、45.40%(P<0.01)、21.11%(P<0.01)、13.46%(P<0.01)、2.63%(P<0.01)、18.89%(P<0.01)和12.34%(P<0.05),伊犁鵝的料蛋比極顯著高于霍爾多巴吉鵝37.31%(P<0.01),伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝的商品蛋合格率和健雛率差異不顯著(P>0.05)。表3

表3 伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝生產(chǎn)和孵化性能的比較

2.2 伊犁鵝與霍爾多巴吉鵝血清生殖激素水平的比較

研究表明,伊犁鵝血清中的GnRH、LH、FSH、E2和P4水平分別顯著或極顯著低于霍爾多巴吉鵝12.32%(P<0.01)、18.93%(P<0.01)、21.07%(P<0.01)、24.03%(P<0.01)和6.9%(P<0.05),伊犁鵝血清中的PRL水平顯著高于霍爾多巴吉鵝12.07%(P<0.05)。表4

表4 伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝血清生殖激素水平差異

2.3 基因表達量

2.3.1 BMP2、BMP6、MIS、ENO1、EP300基因在伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝的不同組織器官中的表達

研究表明,對于伊犁鵝,BMP2基因在卵巢中的表達量極顯著高于下丘腦、垂體和輸卵管(P<0.01),BMP6基因在卵巢和輸卵管中的表達量極顯著高于下丘腦和垂體(P<0.01),MIS基因在輸卵管中的表達量均極顯著高于其他組織(P<0.01),ENO1基因在4種組織中的表達量差異均不顯著(P>0.05),EP300基因在輸卵管中的表達量均顯著高于其他組織(P<0.05)。對于霍爾多巴吉鵝,BMP2和BMP6基因在卵巢中的表達量極顯著高于其他組織(P<0.01),在輸卵管中的表達量均顯著高于下丘腦和垂體(P<0.05),MIS、ENO1和EP300基因在輸卵管中的表達量均極顯著高于其他組織(P<0.01),其余組織間的表達量差異均不顯著(P>0.05)。表5

表5 5種基因在伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝的不同組織的表達

2.3.2 伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝在相同組織器官中BMP2、BMP6、MIS、ENO1、EP300基因表達量的比較

研究表明,在下丘腦中,伊犁鵝的ENO1和MIS基因的表達量均顯著或極顯著低于霍爾多巴吉鵝(P<0.05或P<0.01);在垂體中,伊犁鵝的MIS、ENO1和BMP6基因的表達量顯著或極顯著低于霍爾多巴吉鵝(P<0.05或P<0.01);在卵巢中,伊犁鵝的ENO1和MIS基因的表達量顯著或極顯著低于霍爾多巴吉鵝(P<0.05或P<0.01);在輸卵管中,伊犁鵝的ENO1和EP300基因顯著或極顯著低于霍爾多巴吉鵝(P<0.05或P<0.01),其余基因表達量間均無顯著差異(P>0.05)。圖1

注:未標注為差異不顯著,*代表差異顯著(P<0.05),**代表差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

3.1 伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝生產(chǎn)和孵化性能的比較

鵝的產(chǎn)蛋率是反映其繁殖性能的重要指標,主要受品種、環(huán)境和飼養(yǎng)管理等因素的影響[11],日產(chǎn)蛋量綜合考慮了產(chǎn)蛋率和蛋重兩個變化因素,能夠反映出某一品種禽類的產(chǎn)蛋性能[12]。研究發(fā)現(xiàn),蛋重本身與受精率和受精蛋孵化率之間呈正相關,隨著蛋重的增大,受精率和受精蛋孵化率出現(xiàn)增加的趨勢[13]。蘇蕊[14]對浙東白鵝、四川白鵝和豁眼鵝的種蛋特征及其孵化效果進行比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種鵝的蛋重和蛋形指數(shù)對孵化率影響較大。謝燕妮等[15]在相同飼養(yǎng)條件下對地方品種巴馬綠殼蛋雞和國外引進培育品種羅曼粉蛋雞、海蘭褐蛋雞進行產(chǎn)蛋性能的比較發(fā)現(xiàn),巴馬綠殼蛋雞的平均蛋重和平均產(chǎn)蛋率均顯著低于羅曼粉蛋雞和海蘭褐蛋雞,其料蛋比顯著高于羅曼粉蛋雞和海蘭褐蛋雞。葛盛芳等[16]在相同飼養(yǎng)條件下,對我國地方品種紹興鴨和國外引進品種康貝爾鴨進行比較研究發(fā)現(xiàn),康貝爾鴨的產(chǎn)蛋率略低于紹興鴨,但其蛋重顯著高于紹興鴨,日產(chǎn)蛋量顯著高于紹興鴨,表明康貝爾鴨的產(chǎn)蛋性能優(yōu)于紹興鴨。孫永峰等[17]對卡洛斯鵝、皖西白鵝及籽鵝進行比較研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種對鵝的產(chǎn)蛋數(shù)影響較大,籽鵝的平均產(chǎn)蛋數(shù)最高,受精率顯著高于皖西白鵝和卡洛斯鵝。段修軍等[18]對豁眼鵝、萊茵鵝和揚州鵝進行產(chǎn)蛋率、受精率、孵化率等指標的比較,結(jié)果顯示豁眼鵝的繁殖性能最高,揚州鵝居中,萊茵鵝最低。

研究中,伊犁鵝的產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋量、平均日采食量、平均蛋重、蛋形指數(shù)、受精率和受精蛋孵化率分別顯著或極顯著低于霍爾多巴吉鵝,這主要是與鵝品種間的特異性有關。而伊犁鵝的料蛋比極顯著高于霍爾多巴吉鵝,與謝燕妮等[15]研究發(fā)現(xiàn)地方品種巴馬綠殼蛋雞的料蛋比高于國外引進培育品種這一結(jié)果相似?？赡苁窍鄬τ诨魻柖喟图Z,伊犁鵝未經(jīng)歷過嚴格的人工選育,造成伊犁鵝的產(chǎn)蛋和孵化性能低于霍爾多巴吉鵝,料蛋比高于霍爾多巴吉鵝。

3.2 伊犁鵝與霍爾多巴吉鵝血清生殖激素水平的比較

生殖激素對家禽的卵泡發(fā)育和排卵等生理過程具有重要的意義[19]。下丘腦釋放促性腺激素釋放激素(GnRH),刺激垂體前葉分泌促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)和催乳素(PRL),促進排卵及卵泡發(fā)育[20],進而調(diào)節(jié)孕酮(P4)和雌二醇(E2)的分泌,P4與E2能夠協(xié)同促進母禽產(chǎn)蛋,各個激素共同調(diào)控鵝的繁殖活動[21]。張可山等[22]發(fā)現(xiàn),在產(chǎn)蛋期時,四川白鵝的GnRH水平顯著高于溆浦鵝,提示GnRH的水平差異可能與鵝的產(chǎn)蛋量有關。研究發(fā)現(xiàn)[23]FSH能夠促進卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育與成熟,提高雞胚卵巢生殖細胞的增殖活性,生殖細胞數(shù)目顯著增加,表示FSH可以提高禽類的生殖細胞的增殖活性。Sun等[24]發(fā)現(xiàn),血清中LH的濃度可能與卵巢和輸卵管的成熟度有關。Etches[25]等發(fā)現(xiàn),在雞中P4分泌的增加與排卵周期中LH釋放的增加相對應,兩種生殖激素可以促進卵泡成熟和排卵。Yang等[26]研究結(jié)果表明,LH和P4的分泌水平不同是導致鵝卵泡發(fā)育存在差異的原因,高濃度的LH和P4可能促進等級前卵泡向等級卵泡的發(fā)育,提高產(chǎn)蛋量。李曉坤等[27]研究表明,E2水平與產(chǎn)蛋率和孵化率存在極顯著相關。研究中,伊犁鵝血清中的GnRH、LH、FSH、E2和P4水平均顯著或極顯著低于霍爾多巴吉鵝,伊犁鵝在卵泡的生長發(fā)育和排卵能力方面弱于霍爾多巴吉鵝,這與研究中伊犁鵝的產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋量顯著低于霍爾多巴吉鵝的結(jié)果相一致。

PRL是引起家禽就巢的主導激素,PRL分泌水平的高低對鵝繁殖活動的調(diào)控機制有著不同程度的影響[28]。高水平的PRL通過抑制GnRH的分泌,來降低FSH和LH的分泌,從而抑制禽類卵泡的發(fā)育,導致禽類卵巢中的卵泡發(fā)生萎縮閉鎖的情況,使其產(chǎn)生就巢行為[29]。陳習中等[30]研究皖西白鵝的生殖激素水平,發(fā)現(xiàn)PRL有很強的抗性腺作用,也證明PRL濃度水平對鵝的“抱性”有促進作用。研究中,伊犁鵝血清中的PRL水平顯著高于霍爾多巴吉鵝(P<0.05),可能和伊犁鵝有很強的就巢性有關。

3.3 基因表達量差異

BMP2和BMP6是骨形態(tài)蛋白(BMP)家族的成員,屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族[31]。TGF-β超家族成員在動物卵母細胞的增殖和分化中發(fā)揮重要作用,并為顆粒細胞(GCs)和卵母細胞之間提供細胞間通訊,一些BMP因子在哺乳動物的卵巢和卵泡發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[32]。Ying等[33]發(fā)現(xiàn),BMP2在原始胚胎細胞的形成和卵巢卵泡發(fā)育中起著重要作用。BMP2基因在初級和次級顆粒細胞[34]以及竇卵泡的卵泡膜細胞和卵母細胞[35]中均得到了表達。Zhu等[36]研究發(fā)現(xiàn)BMP2的高表達可以抑制山羊顆粒細胞的凋亡。Yan等[37]對天府農(nóng)華麻鴨的性腺軸組織進行轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果表明BMP2是與鴨產(chǎn)蛋性能相關的候選基因。Huang等[38]對寧海土雞的卵巢進行轉(zhuǎn)錄組分析,預測了9個與產(chǎn)蛋調(diào)控有關的基因,其中包含BMP6基因。研究發(fā)現(xiàn)[39]BMP6主要來自于卵母細胞,可以促進牛的顆粒細胞分泌雌二醇和抑制素,同時抑制孕酮的分泌,從而延緩卵泡閉鎖。李玉春[40]研究BMP6基因在豬卵泡中的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP6在豬卵巢中表達,并有可能影響卵泡發(fā)育。

研究中,伊犁鵝垂體中的BMP6基因的表達量顯著低于霍爾多巴吉鵝,伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝的BMP2基因和BMP6基因均在卵巢中的表達量最高,在其他組織中,兩個基因的表達量均無顯著差異,BMP2和BMP6基因可能主要在卵巢中發(fā)揮調(diào)控作用,通過調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和排卵來調(diào)控鵝的產(chǎn)蛋性能。

α-烯醇化酶1(ENO1)是糖酵解途徑中的關鍵蛋白水解酶,在細胞的新陳代謝中發(fā)揮著重要作用,廣泛存在于動物機體的各個組織和器官之中[41]。鄭夢月等[42]研究不同繁殖期鵝的下丘腦、垂體和卵巢組織中ENO1的表達規(guī)律,發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)蛋期時,四川白鵝卵巢中ENO1的表達量均顯著高于下丘腦和垂體。季華[43]對籽鵝產(chǎn)蛋性狀的候選基因進行分析,ENO1基因?qū)ψ样Z的產(chǎn)蛋性能具有顯著影響。研究中ENO1基因在兩種鵝的輸卵管中表達量最高,其次是卵巢,且ENO1基因在霍爾多巴吉鵝中的表達量高于伊犁鵝。禽類的卵巢是產(chǎn)生卵細胞的部位,輸卵管是運送卵細胞和提供受精的部位,也是卵子的受精部位[44]。研究結(jié)果提示ENO1可能參與調(diào)控鵝的卵巢功能、卵泡發(fā)育和受精繁殖等過程。

抗苗勒氏管激素(AMH)又稱為苗勒管抵制物(MIS)[45]。AMH是一種轉(zhuǎn)化生長因子,僅在性腺中特異表達,在雌性動物中AMH主要參與調(diào)節(jié)原始卵泡的募集和卵泡選擇過程[46]。陳蓉等[47]檢測了連城白鴨不同等級卵泡中AMH等基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)在鴨等級前卵泡中AMH基因的高表達量有助于維持顆粒細胞未分化的狀態(tài),抑制原始卵泡的初始募集,進而維持卵泡的發(fā)育潛能。劉芮佳等[48]發(fā)現(xiàn)AMH可影響卵泡對FSH的敏感性,在卵泡選擇過程中起關鍵作用,從而調(diào)節(jié)產(chǎn)蛋量。Shen等[49]通過全基因組關聯(lián)分析篩選了影響雞卵泡數(shù)的候選基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMH基因在雞的卵泡發(fā)育中起到了關鍵作用。E1A結(jié)合蛋白P300(EP300)作為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,在細胞增殖和分化過程中起重要作用。陳宇[50]對豬的全基因組SNP篩選時發(fā)現(xiàn),EP300可能是與豬繁殖性狀相關的候選基因。

研究中MIS和EP300基因在伊犁鵝和霍爾多巴吉鵝輸卵管中的表達量均顯著高于其他組織;MIS基因表達量在霍爾多巴吉鵝的下丘腦、垂體和卵巢中均顯著高于伊犁鵝;EP300基因表達量在霍爾多巴吉鵝的在輸卵管中顯著高于伊犁鵝。

4 結(jié) 論

伊犁鵝的產(chǎn)蛋率、受精率和受精蛋孵化率等均低于霍爾多巴吉鵝,伊犁鵝血清GnRH、LH、FSH、E2和P4水平均顯著或極顯著低于霍爾多巴吉鵝,PRL水平顯著高于霍爾多巴吉鵝。BMP2、BMP6、MIS、ENO1、EP300基因表達量之間的差異可能影響了伊犁鵝與霍爾多巴吉鵝之間的卵泡發(fā)育,繼而調(diào)控鵝的繁殖性能。