王 寧,史應(yīng)武,牛新湘,楊紅梅,楚 敏,詹發(fā)強(qiáng),包慧芳,楊 蓉,龍宣杞,丁榮榮

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所,烏魯木齊 830091; 4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第七師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,新疆奎屯 833200)

0 引 言

【研究意義】棉花在我國(guó)經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位[1]。新疆已發(fā)展為我國(guó)最大棉花種植基地及優(yōu)質(zhì)棉生產(chǎn)基地[2]。2021年我國(guó)棉花種植面積302.81×104hm2(4 542.15×104畝) ,棉花總產(chǎn)量573.1×104t,其中新疆地區(qū)棉花種植面積為250.61× 104hm2(3 759.15×104畝),棉花產(chǎn)量為512.9×104t,占全國(guó)棉花總產(chǎn)量的89.50%[3]。新疆地區(qū)降水少、蒸發(fā)大,棉田土壤鹽漬化問(wèn)題較突出[4]。黃萎病(VerticilliumdahliaKleb．)是新疆棉花生產(chǎn)中重要病害之一[5]。鹽漬化土壤普遍含有較高濃度的鹽離子,會(huì)限制棉花對(duì)土壤中其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[6]。磷素是植物生長(zhǎng)所需的第二大元素,而溶磷微生物能夠有效轉(zhuǎn)化鹽漬化土壤中難溶磷,提高磷肥利用率、促進(jìn)作物增產(chǎn)、提高抗病力,減輕土壤對(duì)化學(xué)肥料的依賴[7]。溶磷菌能夠抑制棉田土壤病原菌的生長(zhǎng)、降低棉花病害的作用,對(duì)于棉花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根據(jù)溶磷微生物作用底物的不同,溶磷菌可分為有機(jī)磷分解菌和無(wú)機(jī)磷分解菌,部分菌種又同時(shí)具有溶解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷作用[8,9]。環(huán)境因素、土壤類型、土壤理化性狀、人為干擾等因素影響溶磷菌在土壤中的數(shù)量和種類。細(xì)菌、真菌和放線菌中都能篩選出具備溶磷功能的菌種,目前報(bào)道的細(xì)菌種屬主要包括假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)等。利用農(nóng)田特有生境下的溶磷菌生產(chǎn)菌肥,利于有益菌在作物根部定殖,原位分離是篩選有益微生物的重要來(lái)源[10]。有機(jī)磷降解枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)通過(guò)分泌抑菌物質(zhì)抑制棉花黃萎菌生長(zhǎng)繁殖[11]。溶磷枯草芽孢桿菌包衣玉米種子,能夠顯著抑制紅粉鐮刀菌(Fusariumroseam)的生長(zhǎng),從而防治玉米苗腐病發(fā)生[12]。通過(guò)22種土壤固氮或解磷細(xì)菌對(duì)茄黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)和黃瓜角斑病菌(Pseudomonassyringae)等9種植物病菌平皿抑菌實(shí)驗(yàn),2株溶磷菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌防病效果[13]。溶磷菌產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA),可影響病原菌與植物之間相互作用[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】溶磷微生物田間應(yīng)用效果受諸多因素的影響,其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成是影響溶磷菌施用效果的重要因素。探索臺(tái)灣假單胞菌(Pseudomonastaiwanensis)液體發(fā)酵增菌的研究較少。正交試驗(yàn)?zāi)芙鉀Q發(fā)酵培養(yǎng)基選優(yōu)問(wèn)題[15-18],但針對(duì)臺(tái)灣假單胞菌發(fā)酵條件研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從新疆棉田分離出1株高效無(wú)機(jī)磷分解菌(Pseudomonastaiwanensis) WJP-7,采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究菌株WJP-7培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵效果的影響,挖掘臺(tái)灣假單胞菌WJP-7的施用價(jià)值,分析培養(yǎng)基組成對(duì)WJP-7發(fā)酵效果的影響,得出WJP-7液體發(fā)酵最佳發(fā)酵工藝,為研究WJP-7菌的增菌條件及田間應(yīng)用效果評(píng)價(jià)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種與菌劑

2020年4～10月在胡楊河市130團(tuán) 8連試驗(yàn)地開(kāi)展。前茬為棉花,面積約 9 hm2。土壤養(yǎng)分:有機(jī)質(zhì)含量13.2 g/kg,堿解氮63.25 mg/kg,速效磷12.4 mg/kg,速效鉀410.2 mg/kg,pH值 7.01。4月15日整地,基施尿素 14 kg/667m2,磷酸二銨 13 kg/667m2,硫酸鉀 4 kg/667m2。4月20日播種,種植不抗病的新陸早16號(hào)檢驗(yàn)菌肥的效果。試驗(yàn)區(qū)田間管理、病蟲(chóng)害防治與對(duì)照相同。4月20日播種,4月25日滴出苗水。全生育期澆水10 次,5月29日第1次滴頭水,每隔7～10 d滴1次水。其他栽培管理同大田生產(chǎn)相同。

P.taiwanensisWJP-7 由新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期自行篩選。

65×108/mL芽孢桿菌可濕性粉劑,實(shí)驗(yàn)室中試產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 NA培養(yǎng)基

液體NA培養(yǎng)基用于菌種的活化,固體NA培養(yǎng)基用于活菌計(jì)數(shù)與保藏。

1.1.2.2 假單胞菌初始培養(yǎng)基

蛋白胨0.5%、MgCl20.5%、K2SO40.07%,pH 7.0,滅菌121℃,20min。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)排列,共設(shè)3個(gè)處理,處理1(T1):滴施“30×108CFU/mL WJP-7水劑”5.0 kg/667m2;處理2(T2):滴施“65×108CFU/g芽孢桿菌可濕性粉劑”2.0 kg/667m2;處理3(CK):對(duì)照,滴施清水。每個(gè)處理面積1 hm2,重復(fù)3次。在棉花頭水(5月29日)滴施,每次施用時(shí)先滴清水,膜邊行見(jiàn)水濕透后,再把2種菌劑加入到施肥罐中滴施 0.5 h左右,滴水量約30 m3。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

采用五點(diǎn)取樣法,選擇試驗(yàn)區(qū)代表性5個(gè)取樣點(diǎn),每個(gè)點(diǎn)連續(xù)調(diào)查300株棉花,在花期和吐絮期調(diào)查棉花黃萎病發(fā)病株數(shù)。病情分級(jí)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22101.5-2009)中5級(jí)分級(jí)法,計(jì)算發(fā)病株率和病情指數(shù)。棉花黃萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8-11]:0級(jí),健株;1級(jí),病株葉片有25%以下葉片顯癥;2級(jí),病株葉片有25%～50%表現(xiàn)病狀;3級(jí),病株葉片有50%以上葉片顯癥;4級(jí),全株葉片發(fā)病,干枯脫落成光稈或急性萎蔫死亡。

病情指數(shù)=∑(級(jí)值×株數(shù))/(最高級(jí)值×總株數(shù))×100;防治效果(%)=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)) /對(duì)照病情指數(shù)×100。每個(gè)處理選擇有代表性樣點(diǎn)5個(gè),每點(diǎn)標(biāo)記棉株20株,棉花收獲期時(shí)調(diào)查各處理收獲株數(shù),標(biāo)記棉株上成鈴數(shù),測(cè)定平均單鈴重,計(jì)算產(chǎn)量。

1.2.3 菌株搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化

將臺(tái)灣假單胞菌WJP-7菌種劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿,28℃倒置培養(yǎng)24 h,挑取典型菌落接種于液體假單胞菌初始培養(yǎng)基,28℃搖床震蕩培養(yǎng) 18～20 h,作為種子液。在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上選擇蛋白胨、MgCl2、K2SO4為主要試驗(yàn)因素,設(shè)計(jì)L9(34)三因素三水平正交試驗(yàn),優(yōu)化假單胞菌WJP-7菌株的搖瓶增菌工藝條件。正交試驗(yàn)將WJP-7種子液接種到三角瓶,在溫度28℃、初始 pH 7.0、接種量1%、轉(zhuǎn)速180 r/min,搖床恒溫震蕩培養(yǎng) 12 h,測(cè)定OD600值,比較不同發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)臺(tái)灣假單胞菌WJP-7生長(zhǎng)的影響。表1

表1 因素水平

1.2.4 最優(yōu)條件發(fā)酵驗(yàn)證

參照菌株搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)得到的最佳增菌發(fā)酵培養(yǎng)基,采用搖瓶液體培養(yǎng)WJP-7菌株,在接種量1%、轉(zhuǎn)速180 r/min,溫度28℃、初始 pH 7.0、搖床恒溫培養(yǎng)20 h,收獲菌液,測(cè)定OD600值,驗(yàn)證正交試驗(yàn)增菌結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò) SPSS Statistics 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 WJP-7菌株搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化

研究表明,臺(tái)灣假單胞菌WJP-7發(fā)酵培養(yǎng)基中9號(hào)條件下發(fā)酵培養(yǎng)菌液濃度最高,3種發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)對(duì)臺(tái)灣假單胞菌培養(yǎng)濃度的影響順序?yàn)榈鞍纂?MgCl2>K2SO4,發(fā)酵培養(yǎng)條件最優(yōu)組合為A3B3C2。表2

表2 L9(34)正交試驗(yàn)

3個(gè)試驗(yàn)因素中,第一個(gè)即蛋白胨添加量的P值為0.002,小于判錯(cuò)臨界概率0.005,而MgCl2、K2SO4含量的添加P值分別為0.140、0.412,大于0.05。蛋白胨含量對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有顯著影響,各因素的最優(yōu)水平為A3B3C2,最佳WJP-7菌株培養(yǎng)基配方為蛋白胨20 g/L,氯化鎂15 g/L,硫酸鉀1.4 g/L。表3,圖1

表3 方差分析

圖1 三試驗(yàn)因素與菌體濃度趨勢(shì)

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

研究表明,與初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比,優(yōu)化后假單胞菌WJP-7活菌數(shù)在8 h后達(dá)到穩(wěn)定的平臺(tái)期,20 h活菌數(shù)高達(dá)3.60×109CFU/mL。發(fā)酵穩(wěn)定期活菌數(shù)有顯著性差異(P<0.05)。圖2

圖2 增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3 菌劑田間試驗(yàn)

2.3.1 不同處理對(duì)棉花黃萎病的防治效果

研究表明,不同處理黃萎病病情指數(shù)分別為2.51、1.12和 4.52,其中65×108CFU/g枯草芽胞桿菌可濕性粉劑處理的棉花黃萎病病情指數(shù)最低,30×108CFU/mL WJP-7水劑和65×108CFU/g枯草芽胞桿菌可濕性粉劑處理對(duì)花期黃萎病防效分別為44.57%和75.22%,絮期防治效果分別為50.53%和60.82%。表4

表4 不同處理對(duì)棉花黃萎病的防治效果比較

2.3.2 不同處理對(duì)棉田土壤理化性質(zhì)的影響

研究表明,施用2種微生物菌劑分別顯著提高了棉田土壤堿解氮、有效磷和速效鉀含量14.45%、45.40%、9.70%和19.44%、25.26%、10.02%(P<0.05),可顯著提高土壤pH值;而施用微生物菌劑對(duì)棉田土壤除全氮的含量增加不顯著外(P>0.05),對(duì)其它養(yǎng)分和pH值均有顯著影響(P<0.05)。表5

表5 不同菌劑下棉田土壤理化性質(zhì)變化

2.3.3 不同處理對(duì)棉花產(chǎn)量構(gòu)成因子及產(chǎn)量的影響

研究表明,棉花滴施30×108CFU/mL WJP-7水劑和65×108CFU/g枯草芽胞桿菌可濕性粉劑后收獲株數(shù)比對(duì)照增加700株/667m2和800株/667m2,單株鈴數(shù)增加0.15和0.21個(gè),對(duì)單鈴重影響較小,產(chǎn)量增加54.86和74.64 kg/667m2,增產(chǎn)率為14.35%和19.51%,其中65×108CFU/g枯草芽胞桿菌可濕性粉劑增產(chǎn)效果最明顯。表6

表6 不同處理下棉花產(chǎn)量性狀變化

3 討 論

3.1如何將土壤中作物不可利用的無(wú)效磷轉(zhuǎn)換成可吸收的溶解態(tài)磷,是提高作物對(duì)磷元素?cái)z取的關(guān)鍵[19]。李凌凌等[20]從車前草根際中分離到P.taiwanensisP2菌株,經(jīng)優(yōu)化后其溶解磷酸三鈣的最大溶磷量為優(yōu)化前的1.43倍。Nandre VS等[21]證明P.taiwanensis能改變磷酸鹽的溶解狀態(tài)是因?yàn)楫a(chǎn)生鐵載體,鐵載體對(duì)磷酸鹽的循環(huán)利用起重要作用。Chaudhary P等[22]的試驗(yàn)表明P.taiwanensis與納米石膏聯(lián)合使用不僅活化土壤元素,還可以顯著提高土壤酶活,幫助植物構(gòu)建更為健康的根系微生態(tài)環(huán)境。對(duì)分離自棉花根際的P.taiwanensisWJP-7進(jìn)行增菌工藝研究,確定其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨20 g/L,氯化鎂15 g/L,硫酸鉀1.4 g/L,為其商品化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3.2細(xì)菌發(fā)酵是一個(gè)利用細(xì)菌的特殊代謝途徑,受復(fù)雜動(dòng)態(tài)及多因素影響地轉(zhuǎn)化原料為目標(biāo)產(chǎn)物的生物化學(xué)過(guò)程[23, 24]。細(xì)菌發(fā)酵分為厭氧和好養(yǎng)兩種,發(fā)酵方式很多,種類繁多,產(chǎn)物豐富,應(yīng)用廣闊。假單胞菌生長(zhǎng)繁殖能力不僅取決于菌種性能,也受細(xì)菌發(fā)酵條件如培養(yǎng)基成分、溫度、初始pH、接種量、溶氧等的影響。適宜的發(fā)酵條件加速假單胞菌生長(zhǎng)繁殖,關(guān)系到發(fā)酵的成敗。培養(yǎng)基、初始 pH值、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時(shí)間等對(duì)假單胞菌發(fā)酵的影響極大,互相作用,互相影響[25, 26],高產(chǎn)發(fā)酵需要各因素之間的最佳配合,尤其是培養(yǎng)基配方一定要科學(xué)合理。

3.3目前,國(guó)內(nèi)生防微生物細(xì)菌等發(fā)酵條件的優(yōu)化多采用正交試驗(yàn)[27-29],考慮培養(yǎng)基及其交互作用的報(bào)道較少。正交試驗(yàn)研究表明,最優(yōu)培養(yǎng)基配方確定為蛋白胨20 g/L,氯化鎂15 g/L,硫酸鉀1.4 g/L。初始 pH 7.0、發(fā)酵溫度 28℃、發(fā)酵時(shí)間20 h,活菌數(shù)最高。微生物發(fā)酵液具備安全、無(wú)污染、易降解等。在發(fā)酵過(guò)程中,WJP-7菌株可能分泌水解酶,利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)大分子有機(jī)物,產(chǎn)生促生物質(zhì)IAA及抑菌物質(zhì)。

4 結(jié) 論

正交試驗(yàn)優(yōu)化了臺(tái)灣假單胞菌WJP-7搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配方為蛋白胨 20 g/L,MgCl215 g/L,K2SO41.4 g/L,活菌數(shù)達(dá)到3.6×109CFU/mL。搖瓶增菌發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)最高活菌數(shù)高達(dá)3.60×109CFU/mL。菌株WJP-7水劑處理對(duì)棉花黃萎病防治效果為50.53%,對(duì)棉田土壤除全氮含量不顯著外,對(duì)其它養(yǎng)分和pH值均顯著影響(P<0.05),增產(chǎn)率為14.35%,具有明顯的增產(chǎn)效果。