王曉麗，王常榮，劉仲齊，黃益宗，孔維勇，黃永春*，劉斌

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南寧 537000）

鎘（Cd）是一種有較強(qiáng)致癌風(fēng)險(xiǎn)[1]的高毒非必需重金屬元素。環(huán)境中的鎘主要來(lái)自于礦山開采[2]、污水灌溉[3]、施用有機(jī)肥[4]以及大氣沉降[5]等多種途徑。當(dāng)前，鎘已經(jīng)成為我國(guó)耕地中最主要的重金屬污染元素，其點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)7.0%[6]。在我國(guó)南方部分水稻主產(chǎn)區(qū)，土壤鎘污染問(wèn)題尤為突出，這給水稻安全生產(chǎn)帶來(lái)潛在威脅。目前水稻已成為我國(guó)第一大糧食作物，同時(shí)水稻也是一種對(duì)鎘富集能力較強(qiáng)的大宗農(nóng)作物[7]，即使土壤鎘濃度在較低水平下也可能會(huì)出現(xiàn)稻米鎘含量超標(biāo)現(xiàn)象。我國(guó)大部分人口以稻米為主糧，有研究表明我國(guó)人口攝入的鎘約56.0%來(lái)源于食用鎘污染稻米[8]。由此可見(jiàn)，鎘被水稻吸收后不僅會(huì)影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育[9]，而且還會(huì)對(duì)人體健康造成潛在威脅。由稻田土壤鎘污染導(dǎo)致的稻米鎘超標(biāo)問(wèn)題已經(jīng)引起全球環(huán)境科學(xué)家的廣泛關(guān)注。

為實(shí)現(xiàn)水稻的安全生產(chǎn)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已研發(fā)出多種有效的降鎘措施，如土壤重金屬鈍化技術(shù)[10-11]、水份調(diào)控技術(shù)[12]、植物修復(fù)技術(shù)[13]、篩選種植低鎘累積品種[14]等。近年來(lái)，隨著我國(guó)無(wú)人機(jī)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，無(wú)人機(jī)噴施技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用，這極大提高了田間生產(chǎn)效率，顯著降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)也助推了重金屬葉面阻控技術(shù)的快速發(fā)展。有研究表明，水稻籽粒中的鎘主要來(lái)源于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段累積在莖葉中的鎘[15]，以及灌漿期由根部吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的鎘[16]。在水稻灌漿期提高水稻營(yíng)養(yǎng)器官對(duì)鎘的攔阻能力，大幅阻斷鎘從營(yíng)養(yǎng)器官向籽粒中轉(zhuǎn)運(yùn)可顯著降低稻米中鎘含量。已有研究表明，于水稻灌漿期噴施硅元素[17]、鋅元素[18-19]、硒元素[20]、小分子酸[21]等都具有顯著降低水稻籽粒中鎘含量的作用。這些技術(shù)主要通過(guò)增加莖稈細(xì)胞壁攔阻能力[22]或通過(guò)離子拮抗作用以及生理調(diào)控等機(jī)制達(dá)到降低水稻籽粒鎘含量的目的。目前開發(fā)出的重金屬葉面阻控劑產(chǎn)品大部分用于水稻開花灌漿期，但是在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)適宜噴施時(shí)間窗口較短，因此存在在窗口期內(nèi)較難完成大面積推廣應(yīng)用的問(wèn)題，而且在水稻開花期常遇到降雨等不適宜噴施的氣象條件，這就更加縮短了施工窗口期。因此生產(chǎn)上更希望開發(fā)出在苗期至抽穗期噴施也可降低水稻鎘含量的葉面阻控劑產(chǎn)品。

前期本課題組已研究發(fā)現(xiàn)，在田間條件下于水稻開花期噴施2，3-二巰基丁二酸（DMSA）可顯著降低水稻籽粒中的鎘含量[23]。水培試驗(yàn)也表明，噴施DMSA 可顯著減少鎘由根部向莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)，降低水稻幼苗莖葉鎘含量[24]。DMSA 是一種含有雙巰基的重金屬螯合劑，在人和動(dòng)物體內(nèi)其可與重金屬形成螯合物，進(jìn)而通過(guò)排泄系統(tǒng)排出體外實(shí)現(xiàn)解毒功能[25]，醫(yī)療上可以作為人和動(dòng)物的重金屬解毒劑。但是到目前為止，尚不清楚葉面噴施DMSA 降低水稻幼苗莖葉鎘含量的潛在機(jī)制。本研究擬借助水培試驗(yàn)，系統(tǒng)研究葉面噴施DMSA 對(duì)鎘在水稻幼苗根、莖基、莖葉等不同器官中分布的影響以及對(duì)水稻幼苗營(yíng)養(yǎng)器官鎘脅迫的緩解作用。利用分步提取技術(shù)研究噴施DMSA 對(duì)水稻幼苗不同營(yíng)養(yǎng)器官中鎘化學(xué)形態(tài)的影響，采用差速離心技術(shù)研究鎘在幼苗莖基中的亞細(xì)胞分布情況，借助高效液相色譜分析莖基中總植物螯合素（PCs）和谷胱甘肽（GSH）含量。并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究鎘在水稻莖基細(xì)胞壁不同組分（包括果膠、半纖維素、纖維素）中的分布情況，以揭示噴施DMSA 降低水稻幼苗莖葉鎘含量的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)方法

以我國(guó)南方主栽水稻品種之一“中早35”作為試驗(yàn)材料。將飽滿均一的種子在H2O2中浸泡消毒30 min 后用去離子水反復(fù)沖洗多次，然后均勻鋪在育苗盤上，在去離子水中進(jìn)行第一階段培養(yǎng)。待種子發(fā)芽后移至人工氣候室內(nèi)，直至水稻幼苗長(zhǎng)至兩葉一心期，將其轉(zhuǎn)移至盛有1/10 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的水培箱中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，隨時(shí)觀察水稻幼苗生長(zhǎng)情況并補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液。水稻幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗在去離子水中饑餓處理1 d后轉(zhuǎn)移至含有2.7 μmol·L-1CdCl2的1/10 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，待噴藥處理。水培試驗(yàn)在人工氣候室內(nèi)完成。人工氣候室條件參數(shù)為晝夜時(shí)間16 h/8 h，晝夜溫度28 ℃/20 ℃，相對(duì)濕度60%。

1.2 試驗(yàn)處理及樣品采集

水稻幼苗在96孔水培箱中培養(yǎng)，每孔種植3株水稻幼苗，每箱共計(jì)288 株。水稻幼苗鎘脅迫濃度統(tǒng)一設(shè)定為2.7 μmol·L-1。將適量DMSA溶于pH=7.4的磷酸緩沖液中，用蒸餾水稀釋至300.0 mL，分別配制成濃度為0.2、0.4 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1的DMSA 溶液，每個(gè)濃度噴施處理設(shè)定5 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)噴施288 株幼苗，5 次重復(fù)共計(jì)1 440 株幼苗，同時(shí)設(shè)置只噴施磷酸緩沖液的對(duì)照處理（CK）。待水稻幼苗轉(zhuǎn)移至水培箱并經(jīng)Cd 脅迫處理3 d 后，立即進(jìn)行第1 次DMSA 噴施處理，以后每隔3 d 噴施1 次，共噴施4 次。最后一次噴施處理3 d后采集樣品。采集的幼苗樣品用剪刀分為根、莖基及莖葉3 個(gè)部分后分別裝于信封中，于70 ℃烘箱中烘干后備用。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 鎘含量參照Gutsch 等[26]的方法測(cè)定水稻營(yíng)養(yǎng)器官中的鎘含量。將烘干后的植株樣品取出并研磨成粉。準(zhǔn)確稱取粉碎后的根部樣品0.15 g，莖基樣品0.10 g，莖葉樣品0.25 g。將稱取的樣品置于消煮管中，加入7.0 mLMOS 級(jí)的濃HNO3浸泡過(guò)夜。在電熱消解儀上于110 ℃下加熱消解2.5 h，待樣品冷卻至室溫后加入1.0 mL H2O2繼續(xù)消解1.5 h，將溫度升至170 ℃繼續(xù)消解至管內(nèi)剩余硝酸體積小于0.5 mL 后停止加熱。待溫度降至室溫后用去離子水將樣品轉(zhuǎn)移定容至25.0 mL。用原子吸收光譜儀測(cè)定樣品中鎘含量。

1.3.2 鎘化學(xué)形態(tài)

采用分步提取法測(cè)定水稻樣品中鎘的化學(xué)形態(tài)，參照Guan 等[27]的方法進(jìn)行試驗(yàn)。提取劑依次為80.0%乙醇，去離子水，1.0 mol·L-1氯化鈉，2.0%醋酸，0.6 mol·L-1鹽酸。準(zhǔn)確稱取3.0 g 新鮮的水稻幼苗樣品加入20.0 mL 提取劑于低溫下勻漿，在25 ℃下恒溫振蕩22 h 后以3 000g離心10 min，倒出上清液。再向離心管中加入同種20.0 mL 提取劑于25 ℃恒溫振蕩2 h重復(fù)提取一次，3 000g離心10 min，合并兩次上清液于聚四氟乙烯消煮管中。每一種提取液均重復(fù)上述操作，共分5 次進(jìn)行提取。提取液經(jīng)HNO3-H2O2消解后，用原子吸收光譜儀測(cè)定樣品鎘含量。將乙醇及去離子水提取組分合并在一起作為可溶性組分，其余組分作為難溶性組分。

1.3.3 鎘亞細(xì)胞分布

參照Xiao 等[28]的方法進(jìn)行鎘亞細(xì)胞分布試驗(yàn)。稱取新鮮的水稻幼苗樣品0.5 g，加入20.0 mL 經(jīng)預(yù)冷的勻漿緩沖液（0.25 mol?L-1蔗糖、50.0 mmol?L-1Tris-HCl 緩沖液和1.0 mmol?L-1二硫赤鮮糖醇），低溫下勻漿。勻漿液過(guò)80 μm 尼龍網(wǎng)后再用提取液沖洗尼龍網(wǎng)2次，收集合并濾液，殘余在尼龍網(wǎng)上的部分為細(xì)胞壁和細(xì)胞壁殘基。濾液于4 ℃下以20 000g離心45 min，上清液即為可溶性組分，沉淀為細(xì)胞器組分。參照1.3.1中的方法采用HNO3-H2O2消解，原子吸收光譜儀測(cè)定鎘含量。

1.3.4 細(xì)胞壁組分

參照Z(yǔ)hong等[29]的方法測(cè)定細(xì)胞壁組分。稱取水稻幼苗組織0.5 g，經(jīng)過(guò)液氮冷卻后研磨成粉末，用7 mL 75.0%的乙醇將粉末轉(zhuǎn)移至15.0 mL 離心管中，再在冰浴中靜置20 min。冷卻后的勻漿液于1 000g下離心10 min，沉淀依次用5.0 mL 冷凍丙酮、5.0 mL 甲醇-氯仿（1∶1）、5.0 mL 甲醇洗滌3 次。棄掉所有上清液，離心沉淀冷凍干燥過(guò)夜。經(jīng)過(guò)干燥的沉淀即為粗細(xì)胞壁組分。①果膠組分提?。合蚣?xì)胞壁粗提物中加入5.0 mL 0.5%的草酸銨緩沖液（含有0.1%NaBH4），在沸水中提取1 h，離心收集上清液；②半纖維素Ⅰ提取：將步驟①中剩余沉淀用5.0 mL 含有0.1% NaBH4的4.0% KOH 水溶液常溫提取24 h，3 000g離心，上清液中即為半纖維素Ⅰ組分，離心收集沉淀用于下一步提??；③半纖維素Ⅱ提?。簩⒉襟E②中離心獲得的沉淀繼續(xù)用5.0 mL 含有0.1%NaBH4的24.0%KOH 溶液常溫提取24 h，3 000g離心，上清液中為半纖維素Ⅱ組分；④纖維素提?。簩⒉襟E③中剩余沉淀部分凍干作為纖維素組分。提取液經(jīng)消解后用原子吸收光譜儀測(cè)定提取液中鎘含量。

1.3.5 植物螯合素（PCs）和谷胱甘肽（GSH）含量

參照周蓉等[30]的方法測(cè)定樣品中巰基化合物PCs和GSH 含量。稱取0.5 g新鮮的水稻樣品置于液氮中研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移至2.0 mL 的EP 管中，加入1.0 mL 含有0.1%三氟乙酸（TFA）和6.3 mmol?L-1DT?PA 的提取緩沖液振蕩混合均勻。于4 ℃下12 000g離心10 min，取250.0 μL 上清液分別加入650.0 μL 的HEPES 緩沖液和25.0 μL 的TCEP 溶液，混合均勻后于25 ℃下孵育5 min。再加入20.0 μL mbbr 溶液，于25 ℃避光條件下衍生化30 min。衍生化結(jié)束后向混合液中加入100.0 μL 1.0 mmol?L-1的MSA終止衍生化反應(yīng)，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后用HPLC 測(cè)定巰基化合物含量，采用外標(biāo)法定性和定量。將PCs2、PCs3、PCs4含量相加，作為總PCs含量。

1.3.6 過(guò)氧化氫（H2O2）含量

參照Tyburski 等[31]的方法，采用2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酯（DCFHA）標(biāo)記法測(cè)定水稻根系與莖葉中的H2O2含量。準(zhǔn)確稱取50.0 μmol·L-1的DCFHA于容量瓶中，加入pH為7.5的50.0 mmol·L-1磷酸緩沖液充分溶解并定容至1 000.0 mL。將水稻幼苗根系或葉片在配制好的DCFHA 樣品中浸泡2 h 后取出，經(jīng)50.0 mmol·L-1磷酸緩沖液反復(fù)沖洗3 次后在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

1.3.7 過(guò)氧化氫酶（CAT）與超氧化物歧化酶（SOD）活性

CAT 與SOD 活性均使用試劑盒測(cè)定，試劑盒購(gòu)買于索萊寶公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算處理和制圖。利用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性檢驗(yàn)。方差分析和多重比較采用單因素（ANOVA）和Dun?can 檢驗(yàn)。

轉(zhuǎn)移效率為相鄰器官之間Cd含量的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗莖葉和根部鎘含量的影響

由圖1 可見(jiàn)，噴施DMSA 后水稻莖葉鎘含量隨著DMSA噴施濃度的增加出現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)。當(dāng)DMSA噴施濃度達(dá)到0.4 mmol·L-1時(shí)，水稻幼苗莖葉中鎘含量降低27.8%，增加DMSA 噴施濃度至1.0 mmol·L-1時(shí)，水稻幼苗莖葉鎘含量繼續(xù)出現(xiàn)降低趨勢(shì)，但與噴施0.4 mmol·L-1的DMSA 處理相比未達(dá)顯著水平，表明0.4 mmol·L-1的DMSA為最佳降鎘噴施濃度。

圖1 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗莖葉鎘含量的影響Figure 1 Effects of foliar application DMSA on Cd content in rice seedling stems and leaves

水稻幼苗根系中富集的鎘濃度較高（圖2），可以達(dá)到1 200.0 mg·kg-1以上。隨著DMSA 噴施濃度增加，水稻幼苗根部鎘含量未出現(xiàn)顯著降低或升高趨勢(shì)，表明噴施DMSA 對(duì)水稻幼苗根部鎘含量無(wú)顯著影響。

圖2 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗根部鎘含量的影響Figure 2 Effects of foliar application DMSA on Cd content in rice seedling roots

2.2 噴施DMSA 對(duì)水稻幼苗莖基鎘含量和鎘轉(zhuǎn)移效率的影響

水稻幼苗莖基中富集了較高濃度的鎘（圖3），CK處理的幼苗莖基鎘含量達(dá)到275.0 mg·kg-1。隨著DMSA 噴施濃度增加，水稻幼苗莖基中鎘含量呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)。當(dāng)DMSA 噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)莖基鎘含量達(dá)到433.0 mg·kg-1，與CK 處理相比增加了57.3%。結(jié)果表明噴施DMSA 顯著增加了水稻莖基對(duì)鎘的富集能力。

圖3 噴施DMSA對(duì)幼苗莖基鎘含量的影響Figure 3 Effects of foliar application DMSA on Cd content in stem base

由圖4 可知，隨著DMSA 噴施濃度的增加，鎘由水稻幼苗根部向莖基的轉(zhuǎn)移效率出現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)。當(dāng)噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)根到莖基的轉(zhuǎn)移效率增加了45.5%。然而，鎘由水稻幼苗莖基向莖葉的轉(zhuǎn)移效率則出現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，當(dāng)噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)莖基到莖葉的轉(zhuǎn)移效率顯著降低了52.7%。以上數(shù)據(jù)表明，水稻莖基中累積了大量鎘，噴施DMSA 改變了鎘由根到莖基以及由莖基到莖葉的轉(zhuǎn)移效率，降低了鎘由莖基向莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖4 噴施DMSA對(duì)幼苗鎘轉(zhuǎn)移效率的影響Figure 4 Effects of foliar application DMSA on Cd transfer factors

2.3 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗根部和莖基鎘形態(tài)的影響

水稻幼苗根部鎘主要以難溶態(tài)鎘形式存在（圖5），其占據(jù)根部總鎘含量的75.0%以上。隨著DMSA噴施濃度的增加，各試驗(yàn)處理間根部難溶態(tài)鎘含量出現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)，而可溶態(tài)鎘含量未出現(xiàn)顯著變化。當(dāng)DMSA 噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)，根部難溶態(tài)鎘含量與CK相比顯著增加18.1%。

圖5 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗根部鎘形態(tài)的影響Figure 5 Effects of foliar application DMSA on Cd chemical form in rice seedling roots

由圖6 可見(jiàn)，水稻幼苗莖基中鎘的化學(xué)形態(tài)與根部鎘賦存形態(tài)類似，大部分以難溶態(tài)鎘形式存在。隨著DMSA 噴施濃度的增加，水稻幼苗莖基部難溶態(tài)鎘含量出現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)。當(dāng)DMSA 噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)，難溶態(tài)鎘含量與CK 相比顯著增加80.8%，但是噴施DMSA 對(duì)莖基可溶態(tài)鎘含量無(wú)顯著影響。

圖6 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗莖基鎘形態(tài)的影響Figure 6 Effects of foliar application DMSA on Cd chemical form in rice seedling stem base

2.4 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗莖基鎘亞細(xì)胞分布的影響

水稻幼苗莖基細(xì)胞壁中鎘含量最高（圖7）。噴施DMSA 后水稻幼苗莖基細(xì)胞壁中鎘含量隨著DMSA 噴施濃度的增加出現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)。噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)細(xì)胞壁中的鎘含量約是CK 組的2.1 倍。但是，噴施DMSA 對(duì)水稻莖基細(xì)胞器和可溶性組分中鎘含量無(wú)顯著影響。由以上結(jié)果可知，莖基中的鎘主要沉積在莖基細(xì)胞壁中。

圖7 噴施DMSA對(duì)水稻莖基鎘亞細(xì)胞分布的影響Figure 7 Effects of foliar application DMSA on Cd subcellular distribution in rice seedling stem base

2.5 噴施DMSA對(duì)鎘在細(xì)胞壁組分中分布的影響

由圖8 可見(jiàn)，水稻莖基細(xì)胞壁的果膠組分中鎘含量最高。隨著DMSA噴施濃度的增加，果膠、半纖維素Ⅰ、半纖維素Ⅱ組分中鎘含量均出現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)。當(dāng)DMSA噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)，果膠中鎘含量與CK處理相比顯著增加99.5%，半纖維素Ⅰ中的鎘含量顯著增加65.5%，半纖維素Ⅱ中鎘含量顯著增加31.6%，但是纖維素中鎘含量未出現(xiàn)顯著變化。

圖8 噴施DMSA對(duì)鎘在水稻幼苗莖基細(xì)胞壁組分中分布的影響Figure 8 Effects of foliar application of DMSA on Cd distribution rice stem base cell wall

2.6 噴施DMSA對(duì)莖基PCs和GSH含量的影響

隨著DMSA 噴施濃度的增加，水稻幼苗莖基中GSH含量出現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)（圖9）。當(dāng)DMSA噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)莖基中GSH含量達(dá)到CK處理的3.1倍，表明噴施DMSA顯著增加了莖基GSH的含量。

圖9 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗莖基GSH含量的影響Figure 9 Effects of foliar application DMSA on GSH content in rice seedling stem base

由圖10 可見(jiàn)，隨著DMSA 噴施濃度的增加，水稻幼苗莖基中總PCs 含量也出現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)。當(dāng)DMSA 噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)莖基中總PCs 含量達(dá)到CK 處理的2.2倍，表明噴施DMSA 顯著增加了莖基PCs的含量。

圖10 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗莖基PCs含量的影響Figure 10 Effects of foliar application DMSA on PCs content in rice seedling stem base

2.7 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗鎘脅迫的影響

由圖11可見(jiàn)，在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm 條件下，H2O2分子經(jīng)標(biāo)記后在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光。CK處理幼苗葉片發(fā)出的綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，表明此時(shí)葉片中H2O2含量最高，葉片受到的鎘脅迫強(qiáng)度最大。隨著DMSA 噴施濃度增加，H2O2熒光強(qiáng)度出現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)。當(dāng)噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)，葉片發(fā)出的綠色熒光強(qiáng)度最低，表明此時(shí)葉片在鎘脅迫下產(chǎn)生的H2O2量最少，鎘脅迫程度最低。

由圖12 可見(jiàn)，不同試驗(yàn)處理的幼苗根部都發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，水稻幼苗根部H2O2熒光強(qiáng)度未隨著DMSA 噴施濃度增加出現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，說(shuō)明噴施DMSA對(duì)根部鎘脅迫未產(chǎn)生顯著緩解作用。

圖12 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗根部鎘脅迫的影響Figure 12 Effects of foliar application DMSA on Cd stress in rice seedling roots

隨著DMSA 噴施濃度的增加，水稻幼苗莖葉中CAT 與SOD 的活性均呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)（圖13），當(dāng)DMSA 噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)，莖葉中CAT 和SOD 活性分別達(dá)到CK 處理的2.7 倍和3.0 倍，但是對(duì)水稻幼苗根部CAT 與SOD 活性未造成顯著影響。以上結(jié)果表明，噴施DMSA 緩解了鎘對(duì)水稻幼苗莖葉的脅迫，但是對(duì)水稻幼苗根部的鎘脅迫未產(chǎn)生顯著緩解作用。

圖13 噴施DMSA對(duì)水稻幼苗CAT、SOD活性的影響Figure 13 Effects of foliar application DMSA on CAT and SOD activities of rice seedlings

3 討論

3.1 水稻幼苗莖基對(duì)鎘的攔阻作用

攔阻鎘由水稻根部向莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)實(shí)現(xiàn)水稻安全生產(chǎn)、保障人體健康具有重要意義。水稻莖基部位是鎘由根向莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)的必經(jīng)之路，增加水稻莖基對(duì)鎘的攔阻作用可有效降低水稻莖葉鎘含量。Wang 等[32]的研究表明，低鎘累積水稻品種與高鎘累積水稻品種間莖基鎘含量存在顯著差異，低鎘累積水稻品種D62B莖基鎘含量是高鎘累積水稻品種Wujin4B 的1.57 倍，低鎘累積品種的莖基累積了更高濃度的鎘，降低了鎘向水稻莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)，莖基對(duì)鎘的攔阻作用是影響水稻籽粒中鎘含量的重要原因。Li 等[33]對(duì)油菜鎘轉(zhuǎn)運(yùn)的研究也表明，莖基是抑制鎘由根部向莖葉中轉(zhuǎn)運(yùn)的重要攔阻器官。上述兩篇文獻(xiàn)對(duì)莖基含硫化合物濃度變化的研究發(fā)現(xiàn)，PCs和GSH 等顯著增加對(duì)鎘具有螯合功能的巰基化合物含量，而正是由于這些含硫螯合物含量的增加導(dǎo)致大量鎘被攔阻在莖基中。PCs 和GSH是植物體內(nèi)重要的解毒物質(zhì)，它們的分子結(jié)構(gòu)中含有的活性巰基可以和多種重金屬元素如鎘、砷、鉛等形成螯合物[34]。在本研究中，噴施DMSA 顯著增加了水稻莖基鎘含量。當(dāng)DMSA 噴施濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時(shí)，莖基鎘含量與CK 處理相比顯著增加了57.3%，鎘由莖基向莖葉中的轉(zhuǎn)移效率顯著降低了52.7%。與之相應(yīng)，莖葉中鎘含量則顯著降低了27.8%。同時(shí)對(duì)莖基含巰基化合物PCs、GSH 的測(cè)定結(jié)果表明，隨著DMSA 噴施濃度增加，幼苗莖基中PCs 和GSH 的含量分別達(dá)到CK 處理的2.2 倍和3.1倍。據(jù)此推測(cè)，噴施DMSA 增加了莖基巰基化合物PCs和GSH的合成，進(jìn)而導(dǎo)致大量鎘被PCs、GSH通過(guò)螯合作用固定在莖基部位，減少了向莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)。

水稻通過(guò)改變儲(chǔ)存在營(yíng)養(yǎng)器官中鎘的化學(xué)形態(tài)從而起到自我解毒的作用[35]，一方面通過(guò)增加難溶態(tài)鎘的含量而降低活性鎘對(duì)水稻自身的脅迫作用，另一方面大量研究表明難溶態(tài)鎘一般分布于細(xì)胞壁與液泡中，因此難溶態(tài)鎘含量的增加還可能影響到鎘的亞細(xì)胞分布[29]。本研究中隨著DMSA 噴施濃度的增加，莖基難溶態(tài)鎘含量與CK 處理相比顯著增加80.8%。由此可見(jiàn)，莖基中雖然儲(chǔ)存了大量的鎘，但是大部分以難溶態(tài)形式存在，因此未對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)造成顯著影響。此外，莖基中鎘大部分以難溶態(tài)形式存在減少了儲(chǔ)存在莖基中鎘向幼苗莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)，本研究中鎘由莖基向莖葉的轉(zhuǎn)移效率與CK相比顯著降低了52.7%。

3.2 莖基細(xì)胞壁對(duì)鎘的攔阻作用

植物根部細(xì)胞壁是阻礙鎘進(jìn)入植物細(xì)胞的第一道屏障[36]。植物細(xì)胞壁主要由果膠、半纖維素、纖維素等多糖構(gòu)成。其中果膠是一種由ɑ-1，4-半乳糖醛酸聚合鏈構(gòu)成的多糖，包含大量含有陰離子的羧基基團(tuán)，因此對(duì)金屬陽(yáng)離子表現(xiàn)出高度親和性，對(duì)鎘離子具有強(qiáng)鍵合能力。在所有的細(xì)胞壁多糖中果膠是固定鎘的最主要組分，尤其是當(dāng)果膠脫甲基化以后對(duì)鎘的固持能力更加突出[37]。半纖維素包含多種功能基團(tuán)（如羧基、羥基、醛基），因此也能夠與鎘鍵合阻止鎘向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。植物細(xì)胞壁中的半纖維素和果膠在與鎘鍵合過(guò)程中發(fā)揮最重要作用。鎘脅迫通常會(huì)誘導(dǎo)植物根細(xì)胞壁中合成更多的果膠和半纖維素，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁對(duì)鎘的持留容量增加[38]。前人研究表明，細(xì)胞壁對(duì)鎘具有重要的攔截作用，而且大部分?jǐn)r截的鎘分布在果膠和半纖維素組分中。截止到目前，大部分關(guān)于細(xì)胞壁攔阻鎘的報(bào)道都集中在對(duì)水稻根系的研究方面，對(duì)莖基和莖稈報(bào)道較少。本研究中噴施DMSA 顯著增加了水稻幼苗莖基鎘含量，對(duì)幼苗根部鎘含量無(wú)顯著影響。對(duì)幼苗莖基細(xì)胞壁鎘含量的測(cè)定結(jié)果表明，細(xì)胞壁鎘含量隨著DMSA 噴施濃度升高呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)，細(xì)胞壁中鎘含量最高達(dá)到CK 處理的2.1倍。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞壁果膠組分鎘含量的測(cè)定結(jié)果表明，細(xì)胞壁中大部分鎘存在于果膠組分中，其次是半纖維素組分，而且隨著DMSA 噴施濃度增加兩組分中的鎘含量也出現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，噴施DMSA 增加了水稻幼苗莖基對(duì)鎘的攔阻作用，而且莖基中的鎘主要分布在細(xì)胞壁的果膠和半纖維素多糖組分中。

3.3 噴施DMSA對(duì)鎘脅迫的影響

重金屬脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要影響，可能導(dǎo)致農(nóng)作物植株矮小、葉片失綠等，解除鎘脅迫恢復(fù)作物正常生長(zhǎng)對(duì)提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。噴施葉面阻控劑往往在一定程度上會(huì)同時(shí)降低營(yíng)養(yǎng)器官中重金屬含量，因此大部分葉面阻控劑成分都具有一定的緩解重金屬脅迫的功能。Li 等[39]通過(guò)水培試驗(yàn)和田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉面噴施茉莉酸可以顯著降低水稻籽粒和莖葉中鎘含量，同時(shí)還可以顯著提高葉片中CAT、SOD 活性，顯著緩解水稻鎘脅迫。葉面噴施蘋果酸[21]、硅[17]、硒[20]等也可顯著降低鎘含量，緩解鎘脅迫導(dǎo)致的氧化損傷功能。重金屬脅迫引發(fā)的氧化損傷往往導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，進(jìn)而產(chǎn)生大量丙二醛（MDA），該指標(biāo)是表征植物氧化損傷程度的重要指標(biāo)之一。楊曉榮等[24]的研究表明葉面噴施DMSA 可以顯著減少葉片組織中MDA 含量。本研究中，噴施DMSA 使水稻莖葉中具有抗氧化損傷功能的CAT 和SOD 活性升高，最高分別達(dá)到CK 處理的2.7 倍和3.0倍，同時(shí)熒光標(biāo)記試驗(yàn)結(jié)果表明H2O2熒光強(qiáng)度隨著DMSA 噴施濃度升高出現(xiàn)顯著降低，說(shuō)明葉面噴施DMSA使水稻葉片受到的鎘脅迫得到有效緩解。但是本研究中水稻幼苗根部H2O2熒光強(qiáng)度隨著DMSA噴施濃度升高未出現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，同時(shí)噴施DMSA也未對(duì)根部鎘含量造成顯著影響，這些結(jié)果表明噴施DMSA對(duì)水稻幼苗根部鎘脅迫無(wú)顯著緩解作用。

4 結(jié)論

（1）噴施2，3-二巰基丁二酸通過(guò)顯著增加水稻幼苗莖基中植物螯合素和谷胱甘肽含量增加了莖基對(duì)鎘的攔阻作用，從而減少鎘向莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)，降低水稻幼苗莖葉中鎘含量。

（2）水稻幼苗莖基中持留的鎘主要被固定在細(xì)胞壁果膠組分和纖維素Ⅱ組分中。