閆 夏，尚煥章，胡佳振，羅繼芬，邵雅婷，郭 嬌，徐世才*，羅 坤*

（1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000）

荻草谷網(wǎng)蚜（Sitobion miscanthi），屬半翅目蚜科，在中國(guó)曾被誤定名為麥長(zhǎng)管蚜（Sitobion avenaeFabricius），是麥田病蟲(chóng)害的優(yōu)勢(shì)害蟲(chóng)，對(duì)麥類(lèi)作物的安全生產(chǎn)以及糧食安全帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因其具有典型的R-對(duì)策害蟲(chóng)的特點(diǎn)，這使得化學(xué)農(nóng)藥防治成為調(diào)控荻草谷網(wǎng)蚜的種群數(shù)量的主要手段［1］，為降低化學(xué)農(nóng)藥的亂施濫用，也曾出現(xiàn)一些利用生態(tài)調(diào)控［2-3］、物理防治［4-5］、抗性遺傳育種［6-7］等相關(guān)方式方法調(diào)控麥蚜的種群數(shù)量，然而它們的防治效果均不能滿足生產(chǎn)的需要［8］。小麥在長(zhǎng)期遭受麥蚜取食時(shí)，也在協(xié)同進(jìn)化的作用下進(jìn)化出了自身的防御體系，因此，應(yīng)用植物自身所具有的植物激素介導(dǎo)的防御通路是發(fā)展可持續(xù)性防控病蟲(chóng)害的新理念和新策略的重要路徑。

在眾多植物激素中以茉莉酸類(lèi)化合物（Jasmonates，JAs）和水楊酸（Salicylic acid，SA）作為信號(hào)分子誘導(dǎo)的JA防御通路以及SA防御通路在植物的抗蟲(chóng)性中發(fā)揮著重要作用［9-11］。據(jù)筆者前期的研究結(jié)果表明：麥蚜取食之后可誘導(dǎo)小麥顯著提高SA 與JAs 合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而引起植物組織累積大量植物防御激素，同時(shí)JAs 被證實(shí)會(huì)抑制SA 防御通路。而茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）屬于JAs的一種，外源施加后會(huì)引起JAs的大量積累，因此在MeJA 噴施小麥后極有可能通過(guò)JAs的積累打破宿主體內(nèi)的活性氧類(lèi)化合物（Reactive oxygen species，ROS）的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)害蟲(chóng)的取食、生理活動(dòng)及寄主選擇產(chǎn)生影響［12-13］。此外，植物激素介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)可顯著減緩宿主的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)［14］，而抗氧化酶系在“權(quán)衡”植物的生長(zhǎng)與防御之間也發(fā)揮重要作用，同時(shí)害蟲(chóng)為建立長(zhǎng)期的寄生關(guān)系，害蟲(chóng)也可以通過(guò)提高抗氧化酶的活性［15］，以清除體內(nèi)累積的ROS，進(jìn)而降低膜質(zhì)的過(guò)氧化程度。同時(shí)，生物體內(nèi)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的變化常常作為細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度的衡量指標(biāo)，而植物與昆蟲(chóng)內(nèi)保護(hù)酶活性的高低恰恰能反映出其清除自由基的能力，以及其受到攻擊的程度［16］。對(duì)于外源施加MeJA 引起JAs 的積累從而對(duì)小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜抗氧化防御酶活性的相關(guān)研究較為缺乏。

本研究通過(guò)對(duì)小麥外源噴施MeJA［17］，在不同的處理時(shí)間點(diǎn)測(cè)定小麥體內(nèi)以及取食該小麥的荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)保護(hù)酶系，包括過(guò)氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）等酶活性變化以及MDA 的含量變化，以明確JAs 的積累對(duì)麥蚜的取食、生理活動(dòng)的間接影響，為探究外源施加MeJA的綠色防治荻草谷網(wǎng)蚜提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：供試小麥品種為西農(nóng)979，將小麥種子單盆單株種植于直徑10 cm，高8.5 cm 的花盆中，（花盆中基質(zhì)與土壤體積比1∶1），小麥用防蟲(chóng)網(wǎng)保護(hù)，在條件為23 ℃±3 ℃，L：D=14∶10，相對(duì)濕度50%±5%的人工智能溫室中生長(zhǎng)，統(tǒng)一水肥。待14 d 后到達(dá)三葉期時(shí)用于試驗(yàn)。

供試蟲(chóng)源：采自陜西省楊凌區(qū)，無(wú)翅型單克隆系荻草谷網(wǎng)蚜，經(jīng)延安大學(xué)動(dòng)物生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室多代飼養(yǎng)馴化。

供試試劑：MeJA（純度為95%）、吐溫20（純度為95%）、冰乙酸（純度為99.5%）均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，生理鹽水購(gòu)自唐派醫(yī)療有限公司。

酶活測(cè)定試劑盒：蛋白定量（TP）測(cè)定試劑盒、CAT、POD、SOD、MDA酶活測(cè)定試劑盒，以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

小麥組織酶活測(cè)定：選取長(zhǎng)勢(shì)一致的三葉期西農(nóng)979 小麥噴施濃度為2.50 mmol/L 的MeJA，對(duì)照組噴施蒸餾水。并在處理后6、12、24 h 等3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)剪取葉片，稱(chēng)量后按照質(zhì)量體積比為1∶9，加入0.9%的生理鹽水，利用預(yù)冷12 h的研缽研磨成勻漿后，4 000 r/min 離心15 min，吸取上清后獲得10%組織勻漿上清，放置-80 ℃超低溫冰箱保存用于后續(xù)植物酶活測(cè)定。小麥組織各酶活的測(cè)定參考對(duì)應(yīng)酶活試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)，并對(duì)反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)略作調(diào)整。

荻草谷網(wǎng)蚜酶活測(cè)定：選取長(zhǎng)勢(shì)一致的三葉期西農(nóng)979 噴施濃度為2.50 mmol/L 的MeJA，對(duì)照組噴施蒸餾水。并在噴施后12 h接種已饑餓處理12 h的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲(chóng)（無(wú)翅型），每株小麥接種50頭成蟲(chóng)，并于接種6、12、24 h等3個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集小麥葉片上取食的蚜蟲(chóng)，液氮速凍之后保存至-80 ℃超低溫冰箱中用以后續(xù)酶活的測(cè)定。荻草谷網(wǎng)蚜10%組織均漿上清的制備及酶活測(cè)定參考對(duì)應(yīng)試劑盒。

1.3 供試器材

2X-600低速離心機(jī)（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；DZ-98-ⅡA 電熱恒溫水浴鍋（上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；TU-100 恒溫金屬水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；721N EPoch 微孔板分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-3200 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0 軟件對(duì)小麥組織以及荻草谷網(wǎng)蚜抗氧化酶等酶活數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用獨(dú)立性T 檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析（P＜ 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜SOD活性的影響

由圖1可知，在外源MeJA 噴施后小麥葉片組織中SOD活性在前12 h顯著低于對(duì)照組（CK）（P＜0.05），但在24 h 后與對(duì)照組恢復(fù)至同一水平。MeJA 處理后的小麥的SOD 水平在實(shí)驗(yàn)的24 h 內(nèi)并沒(méi)有明顯起伏，但未處理的對(duì)照組SOD 水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在試驗(yàn)開(kāi)始6 h 后，對(duì)照組小麥SOD 酶活性較處理組高12.07 U/mg，而12 h 后對(duì)照組SOD 活性開(kāi)始下降，直至24 h 對(duì)照組與處理組SOD 活性下降至同一水平，期間噴施MeJA 后的小麥SOD 活性始終保持在18 U/mg左右。

圖1 噴施MeJA對(duì)小麥及荻草谷網(wǎng)蚜SOD活性的影響

在荻草谷網(wǎng)蚜取食噴施MeJA 的小麥后對(duì)荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)SOD活性有顯著影響（P＜0.05）。在取食處理后小麥6 h 后荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)SOD 活性開(kāi)始上升，較取食未處理小麥的荻草谷網(wǎng)蚜高出9.31 U/mg；但在24 h 后對(duì)照組荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)SOD 活性持續(xù)升高至36.18 U/mg，處理組荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)SOD 活性開(kāi)始下降，并在24 h 時(shí)處理組荻草谷網(wǎng)蚜的SOD活性開(kāi)始低于對(duì)照組荻草谷網(wǎng)蚜（圖1）。

2.2 對(duì)小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜POD活性的影響

與SOD 活性變化趨勢(shì)不同，小麥對(duì)照組以及MeJA 處理組的POD 活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖2）。在前12 h 對(duì)照組與MeJA 處理組的POD 活性沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但在24 h 后MeJA 處理組的POD 活性開(kāi)始顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，MeJA處理組的POD活性始終低于對(duì)照組。

圖2 噴施MeJA對(duì)小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜POD活性的影響

荻草谷網(wǎng)蚜取食噴施MeJA 的小麥后POD 活性與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）。雖然，處理組荻草谷網(wǎng)蚜POD 活性沒(méi)有顯著變化，但研究中發(fā)現(xiàn)取食未被噴施MeJA 小麥的荻草谷網(wǎng)蚜的POD 活性，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活性較為穩(wěn)定；但取食處理組小麥的荻草谷網(wǎng)蚜在12 h 時(shí)POD 活性從6 h 時(shí)的3.21 U/mg 上升至4.21 U/mg，并且在12 h 后處理組荻草谷網(wǎng)蚜的POD 活性開(kāi)始高于對(duì)照組荻草谷網(wǎng)蚜（圖2）。

2.3 對(duì)小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜CAT活性的影響

與對(duì)照組相比，外源施加MeJA 對(duì)小麥葉片的CAT活性均無(wú)顯著差異。然而，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，隨著時(shí)間的推移無(wú)論對(duì)照組小麥還是MeJA 處理組的小麥葉片中CAT活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖3）。

圖3 噴施MeJA對(duì)小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜CAT活性的影響

由圖3 可知取食處理后小麥的荻草谷網(wǎng)蚜的CAT 活性在24 h 時(shí)顯著高于對(duì)照組荻草谷網(wǎng)蚜（P＜0.05），但在前期時(shí)外源MeJA 對(duì)荻草谷網(wǎng)蚜的CAT活性的影響并不顯著（P＞0.05）。24 h時(shí)對(duì)照組荻草谷網(wǎng)蚜CAT 活性下降，同時(shí)處理組的CAT 活性開(kāi)始上升并顯著高于對(duì)照組荻草谷網(wǎng)蚜的CAT 活性?？傮w來(lái)說(shuō)，取食噴施MeJA 小麥的荻草谷網(wǎng)蚜的CAT 活性的變化趨勢(shì)與對(duì)照組相反，對(duì)照組的CAT活性隨著時(shí)間推移先上升后下降，而處理組的CAT活性力先處于了一個(gè)較高的水平后開(kāi)始下降但一段時(shí)間后又有上升趨勢(shì)。

2.4 對(duì)小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜MDA含量的影響

MeJA 處理后的小麥葉片內(nèi)的MDA 含量并沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。在噴施MeJA 后的6 h 以及12 h 時(shí)，處理后的小麥中MDA 含量都略高于對(duì)照組，但并沒(méi)有顯著差異，并且小麥葉片中MDA 的含量水平并沒(méi)有隨著時(shí)間的推移產(chǎn)生明顯的變化（圖4）。

圖4 噴施MeJA對(duì)小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜MDA含量的影響

取食噴施MeJA 處理小麥的荻草谷網(wǎng)蚜的MDA含量與對(duì)照組荻草谷網(wǎng)蚜相比沒(méi)有顯著差異（P ＞0.05）。但是，在處理組荻草谷網(wǎng)蚜取食24 h 后開(kāi)始有升高趨勢(shì)，從6 h 和12 h 時(shí)的0.60 nmol/mg 左右的含量水平上升至0.91 nmol/mg，反觀對(duì)照組的MDA 含量隨時(shí)間變化并沒(méi)有明顯起伏，始終在0.60 nmol/mg左右（圖4）。

3 討論和結(jié)論

通常，生物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，而當(dāng)植物或者昆蟲(chóng)受到脅迫時(shí)，其體內(nèi)MDA 的含量會(huì)大幅度上升，而MDA 含量的高低也代表了其體內(nèi)細(xì)胞膜受到的攻擊程度，因此MDA的含量與保護(hù)酶活性高低緊密相關(guān)；保護(hù)酶系中的SOD 主要作用為清除超氧陰離子自由基（O2-），這個(gè)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫（H2O2），后續(xù)通過(guò)POD 或者CAT進(jìn)一步分解或利用［18］。

本研究結(jié)果表明在外源MeJA 的作用下，無(wú)論是直接作用的小麥還是取食處理后小麥的荻草谷網(wǎng)蚜其細(xì)胞膜均未受到明顯攻擊。但取食后的荻草谷網(wǎng)蚜SOD以及 CAT活性均有所升高，表明荻草谷網(wǎng)蚜在取食處理后的小麥后體內(nèi)O2-升高，使得其受到一定程度的損傷，因此可以看到在24 h 時(shí)荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)MDA 含量是有一定的升高趨勢(shì)的。而對(duì)于小麥來(lái)說(shuō)，外源MeJA 的噴施使得其SOD、POD的酶活在一定程度上下降，說(shuō)明外源MeJA 噴施降低了小麥體內(nèi)O2-的含量，使其不易受到傷害。但有研究表明POD 能將酚類(lèi)物質(zhì)氧化為醌及其聚合物，可以抑制昆蟲(chóng)取食［19］，因此MeJA 的噴施可能降低了小麥的抗蟲(chóng)性。

在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，噴施MeJA 會(huì)使得小麥內(nèi)JA 合成相關(guān)基因上調(diào)，而JA 的合成會(huì)促進(jìn)植物生成色胺（Tryptamine，TAM）［20-21］，而TAM 轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物包括5-羥色胺（serotonin）和生長(zhǎng)素（Auxin），其中5-羥色胺證實(shí)會(huì)提高植食性昆蟲(chóng)的適應(yīng)性［21-22］，而生長(zhǎng)素的主要作用是促進(jìn)植物體的生長(zhǎng)，在一定程度上會(huì)改善蚜蟲(chóng)的取食環(huán)境，但同時(shí)蚜蟲(chóng)取食又會(huì)使得SA 防御通路激活，使得防御相關(guān)病程相關(guān)蛋白基因（Pathogenesis-related protein genes1，PR-1）表達(dá)量上調(diào)［23］。相反，MeJA 噴施會(huì)使得SA 的合成關(guān)鍵基因苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL），以及病程相關(guān)基因1的非表達(dá)子（Nonexpressor of pathogenesis-related gene 1，NPR1）的表達(dá)量顯著下降，但會(huì)使得色氨酸脫羧酶（Tryptophan decarboxylase，TDC）的表達(dá)量顯著上升，這些變化極有可能進(jìn)一步降低小麥體內(nèi)的ROS 水平，使得抗氧化酶系的活性未呈現(xiàn)顯著變化（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

綜上所述，由于MeJA 的噴施引起的JAs的積累對(duì)小麥抗蚜性的影響是多方面的，且相互之間會(huì)有影響。因此外源MeJA 的噴施引起的JAs 的積累雖然會(huì)對(duì)荻草谷網(wǎng)蚜產(chǎn)生不利影響，但會(huì)因后續(xù)小麥內(nèi)自身防御系統(tǒng)的拮抗作用，而被抵消。因此，對(duì)于植物激素誘導(dǎo)的小麥抗蚜性的研究需更深層次的研究。