賈 麗，邵雅婷，羅繼分，胡佳振，郭 嬌，徐世才*，羅 坤*

（1.延安大學 生命科學學院；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術研究中心，陜西 延安 716000）

延安地處黃土高原的中南部，東傍黃河，屬溫帶半干旱區(qū)，土層深厚，日照充足，完全符合蔬菜生長的多項主要氣候指標。近幾年，延安地區(qū)設施蔬菜種植面積達22.09 萬畝，設施蔬菜產(chǎn)業(yè)已成為延安農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展和農(nóng)民持續(xù)增長的高效產(chǎn)業(yè)，在脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮了巨大作用。隨著種植面積的不斷擴大，病蟲害種群數(shù)量也隨之增加，成為設施蔬菜提質發(fā)展的一道阻礙，對設施蔬菜行業(yè)健康發(fā)展造成極大的威脅。

小菜蛾（Plutella xylostellaL.）屬鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），又名兩頭尖、吊絲蟲，是危害上海青、白菜、甘藍等十字花科蔬菜的重要害蟲［1］。該蟲年發(fā)生世代多，繁殖率高，世代間蟲口數(shù)量增長快，危害極為嚴重，主要以幼蟲形態(tài)進行危害，共計4個齡期，其中4齡幼蟲食量最大［2］，可在短時間內(nèi)將蔬菜葉片啃食干凈，所以蟲害一旦暴發(fā)，菜田會遭到大面積破壞［3］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，對于小菜蛾的防治主要依賴于殺蟲劑，但由于使用頻次多且藥物種類單一，導致小菜蛾抗藥性發(fā)生和發(fā)展速度急劇加快［4-6］。據(jù)不完全統(tǒng)計，小菜蛾大約已對50 多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性［7-8］。另外，殺蟲劑在造成農(nóng)藥殘留的同時，還會對生態(tài)環(huán)境造成污染，并將自然環(huán)境中小菜蛾的天敵殺害［9］，此外，隨著人們健康觀念的改變，使得市場對綠色無公害蔬菜的需求量逐年增加。因此，探尋綠色無公害的防治手段調控小菜蛾的群體數(shù)量，已成為新時期設施蔬菜提質發(fā)展的迫切要求。

近幾十年來，隨著遠距離電力傳輸、醫(yī)療和通信設備的高速發(fā)展，導致環(huán)境中的靜電場強度顯著增加［10］。在靜電生物學領域中最早被關注的就是高壓靜電場（High voltage electro static fields，HVEF）對種子的生物學效應［11］。已有研究表明，外加適當強度的靜電場可以改變植物應對脅迫的能力。例如前人利用高壓靜電場處理作物或蔬菜的種子，由此來改變種子內(nèi)部的抗氧化酶系的活性，從而提高種子的萌發(fā)率，加速植物的生長，增加產(chǎn)量，改變植物體內(nèi)營養(yǎng)物質的含量［12-14］。此外，前期研究結果表明：將普通小麥種子直接暴露于強度為4 kV/cm的高壓靜電場處理20 min，顯著增強了宿主的抗蚜性［15］，為了進一步研究高壓靜電場處理麥種調控麥蚜的種群數(shù)量的潛在生化基礎，對小麥葉片組織中抗氧化酶系的活性進行了深入的分析，研究表明，高壓靜電場處理主要通過提高小麥葉片的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）與過氧化物酶（Peroxidase，POD）的活性以增強宿主的抗蟲性［16-17］。這些研究結果為制定小菜蛾幼蟲的無公害防治措施提供了重要線索。本研究將上海青種子直接暴露于強度為5.0 kV/cm 的HVEF 中于不同的處理時間，研究取食HVEF 處理后的上海青對小菜蛾種群的間接效應，以此探究該物理方法在小菜蛾無公害防治中的可行性，為發(fā)展小菜蛾的綠色防控手段提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試植物及處理

本研究中使用的上海青種子由山東晟遠種業(yè)公司提供。挑選大小均勻，籽粒完整的上海青種子，將其隨機分成7組，每組100粒種子，進行3次重復，其中1組為空白對照（未用電場處理），其余放置于強度為5.0 kV/cm的高壓靜電場中進行處理，處理時間分別為5、10、15、20、40、60 min。

1.2 供試昆蟲處理

小菜蛾采自陜西省延安市寶塔區(qū)正大宏園林綠化有限公司，將蟲源帶回試驗室穩(wěn)定繁殖5 代后作為供試蟲源。蟲源飼養(yǎng)于溫度25±1 ℃，相對濕度55%±10%，光周期12 L∶12 D 的人工氣候箱內(nèi)。將HVEF 處理之后的上海青種子進行種植。待上海青成熟后采集新鮮葉片飼養(yǎng)小菜蛾同日卵孵化出的一齡幼蟲，為了保證小菜蛾的生長和發(fā)育不受食物的影響，每天更換一次新鮮菜葉。飼養(yǎng)一齡幼蟲直至全部成蟲羽化，在此過程中收集小菜蛾的4 齡幼蟲，使用液氮冷凍后放置于-80 ℃冷凍保存用于酶活測定。將羽化后的成蟲按照雌∶雄=1∶1配對后飼養(yǎng)于一次性塑料杯中，飼養(yǎng)條件同上。每隔24 h 補充10%的蜂蜜水，更換產(chǎn)卵紙并記錄成蟲產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵周期、前期及雌雄蟲存活天數(shù)，每個處理30 對成蟲。

1.3 儀器與試劑

WJ-Ⅱ高壓靜電發(fā)生器（江蘇省無錫博雅電子技術有限公司）；全波長酶標儀（Tecan，Sunrise），2X-600低速離心機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HC-2518 高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

BCA 蛋白濃度測定試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化物酶（POD）活性和丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量測定試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 抗氧化酶活性測定

粗酶液制備：將10 頭初發(fā)育為4 齡幼蟲的小菜蛾放入2 mL離心管中使用液氮速凍，然后使用電子天平準確稱取重量，按照質量體積比為1∶9 加入生理鹽水，冰水浴條件下使用研磨器進行機械勻漿，制成10%的組織勻漿，使用低速離心機2 500 r/min離心10 min，用移液槍吸取上清液轉移至新的離心管中，放入超低溫冰箱備用。

酶活性測定：總蛋白濃度、CAT、T-SOD、POD活性和MDA含量均根據(jù)試劑盒說明書進行操作，并略作調整。

1.5 數(shù)據(jù)處理

從軟件中導出的產(chǎn)卵前期（Adult preoviposition period，APOP）、產(chǎn)卵期（Oviposition period，OP）、產(chǎn)卵天數(shù)（Oviposition days，OD）、逐日產(chǎn)卵量（Daily fecundity）、每雌產(chǎn)卵量等文件后和酶活數(shù)據(jù)使用TWOSEX-MSChart 軟件進行生殖相關參數(shù)的統(tǒng)計計算。使用26.0 版SPSS 軟件的單因素方差進行方差分析，各處理的比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）法進行多重比較，各處理間的顯著性差異均設為P＜0.05水平。使用Graph Pad 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 對小菜蛾種群繁殖參數(shù)的影響

以強度為5.0 kV/cm的HVEF中處理上海青菜種，可顯著的影響小菜蛾的繁殖與發(fā)育參數(shù)。如表1所示，隨著處理時間延長，小菜蛾的產(chǎn)卵前期和產(chǎn)卵期均逐漸延長，且不同處理時間下小菜蛾產(chǎn)卵前期均顯著長于對照組。在所有不同處理時間的比較中，10、20和40 min處理下小菜蛾的產(chǎn)卵前期顯著延長（F=6.293，d.f.=6，P＜0.05），其中10 min處理下達到最大值6.26 d。不同處理時長并未顯著影響成蟲的產(chǎn)卵期（F=1.514，d.f.=6，P＜0.05），但相比對照組，處理組的產(chǎn)卵期均有所延長。在不同處理時間下產(chǎn)卵天數(shù)在短時處理下有所上升，5 min 處理下產(chǎn)卵天數(shù)甚至高于對照組，但當處理時間大于10 min后，產(chǎn)卵天數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，最低降至4.91 d，但處理組與對照組無顯著差異（F=2.038，d.f.=6，P＜0.05）。這也說明上海青種子處理時間越久，對小菜蛾生殖影響越大。主要體現(xiàn)在小菜蛾逐日產(chǎn)卵量隨時間延長而逐漸減少，在15 min處理下逐日產(chǎn)卵量達到最低值7.93粒。另外，平均產(chǎn)卵量在不同處理下均呈下降趨勢，最低達到55.43 粒/雌，其中短時處理比長時處理下降更為劇烈。

表1 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾的繁殖參數(shù)

2.2 小菜蛾體內(nèi)抗氧化酶系的活性變化

單因素方差分析結果表明，當小菜蛾取食不同時間HVEF 處理的上海青之后，體內(nèi)SOD 活性顯著高于對照組（F=60.960，d.f.=6，P＜0.05）（圖1）。并且隨著處理時間的延長，SOD 活性呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，其中60 min 處理時間下SOD 達到最大值68.768 7 U/mg。這表明HVEF 的間接作用對小菜蛾產(chǎn)生了一定的影響，因此小菜蛾體內(nèi)的超氧化物歧化酶作出應答，從而使多余的超氧陰離子歧化產(chǎn)生H2O2在體內(nèi)聚集。各處理中，10 min 處理組的響應最弱，不能及時分解多余活性氧，從而在蟲體內(nèi)積累。

圖1 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)SOD活性變化

通過單因素方差分析可知，當小菜蛾取食HVEF處理15、20 和40 min 的上海青之后，蟲體內(nèi)POD 活性顯著低于對照組（F=46.618，d.f.=6，P＜0.05），其中15 min 下降最為顯著，POD 活性為14.408 3 U/mg（圖2），這表明在這幾個處理組中小菜蛾體內(nèi)保護酶系統(tǒng)中POD 活力和平衡受到破壞，進一步使得機體內(nèi)氧自由基大量積累，同時在SOD 酶幫助下歧化的超氧陰離子產(chǎn)生的H2O2無法及時被進一步分解，導致小菜蛾的生殖受到影響，產(chǎn)卵天數(shù)減少并且每雌產(chǎn)卵量大幅度下降。多重比較結果可知，60 min 長時處理下與其他處理時間均有差異，POD 活性顯著上升，且達到最大值25.323 3 U/mg，在分解H2O2時起到重要作用。

圖2 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)POD活性變化

由圖3 可知，取食HVEF 處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)CAT活性的變化與POD 有相似的趨勢，不同的是，在15 min 處理時間下CAT 顯著上升，這也表明在此處理時間下CAT 在清除H2O2中起到重要作用。隨著處理時間增加，處理組CAT 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中20、40 和60 min 顯著下降（F=58.673，d.f.=6，P＜0.05），在60 min 處理下有POD 活性達到最低值113.547 5 U/mg，因此在上述處理時間下H2O2無法被CAT 酶分解。上述結果表明，CAT 酶也參與抗氧化系統(tǒng)調控，但與SOD 酶不同，短時處理組中CAT活性顯著高于長時處理組。

圖3 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)CAT活性變化

圖4 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)MDA含量變化

在取食不同處理時間的上海青之后小菜蛾體內(nèi)MDA 的含量不同，其中10 和20 min 處理時間下小菜蛾MDA 含量顯著高于對照組（F=19.020，d.f.=6，P＜0.05），這表明在使用這兩個處理時間下的上海青飼喂小菜蛾后機體內(nèi)有細胞損傷，對其產(chǎn)生了不利影響。在取食5和15 min處理下的上海青之后小菜蛾體內(nèi)MDA 含量與對照相比無顯著差異（P＞0.05），這主要是因為經(jīng)SOD 歧化產(chǎn)生的H2O2被CAT 和POD 正常分解了，極大程度上減少了對蟲體造成的損傷，對生殖的影響也隨之減弱。

3 討論和結論

有諸多研究表明，經(jīng)過靜電處理后，植物種子的萌發(fā)和幼苗的生長都會受到影響，并且這種影響會延續(xù)至植物幼苗中同時對昆蟲產(chǎn)生間接影響。早在20 世紀70 年代，國內(nèi)學者就已開始探索高壓靜電對種子萌發(fā)活力、生理生化變化、植株生長和抗逆能力的影響［18-19］。研究證明，高壓靜電能使黃瓜種子的發(fā)芽率，生長力得到增強［20］。高壓靜電場作用下，小麥種子抗凍害能力顯著提升，植物中營養(yǎng)物質的含量亦發(fā)生了一定的改變［21］。此外，已有研究證明靜電場處理可以促進菠菜新、陳種子的萌發(fā)及苗期生長，其中50 kV/5 cm×20 s 處理顯著提高了菠菜新種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)，同時高壓靜電也可提升陳化水稻種子活性指數(shù)，降低電導率，提升抗氧化酶活性［22］。本研究中利用高壓靜電處理上海青的種子，研究表明在適宜的處理時間下，能提升種子的發(fā)芽率，減少種子萌發(fā)的時間，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可以減少種子在土壤中被蟲害侵害的概率。

最初，進行電場生物學效應的研究主要是為探究環(huán)境電場改變能否對作物的生長乃至經(jīng)濟產(chǎn)量有促進作用，確定最佳的電場處理方式，誘發(fā)最大的生物學效應，從而開發(fā)出行之有效的農(nóng)業(yè)物理新技術［23］。隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)高壓靜電的效應不僅作用于植物自身，而且該效應還能間接作用于昆蟲。研究表明，將小麥種子直接放置于4 kV/cm 的高壓靜電場處理后對麥長管蚜的性能產(chǎn)生不利影響［15］。另外，有研究通過測定小麥及麥長管蚜體內(nèi)3 種抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）的變化，并對麥長管蚜的種群數(shù)量動態(tài)和模型進行分析，明確高壓靜電對小麥及蚜蟲的作用［16］。植物體內(nèi)抗氧化酶活性以及與抗性相關物質含量的變化改變了植物體內(nèi)原本的微環(huán)境。當昆蟲取食HVEF處理的植物后，高壓靜電作為一種脅迫因子使昆蟲體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），正常生理狀態(tài)下，機體內(nèi)ROS產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡，但當ROS積累過多時，就會引起脂質過氧化，從而對生物體造成損害，因此酶活力的變化能夠反映生物體所受環(huán)境脅迫的狀態(tài)和氧化損傷的程度［24-25］。與此同時，機體內(nèi)的氧自由基能夠攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA），引發(fā)脂質過氧化后形成脂質過氧化物，如醛基（MDA）、酮基等，這些物質會引起細胞代謝及功能障礙，甚至導致細胞死亡［26］。因此MDA 含量的變化常常作為細胞膜質過氧化程度的衡量指標，與抗氧化酶系的活性水平一起反映機體清除自由基的能力和受到脅迫的嚴重程度。本研究中在取食不同處理時間的上海青之后小菜蛾體內(nèi)MDA 的含量不同，其中10、20 min處理時間下小菜蛾MDA 含量顯著上升并且高于對照組，該結果與酶活結果保持一致，在10、20 min 處理時間下，SOD 酶響應脅迫活性顯著上升，SOD 分解超氧陰離子后產(chǎn)生的H2O2在機體內(nèi)積累，但機體內(nèi)分解H2O2的CAT和POD活性卻呈現(xiàn)下降趨勢，導致H2O2在機體內(nèi)大量積累，從而攻擊細胞膜，造成脂質過氧化，因此脂質過氧化標志物MDA 含量提升，進一步反映出蟲體受到嚴重的損傷，最終對小菜蛾幼蟲的繁殖產(chǎn)生不良影響，使小菜蛾種群得到控制。在本研究中40 min 處理時間下MDA 含量的結果是出乎意料的，在此時間下CAT和POD 活性都是下降的，無法分解機體內(nèi)積累的H2O2，導致細胞受損，因此MDA含量應該上升，但結果卻與之相反，這值得我們進一步探究機體內(nèi)其他的與ROS 分解相關的物質。

因此，利用高壓靜電場對上海青種子進行適當時間的處理，可以提高種子的萌發(fā)率，并能有效的抵抗小菜蛾，使其生長和發(fā)育受到不利影響，從而為調控小菜蛾的種群數(shù)量，制定生態(tài)防控小菜蛾的策略提供新的思路。在生產(chǎn)上減少農(nóng)藥的使用頻次，降低生產(chǎn)成本，減少3R 問題的發(fā)生，更加綠色高效地提高上海青的產(chǎn)量和品質。