◎陳曉青

（普識(shí)（廈門）檢測(cè)認(rèn)證有限公司，福建 廈門 361100）

1 丁香酚類化合物概述

丁香酚（G0H12O2）是一種植物化學(xué)物質(zhì)，存在于丁香、肉豆蔻油、肉桂、羅勒和月桂葉中。有研究表明，低濃度條件下，丁香酚類化合物具有抗菌和抗氧化雙重活性，但在高濃度條件下，卻表現(xiàn)出毒副作用[1]。如高濃度丁香酚顯示出對(duì)小鼠具有致癌和致突變作用。此外，部分研究顯示丁香酚類化合物具有肝毒性、促炎癥、皮膚刺激性等危害，但其發(fā)揮功能活性和產(chǎn)生健康危害間的劑量界限仍較為模糊[2]。因此，人們對(duì)丁香酚類化合物的功能活性、毒副作用的研究越來(lái)越多，其檢測(cè)方法也趨于多樣化。世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)（JECFA）已確定可接受的人均丁香酚日攝入量為2.5 mg·kg-1（JECPA 2006）。日本規(guī)定水產(chǎn)品可采用丁香酚類化合物作為麻醉劑，最大殘留限量為50.0 μg·kg-1。然而，目前我國(guó)尚未出臺(tái)政策規(guī)定其添加限制和檢測(cè)方法。因此，建立丁香酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法具有重要的意義。本文基于2019年我國(guó)市場(chǎng)監(jiān)管總局發(fā)布的《水產(chǎn)品及水中丁香酚類化合物的測(cè)定》（BJS 201908）公告，在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)目前丁香酚類化合物的檢測(cè)方法進(jìn)行綜合闡述，以期為丁香酚類化合物的檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)控制提供理論指導(dǎo)。

2 丁香酚類化合物檢測(cè)方法

2.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）

該方法為《水產(chǎn)品及水中丁香酚類化合物的測(cè)定》（BJS 201908）中規(guī)定的檢測(cè)方法，首先配制標(biāo)準(zhǔn)工作液：以1 mg·mL-1的丁香酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液作為母液，吸取該母液100 mL，乙腈定容至10 mL，得到濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液，利用中間液依次稀釋至1 000 ng·mL-1、500 ng·mL-1、200 ng·mL-1、100 ng·mL-1和40 ng·mL-1，即為標(biāo)準(zhǔn)工作液。水產(chǎn)品在檢測(cè)前，需進(jìn)行粉碎、乙腈提取、DMSO輔助氮吹的方法使樣品中的丁香酚類化合物得到濃縮，其中氮吹所用溫度為40 ℃。所得濃縮樣品過(guò)0.45 μm濾器待測(cè)。氣相色譜柱為DB-1701（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序?yàn)槌跏紲囟?00 ℃保持1 min，之后6 ℃/min 升溫至200 ℃,然后25 ℃·min-1升溫至260 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度設(shè)為230 ℃，以氦氣為載氣。質(zhì)譜中電離方式為電子轟擊電離源，離子源溫度230 ℃。GC-MS/MS可用于水及水產(chǎn)品，如淡水蝦、淡水魚(yú)、海水蝦、海水魚(yú)中的丁香酚類化合物（丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、順式-甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基異丁香酚）的檢測(cè)。該方法在水取樣量2 g或水產(chǎn)品取樣量5 g，均定容至1 mL時(shí)，各丁香酚類化合物的檢出限為0.01 mg·kg-1，定量限為0.02 mg·kg-1[3]。本法限制性在于氣相色譜法氣化時(shí)的高溫會(huì)影響丁香酚類化合物的穩(wěn)定性。

2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）

為克服GC-MS/MS中進(jìn)樣口高溫對(duì)檢測(cè)樣品的影響，學(xué)者們嘗試通過(guò)不需高溫的HPLC-MS/MS進(jìn)行丁香酚類化合物的檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)工作液準(zhǔn)備步驟與GCMS/MS相同，但所得最終濃度為500 ng·mL-1、200 ng·mL-1、100 ng·mL-1、50 ng·mL-1和20 ng·mL-1。樣品中丁香酚類物質(zhì)提取除GC-MS/MS中所述步驟外，該方法利用了OasisμPRiME HLB固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。在對(duì)樣品的濃縮過(guò)程中，與GC-MS/MS所述方法不同，該法經(jīng)嘗試不同濃縮條件后確定不加DMSO，在35 ℃條件下進(jìn)行氮吹，此條件下加標(biāo)樣品回收率較高。液相色譜柱采用Phenomenex Kinetex C18 柱（100 mm×3.0 mm，2.6 mm），以水（流動(dòng)相A）和甲醇（流動(dòng)相B）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0~1 min時(shí)，50%B；1~5 min時(shí)，50%~70%B；5~6 min時(shí)，70%B；6~8 min時(shí)，70%~95%B；8~11 min時(shí)，95%B；10~13 min時(shí)，50%B。流動(dòng)相流速為0.3 mL/min，柱溫控制在40 ℃，進(jìn)樣體積1μL。在該液相條件下，6種丁香酚類物質(zhì)可得到有效分離。質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源，離子源溫度設(shè)為550 ℃，霧化器流量60 L·min-1。采用以上方法對(duì)養(yǎng)殖水、蝦和鯽魚(yú)中的丁香酚類化合物進(jìn)行了不同水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)。結(jié)果顯示，丁香酚類化合物加標(biāo)回收率均在72.6%~109.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，檢出限與定量限與GC-MS/MS相同，其準(zhǔn)確度及精密度均可滿足相關(guān)分析測(cè)試要求[4]。

2.3 固相微萃取-高效液相色譜檢測(cè)法

由于水產(chǎn)品中丁香酚類化合物含量低且干擾物復(fù)雜，直接對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)較難實(shí)現(xiàn)。為避免水產(chǎn)品中基質(zhì)干擾，有必要在檢測(cè)前對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行純化分離和富集。學(xué)者們嘗試通過(guò)不同方法對(duì)樣品中的丁香酚類化合物進(jìn)行萃取、濃縮后再進(jìn)行檢測(cè)。因萃取過(guò)程即對(duì)丁香酚類化合物進(jìn)行了分類純化，故后續(xù)檢測(cè)只需采用HPLC即可進(jìn)行，不再需要質(zhì)譜檢測(cè)。有學(xué)者通過(guò)合成氟化共價(jià)有機(jī)聚合物（F-COP），再通過(guò)黏合法將F-COP涂層均勻的分布于石英棒表面，得到F-COP-SPME石英棒。在樣品經(jīng)過(guò)GC-MS/MS中的處理過(guò)程后，將3 mL溶液置于4 mL樣品瓶中，插入F-COP-SPME石英棒，室溫下萃取30 min后，采用乙腈聯(lián)合超聲方法對(duì)石英棒中的丁香酚類化合物進(jìn)行解吸，所得解吸液過(guò)0.45μm濾器后采用HPLC-UV于280 nm處進(jìn)行定量分析。該方法不需質(zhì)譜檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，但只能進(jìn)行丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚3種物質(zhì)的檢測(cè)[5]。

2.4 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法（CLEIA）

無(wú)論是GC-MS/MS或HPLC-MS/MS，儀器檢測(cè)分析方法均需要昂貴設(shè)備及專業(yè)人員，且檢測(cè)效率較低。開(kāi)發(fā)便捷、高通量的檢測(cè)方法，則更適用于大批量樣品的篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。免疫分析法因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便及可進(jìn)行高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)被用于多種化合物的檢測(cè)分析。學(xué)者將合成的丁香酚半抗原Eul-4-Tbl通過(guò)活潑酯法與BSA相聯(lián)為Eul-4-Tbl-BSA作為免疫抗原，與OVA相聯(lián)為Eul-4-Tbl-OVA形成包被抗原。采用免疫抗原Eul-4-Tbl-BSA對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行免疫，經(jīng)多次免疫后得到兔源多抗血清，硫酸銨沉淀得到Eul多克隆抗體。檢測(cè)時(shí)，只需將待測(cè)物和Eul多克隆抗體加入被包被抗原Eul-4-Tbl-OVA包被過(guò)的96孔板中于37 ℃反應(yīng)，再加入化學(xué)發(fā)光液ECL檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度即可對(duì)樣品中丁香酚類化合物進(jìn)行定量檢測(cè)。該法加標(biāo)回收率76.6%~108%，檢出限為0.11μg·L-1，可用于水產(chǎn)品中丁香酚類化合物的檢測(cè)且受其他物質(zhì)的干擾較小[6]。

2.5 超聲輔助深共晶液-液微萃取分析法（UA-DESLLME）

UA-DES-LLME分析法所需時(shí)間短、效率高且綠色環(huán)保。近年來(lái)，在多種化合物檢測(cè)中得到了迅速發(fā)展。有學(xué)者通過(guò)優(yōu)化相關(guān)條件，將此方法用于丁香酚類化合物的檢測(cè)中。以百里酚作為氫鍵受體（HBA），以乙酰丙酸為氫鍵供體（HBD），將HBA與HBD以1∶2的比例混勻后加熱1 h即得到萃取效率較高的深共晶溶液（DES）。將400 μL DES與樣品混合后，pH=3條件下，超聲3 min，5 000 rpm離心10 min，取上清100 μL加入一定體積的甲醇中，0.45μm濾器過(guò)濾后通過(guò)氣相色譜檢測(cè)樣品中丁香酚、異丁香酚和甲基異丁香醇含量。經(jīng)過(guò)與其他檢測(cè)方法，如GC-MS/MS、HPLC-MS/MS比較，UA-DES-LLME具有相似的回收率、線性范圍和RSD，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，被證明是分析水產(chǎn)品中丁香酚、異丁香酚和甲基異丁香醇更經(jīng)濟(jì)綠色的方法[7]。

3 結(jié)語(yǔ)

目前，我國(guó)尚未對(duì)丁香類化合物在水產(chǎn)品中的限量值做政策規(guī)定。文獻(xiàn)顯示，我國(guó)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中丁香酚類化合物檢出率已超10%，鑒于目前丁香酚類化合物對(duì)人體健康的危害，亟需對(duì)該類物質(zhì)使用時(shí)添加量限定值及檢測(cè)方法出臺(tái)相應(yīng)政策規(guī)定。