胡晏寧,王利君,魯炳懷△

1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院,北京 100029;2.中日友好醫(yī)院臨床微生物感染實(shí)驗(yàn)室,北京 100029;3.清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京102218

諾卡菌為革蘭陽性需氧放線菌,多個(gè)諾卡菌菌種可引起臨床患者感染[1]。臨床相關(guān)的諾卡菌感染主要是通過吸入獲得的,所以多表現(xiàn)為肺諾卡菌病。目前肺諾卡菌病的診斷仍然有挑戰(zhàn)性,這使得肺諾卡菌的真實(shí)感染率很可能被大大低估。此外,由于諾卡菌有生長(zhǎng)緩慢的特點(diǎn),加之缺乏可快速、準(zhǔn)確鑒別臨床標(biāo)本中諾卡菌的分子生物學(xué)檢測(cè)的方法,諾卡菌的微生物學(xué)診斷率較低[1-2]。諾卡菌生長(zhǎng)時(shí)間多為3～14 d,因此如果臨床醫(yī)生診斷為疑似諾卡菌病但未告知微生物實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)遺漏該種病原體。諾卡菌菌屬的分類仍在持續(xù)更新[3]?；|(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)和測(cè)序等新技術(shù)有助于諾卡菌菌種級(jí)別的鑒定。甲氧芐啶-磺胺甲噁唑(TMP-SMZ)在肺諾卡菌感染患者的治療中有至關(guān)重要的作用。如果感染較為嚴(yán)重?cái)U(kuò)散到了肺外其他組織器官,建議臨床醫(yī)生應(yīng)在藥敏試驗(yàn)結(jié)果的指導(dǎo)下進(jìn)行不同抗菌藥物的聯(lián)合治療,初始治療方案中應(yīng)包括TMP-SMZ,聯(lián)合治療方案可以選擇利奈唑胺、阿米卡星或β-內(nèi)酰胺類藥物等。目前已批準(zhǔn)的可用于需氧放線菌體外藥敏試驗(yàn)的微量肉湯稀釋法為12種抗菌藥物提供了判讀折點(diǎn)[4]。既往研究表明,大多數(shù)諾卡菌菌株對(duì)TMP-SMZ、利奈唑胺和阿米卡星的耐藥率較低,對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、阿莫西林-克拉維酸、第三代頭孢菌素、碳青霉烯類和其他藥物的耐藥藥物性特征則具有種屬特異性[5-7]。

近年來本研究團(tuán)隊(duì)持續(xù)關(guān)注諾卡菌感染的情況[8-9]。諾卡菌菌種的分布和敏感性特征可能在不同地域之間有較大差異,以及隨著時(shí)間的推移有顯著的變化[5,7,10],因此應(yīng)進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)。本回顧性研究納入了在中日友好醫(yī)院收集的106例患者分離的108株引起肺諾卡菌病的諾卡菌菌株,并分析了其菌種分布和抗菌藥物耐藥譜。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本研究收集了2019年10月至2022年11月中日友好醫(yī)院從下呼吸道感染的肺諾卡菌病標(biāo)本中檢出的108株非重復(fù)性諾卡菌臨床菌株(106例諾卡菌病患者),這些菌株未被納入以往的研究中[8-9]。本研究方案已得到中日友好醫(yī)院的倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)(2020-102-K66)。

1.2菌種鑒定 采用菌落形態(tài)、涂片鏡檢、MALDI-TOF MS和 Sanger 測(cè)序方法對(duì)諾卡菌菌種進(jìn)行鑒定[8]。同時(shí)將-80 ℃凍存的諾卡菌菌株在哥倫比亞血平皿(英國(guó)OXOID公司)上于35～37 ℃下傳代培養(yǎng)48～72 h,直至菌落生長(zhǎng)良好,形態(tài)典型。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化革蘭和(或)改良抗酸染色、菌落形態(tài)辨別及MALDI-TOF MS鑒定以確認(rèn)新鮮培養(yǎng)菌落的種屬。如果MALDI-TOF MS未能將其鑒定至種,則將使用 ABI 3730 DNA 分析儀通過 16S rRNA 基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。根據(jù)CONVILLE等[3]指定的諾卡菌種屬和種屬復(fù)合群定義諾卡菌種屬的分類。

1.3抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)生產(chǎn)商說明書,使用微量肉湯稀釋法(Sensititre Rapmyco微量稀釋板,美國(guó)賽默飛世爾科技公司)進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)量。受試藥物包括15種抗菌藥物,即TMP-SMZ、亞胺培南、利奈唑胺、阿米卡星、克拉霉素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、莫西沙星、替加環(huán)素、妥布霉素。使用星形諾卡菌ATCC19247作為質(zhì)量控制菌株。結(jié)果將根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)[4]對(duì)諾卡菌的藥敏試驗(yàn)的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋。部分抗菌藥物無耐藥折點(diǎn),不進(jìn)行敏感與耐藥率的分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用WHONET5.6軟件記錄并分析上述抗菌藥物的MIC結(jié)果,并分析MIC50和MIC90的分布情況。

2 結(jié) 果

2.1106例諾卡菌患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征和諾卡菌菌種分布 從106例肺諾卡菌病患者中共分離出108株諾卡菌菌株,入組患者的年齡在15～86歲,平均為56.4歲,其中有50.0%(53/106)的患者年齡在65～86歲,只有1.9%(2/106)的患者年齡在15～18歲。男性患者占44.3%(47/106)。此外,在108株分離株中,從痰液中檢測(cè)出諾卡菌67株(62.0%),從支氣管肺泡灌洗液(BALF)中檢測(cè)出32株(29.6%),從肺組織中檢測(cè)出6株(5.6%),從胸腔積液中檢測(cè)出3株(2.8%)。

如圖1所示,108株諾卡菌分離株鑒定出10種菌種。排名前3位的諾卡菌菌種分別是皮疽諾卡菌38株(35.2%)、蓋爾森基興諾卡菌35株(32.4%)和膿腫諾卡菌12株(11.1%)。這些最常被分離出的諾卡菌種占總株數(shù)的78.7%(85/108)。

圖1 中日友好醫(yī)院諾卡菌病患者的諾卡菌菌屬的菌種分布

2.2合并兩種諾卡菌感染患者的臨床特征 106例患者中有2例患者同時(shí)檢出兩種諾卡菌菌種。病例1:65歲男性,有20年吸煙史,患小細(xì)胞肺癌4個(gè)月,于2021年4月入住中日友好醫(yī)院。患者在接受了4個(gè)周期的化療后咳黃色膿痰。采集患者的痰標(biāo)本和BALF,痰標(biāo)本在血平板上培養(yǎng)出了蓋爾森基興諾卡菌和皮疽諾卡菌,BALF標(biāo)本僅檢出蓋爾森基興諾卡菌。病例2:72歲女性,因支氣管擴(kuò)張和肺部感染而就診。其BALF的革蘭染色和改良抗酸染色的鏡檢結(jié)果均顯示為分支狀、串珠狀桿菌。常規(guī)血平板培養(yǎng)也有銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)。痰標(biāo)本與BALF標(biāo)本通過BACTEC MGIT BD 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)均鑒定出膿腫諾卡菌和蓋爾森基興諾卡菌。為進(jìn)行比較,將這兩例諾卡菌合并感染患者與以往研究中[11-12]的兩例合并感染患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征列于表1中。

表1 4例合并兩種諾卡菌感染患者的臨床特征

2.33例肺移植患者的臨床特征 肺移植患者的臨床特征列于表2中。其中有兩例感染皮疽諾卡菌,另1例合并感染結(jié)核分枝桿菌和新諾卡菌。在本研究期間,本院肺移植受者共有303例,其諾卡菌病感染率為1.0%(3/303)。

表2 3例肺移植患者的臨床特征

2.4抗菌藥物敏感性特征 所有諾卡菌菌株均對(duì)利奈唑胺呈現(xiàn)100.0%敏感,僅有2.6%(1/38)的皮疽諾卡菌對(duì)TMP-SMZ耐藥。但60.0%(3/5)南非諾卡菌、2.7%(1/37)皮疽諾卡菌和80.0%(4/5)華萊士諾卡菌顯示對(duì)阿米卡星耐藥。108株諾卡菌對(duì)常用的磺胺類藥物替代品阿莫西林/克拉維酸和米諾環(huán)素的敏感率分別為33.9%、42.6%。本研究中的諾卡菌菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物,例如對(duì)克拉霉素的耐藥率則高達(dá)67.6%;而對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物例如碳青霉烯類藥物和第3代頭孢菌素的敏感率和耐藥率則有高度的種屬特異性。

皮疽諾卡菌作為呼吸道標(biāo)本中最常被檢測(cè)到的諾卡菌菌種,其對(duì)克拉霉素和頭孢曲松的耐藥率分別為94.7%、65.8%。但其對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率較低,對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為15.8%,對(duì)莫西沙星的耐藥率則為0.0%。見表3。

表3 下呼吸道感染主要諾卡菌菌種對(duì)15種抗菌藥物的藥敏譜及MIC值

3 討 論

諾卡菌病是一種由諾卡菌感染引起的機(jī)會(huì)性感染性疾病[1]。諾卡菌可感染免疫力低下人群,也可以感染免疫功能正常的人群,不同諾卡菌菌種感染可表現(xiàn)為不同的臨床特征[1,13]。但諾卡菌病最常累及人體的部位是肺部,通常是由呼吸道吸入諾卡菌而獲得感染[1,14]。目前關(guān)于從中國(guó)肺諾卡菌病患者中分離出的諾卡菌菌種分布及其對(duì)抗菌藥物敏感性情況的實(shí)驗(yàn)室和臨床數(shù)據(jù)較少[8,15]。

同時(shí),由于缺乏高效、便捷的診斷方法,諾卡菌臨床微生物學(xué)檢測(cè)與診斷仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。諾卡菌在常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)通常需要3～14 d,一般可在3～5 d后觀察到形態(tài)典型的菌落。諾卡菌生長(zhǎng)緩慢的特點(diǎn)使得常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法檢測(cè)效果不佳,因此諾卡菌病有很大可能會(huì)被漏診甚至誤診[2]。在諾卡菌病患者中不同細(xì)菌的混合感染是很常見的,諾卡菌可以與其他細(xì)菌或真菌同時(shí)感染宿主,而這會(huì)進(jìn)一步拉低諾卡菌的檢出率[2,11]。而在過去的十幾年中,因?yàn)槊庖咭种茽顟B(tài)人群的增加與對(duì)該菌認(rèn)識(shí)的加深,諾卡菌病病例數(shù)大幅增加[16]。

目前的研究已證實(shí)超過50種諾卡菌菌種可導(dǎo)致人類諾卡菌病[3,17]。本研究結(jié)果表明皮疽諾卡菌、蓋爾森基興諾卡菌和膿腫諾卡菌是最常分離的3種菌種,這也與之前的研究結(jié)果一致[9]。其中皮疽諾卡菌是主要的致病性菌種,可引起播散性諾卡菌病[2]。

實(shí)體器官移植受者(SOTR)由于其自身T細(xì)胞介導(dǎo)地對(duì)外來微生物的免疫應(yīng)答反應(yīng)被削弱,因此往往更易感染諾卡菌[16-17]。在SOTR中,諾卡菌感染率最高的是肺移植受者,其部分原因可能為呼吸道吸入是諾卡菌感染的主要途徑,因此與其他器官移植受者相比,肺移植受者的免疫抑制情況更嚴(yán)重。本研究所在的中日友好醫(yī)院是我國(guó)最大的肺移植中心之一,與之前的數(shù)據(jù)一致的是,肺移植受者的諾卡菌在3年內(nèi)的感染率為1.0%。相比之下,其他國(guó)家的大型回顧性研究顯示肺移植受試者中諾卡菌感染率為3.5%[18]、1.9%[19]和1.78%[20]。

在抗菌藥物治療方面,由于缺乏隨機(jī)試驗(yàn)使得最佳方案尚不明確,但應(yīng)根據(jù)所鑒定的諾卡菌菌種和藥敏結(jié)果給予最合適的抗菌藥物治療方案。既往研究觀察到抗菌藥物敏感性在一些諾卡菌菌種或復(fù)合群中具有種屬特異性[6,21]?？芍虏≈Z卡菌菌種的抗菌藥物敏感性因其固有的或獲得性的耐藥機(jī)制不同而存在很大差異[2,10]。即使無法得知抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果,諾卡菌菌種的準(zhǔn)確鑒定結(jié)果也有助于臨床決策。目前已明確 TMP-SMZ是諾卡菌病的最佳抗菌治療用藥[2,17,22],而如果患者存在磺胺類藥物過敏或耐藥的情況,也可考慮使用其他抗菌藥物[23]。在本研究中,皮疸諾卡菌仍然對(duì)TMP-SMZ(97.4%)、利奈唑胺(100.0%)和阿米卡星(97.3%)高度敏感。目前已證實(shí)利奈唑胺對(duì)諾卡菌病治療有效,且與其他一線治療藥物一樣安全,在單獨(dú)用藥或與TMP-SMZ等其他抗菌藥物聯(lián)合用藥治療播散性諾卡菌病的經(jīng)驗(yàn)治療方案中可作為首選藥物[24]。在本研究中,皮疸諾卡菌對(duì)利奈唑胺的藥物敏感性為100.0%,與之前的描述相似[6,21]。阿米卡星對(duì)大多數(shù)諾卡菌菌種表現(xiàn)出優(yōu)異的體外活性,已成功用于患有播散性諾卡菌病的老年或免疫抑制患者,但由于其對(duì)感染部位的滲透性相對(duì)較低,很少單獨(dú)應(yīng)用。本研究中僅有8株阿米卡星耐藥分離諾卡菌株(7.5%),與之前報(bào)道的結(jié)果相對(duì)一致[1,7,12]。

綜上所述,本文介紹了中日友好醫(yī)院肺部諾卡菌感染的流行病學(xué)和諾卡菌菌株的抗菌藥物敏感特征。本研究可以幫助臨床醫(yī)生了解下呼吸道感染中諾卡菌菌種分布的多樣性和抗菌藥物耐藥性特征,并有助于醫(yī)生在經(jīng)驗(yàn)性治療的背景下做出正確決策。