錢(qián)雨可,于金英,賀小如,雷秋艷,汪 冶

(1.麗水學(xué)院,浙江麗水 323000;2.浙江理工大學(xué),杭州 310000)

松樹(shù)萎蔫病(Pine wilt disease,PWD)是由松材線蟲(chóng)(Bursaphelenehusxylophilus)引起的松樹(shù)病害,松樹(shù)感染松材線蟲(chóng)之后,發(fā)病初期癥狀表現(xiàn)為松針的黃化和萎蔫[1],國(guó)內(nèi)于1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)該病[2]。在中國(guó)主要為害黑松(Pinusthunbergii)、赤松(P.densiflora)、馬尾松(P.massoniana)、海岸松(P.pinaster)、火炬松(P.taeda)、黃松(P.thunberigii×P.massoniana)等松科植物。松材線蟲(chóng)與美國(guó)白蛾、松圓蚧一同列為森林三大病蟲(chóng)害,屬國(guó)際重要檢疫對(duì)象,其中松材線蟲(chóng)被林業(yè)部列為森林病蟲(chóng)害之首。因此,尋找能夠高效殺滅松材線蟲(chóng)的生物防治措施、保護(hù)松屬植物迫在眉睫。

植物內(nèi)生菌是一類具有重要應(yīng)用價(jià)值的微生物資源,微生物活性代謝產(chǎn)物可用來(lái)研發(fā)農(nóng)藥、獸藥及醫(yī)藥。通過(guò)對(duì)微生物菌株發(fā)酵生產(chǎn)具有生物活性的代謝物,并將其用于病蟲(chóng)害的控制是目前創(chuàng)制生物農(nóng)藥的重要途徑,如來(lái)自葡萄的內(nèi)生真菌(Alternariaalternata)環(huán)肽類次生代謝產(chǎn)物對(duì)其寄主植物的病原菌(Plasmoparaviticola)有抑制作用,但對(duì)寄主植物沒(méi)有毒害作用,目前被作為潛在的生物農(nóng)藥研究開(kāi)發(fā)[3]。來(lái)自銀杏的球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)的細(xì)胞松弛素類生物堿具有抗植物病原菌作用[4-5]。中國(guó)蘊(yùn)藏豐富的生物資源,利用國(guó)內(nèi)植物內(nèi)生菌資源篩選抗蟲(chóng)(尤其是松材線蟲(chóng))活性物質(zhì),對(duì)促進(jìn)新型生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和創(chuàng)制具有十分重要的意義[6-9]。植物內(nèi)生真菌種類繁多,目前只有芽孢桿菌、阿姆斯特丹散囊菌和竹生炭角菌[10-11]等極少數(shù)內(nèi)生生防真菌用于殺松材線蟲(chóng)活性的研究,難以滿足大規(guī)模防治需求。本試驗(yàn)從八角楓科八角楓屬植物八角楓(Alangiumchinense)的莖、葉組織中分離篩選具有毒殺松材線蟲(chóng)作用的內(nèi)生真菌,并對(duì)活性高的菌株進(jìn)一步進(jìn)行形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定,為松材線蟲(chóng)生物農(nóng)藥制劑的研究和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)[12]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物樣本 2021年9月在浙江省麗水市白云山采集健康八角楓(Alangiumchinense)植物莖、葉組織。

1.1.2 供試線蟲(chóng) 松材線蟲(chóng)分離自麗水林區(qū)疫木。采用貝爾曼(Baermann)漏斗法對(duì)疫木中線蟲(chóng)進(jìn)行分離,待大多數(shù)線蟲(chóng)懷卵后同期化處理[13],接入長(zhǎng)滿灰葡萄孢菌的培養(yǎng)基,28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d后得到處于L4期線蟲(chóng),備用。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂16 g,加蒸餾水至1 000 mL,pH自然,121 ℃下滅菌20 min。

PDA液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖 20 g,加蒸餾水至1 000 mL,pH自然,121 ℃下滅菌20 min。

1.1.4 主要試劑 1%DMSO、乙酸乙酯、M9緩沖液(KH2PO43 g,Na2HPO46 g、NaCl 5 g, MgSO40.12 g,加蒸餾水至1 000 mL,121 ℃下滅菌20 min)、線蟲(chóng)裂解液(KOH 2 g,10% NaClO 10 mL,加蒸餾水至100 mL,現(xiàn)配現(xiàn)用),除乙酸乙酯為化學(xué)純外其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.5 試驗(yàn)設(shè)備 TG16G離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)、KS 4000i Control恒溫?fù)u床(IKA )、SG250H超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)、R-210旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(BUCHI)、旋渦混合器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)、生化培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、SQP電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 八角楓內(nèi)生真菌分離 將八角楓植物材料用清水洗凈,莖切成1～2 cm小段、葉切成 1 cm×1 cm小塊,用酒精(1 min)和0.1%升汞(莖30 s、葉15 s)消毒后用無(wú)菌水清洗3次,貼于PDA培養(yǎng)基表面,28 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d,分離、純化單菌落。

1.2.2 發(fā)酵液及胞外代謝產(chǎn)物制備 待純化真菌長(zhǎng)滿整個(gè)平板以后,切一小塊(1 cm ×1 cm)長(zhǎng)有菌絲的培養(yǎng)基置于PDA液體培養(yǎng)基中, 180 r·min-1、28 ℃培養(yǎng)72 h,發(fā)酵液用4層紗布過(guò)濾,取150 mL發(fā)酵液,待用。剩余發(fā)酵液加入等體積乙酸乙酯萃取胞外代謝產(chǎn)物,上層有機(jī)相經(jīng)旋蒸濃縮,溶質(zhì)用1% DMSO稀釋,待用;下層水相經(jīng)旋蒸濃縮,溶質(zhì)用無(wú)菌水稀釋,待用。將以上3部分稀釋溶液分別用針筒過(guò)濾器(孔徑 0.22 μm)過(guò)濾除菌,置4 ℃冰箱,備用。

1.2.3 樣品制備 將各菌株發(fā)酵液稀釋0、2、4、8倍,各取500 μL于24孔板中,平行3組。

各菌株有機(jī)相用1% DMSO稀釋至濃度為0.062 5 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1,1 mg·mL-1,各取500 μL于24孔板中,平行3組,為樣品組;陰性對(duì)照組用1% DMSO處理。水相用無(wú)菌水稀釋至濃度為0.062 5 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1, 1 mg·mL-1,各取500 μL于24孔板中,平行3組。

1.2.4 殺松材線蟲(chóng)內(nèi)生真菌篩選 采用浸漬法[14]測(cè)定各菌株代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲(chóng)的毒殺作用。樣品組和陰性對(duì)照組分別加入500 μL濃度為100條·mL-1的松材線蟲(chóng),于28 ℃條件下放置12 h、24 h、36 h和48 h,觀察線蟲(chóng)的存活和死亡數(shù)量,并計(jì)算死亡率與校正死亡率[15-16]。

死亡率=死蟲(chóng)數(shù)/供試蟲(chóng)數(shù)×100%

校正死亡率=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016軟件整理試驗(yàn)數(shù)據(jù),運(yùn)用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與單因素方差分析(One-way ANOVA),運(yùn)用MEGA-X軟件進(jìn)行ITS序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角楓內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)特征

從八角楓莖、葉組織中共分離得到11株內(nèi)生真菌,編號(hào):BZ-1～BZ-11,其中菌株BZ-8具有較好的殺線蟲(chóng)活性,其菌落形態(tài)特征如圖1。

菌株BZ-8:菌落圓形,正面深褐色,孢子顆粒狀,背面白至淡黃色。發(fā)酵液菌絲體球形,表面輻射狀。

2.2 八角楓內(nèi)生真菌發(fā)酵液的殺線蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果

由表1可知,八角楓內(nèi)生真菌BZ-8發(fā)酵液具有明顯的殺松材線蟲(chóng)活性,且經(jīng)過(guò)稀釋后其活性仍穩(wěn)定在80%以上。為確定菌株BZ-8發(fā)酵液中活性成分性質(zhì),分別對(duì)有機(jī)相和水相的殺蟲(chóng)活性作進(jìn)一步測(cè)定與分析。

表1 BZ-8發(fā)酵液殺松材線蟲(chóng)毒力測(cè)定Table 1 Nematicidal activity of fermentation broth from BZ-8 against PWN

由圖2可知,菌株BZ-8發(fā)酵液有機(jī)相對(duì)松材線蟲(chóng)具有顯著毒殺作用,濃度為0.25 mg·mL-1樣品經(jīng)12 h處理后,平均校正死亡率達(dá)32.28%;濃度為0.5mg·mL-1樣品經(jīng)12 h處理后其平均校正死亡率達(dá)77.63%;濃度為1.0 mg·mL-1樣品經(jīng)48 h處理后其平均校正死亡率達(dá) 99.15%,具極顯著殺蟲(chóng)活性。有機(jī)相經(jīng)24 h和48 h處理后的IC50值分別為0.29 mg·mL-1、0.21 mg·mL-1(表2)。

表2 BZ-8胞外發(fā)酵產(chǎn)物(有機(jī)相)殺松材線蟲(chóng)毒力測(cè)定Table 2 Nematicidal activity of extracellular fermentation products (oganic phase) from BZ-8 against PWN

圖中每個(gè)時(shí)間處理下小寫(xiě)英文字母不同者表示經(jīng)Duncan’s法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)

由圖3可知,菌株BZ-8水相濃度為0.5 mg·mL-1時(shí),經(jīng)12 h處理后其殺線蟲(chóng)活性即可達(dá)到95%以上,平均線蟲(chóng)死亡率為98.92%;濃度為0.062 5 mg·mL-1的水相經(jīng)12 h處理后其殺蟲(chóng)率達(dá)到60%以上,經(jīng)48 h處理后平均線蟲(chóng)死亡率也可達(dá)86.34%。由此可見(jiàn)菌株BZ-8發(fā)酵液水相在低濃度下仍可保持其良好的殺蟲(chóng)活性,且經(jīng)24 h和48 h處理后的IC50值分別為0.04 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1(表3),優(yōu)于有機(jī)相的殺蟲(chóng)活性。

表3 BZ-8胞外發(fā)酵產(chǎn)物(水相)殺松材線蟲(chóng)毒力測(cè)定Table 3 Nematicidal activity of extracellular fermentation products (aqueous phase) from BZ-8 against PWN

圖中每個(gè)時(shí)間處理下小寫(xiě)英文字母不同者表示經(jīng)Duncan’s法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)

2.3 內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定

ITS1引物序列:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′;ITS4引物序列:5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′。PCR體系(50 μL):2×TaqMaster Mix 25 μL,ITS1引物和ITS4引物各 1 μL,gDNA 1 μL,ddH2O 22 μL。

反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性95 ℃ 15 s,退火50 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 40 s,循環(huán)40次。PCR產(chǎn)物送去上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

2.3.1 ITS序列結(jié)果 以TS1和TS4為引物對(duì)菌株BZ-8的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn) 圖4,擴(kuò)增產(chǎn)物片段約500 bp[17]。

圖4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.4 PAGE gels of PCR products

2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 為確定菌株BZ-8的種類,下載了更多相關(guān)序列以進(jìn)一步確定其種屬關(guān)系。圖5表明,菌株BZ8與日本曲霉Aspergillusjaponicus關(guān)系非常緊密,各自聚于同一分支[18],自展支持率為97%,結(jié)合其性狀特征,鑒定菌株BZ-8為日本曲霉Aspergillusjaponicas。

圖5 菌株BZ-8系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strain BZ-8

3 討 論

八角楓(A.chinense)作為民族用藥含有酚苷、蒽醌及其苷類、生物堿類等有效成分[19],具有抗菌、抗炎、肌松、心血管系統(tǒng)等生理活性,可用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛、心力衰竭、跌打損傷等病癥[20],是目前風(fēng)濕定片、風(fēng)濕定膠囊、金骨蓮膠囊等制劑的主藥[21]。另外,八角楓也是一種有毒植物[22],八角楓生物堿可阻斷神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的傳導(dǎo),引起平滑肌松弛,具有呼吸抑制、呼吸肌麻痹和中樞抑制作用[23]。一些八角楓屬植物具有殺蟲(chóng)作用[24]。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)八角楓枝葉內(nèi)生真菌的分離純化,得到11株內(nèi)生真菌,其中一株內(nèi)生菌(BZ-8)胞外發(fā)酵產(chǎn)物具有良好殺線蟲(chóng)活性,通過(guò)分子生物學(xué)鑒定為日本曲霉Aspergillusjaponicus。A.japonicus發(fā)酵液有機(jī)相經(jīng)24 h處理后,其IC50為0.29 mg·mL-1,殺蟲(chóng)活性優(yōu)于甲維鹽而次于阿維菌素;A.japonicus發(fā)酵液水相經(jīng) 24 h處理后其IC50為0.04 mg·mL-1,說(shuō)明其殺蟲(chóng)活性成分存在于水相中,為水溶性物質(zhì),且活性明顯優(yōu)于阿維菌素[25]。

何瓊等[26]研究發(fā)現(xiàn),日本曲霉(A.japonicus)發(fā)酵液經(jīng)24 h處理后對(duì)2齡南方根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的校正死亡率達(dá)到100%,且具有優(yōu)良穩(wěn)定性。吳海燕[27]發(fā)現(xiàn)A.japonicus發(fā)酵濾液5倍稀釋液的殺線蟲(chóng)率可于6 h內(nèi)達(dá)到100%,且近50%的線蟲(chóng)蟲(chóng)體被降解,8 h近90%的線蟲(chóng)被降解。證實(shí)該菌株次生代謝產(chǎn)物具有明顯的殺線蟲(chóng)活性,可用于線蟲(chóng)的生物防治,具有作為一種新型殺線劑的開(kāi)發(fā)潛力。

本試驗(yàn)針對(duì)八角楓內(nèi)生真菌日本曲霉A.japonicus的胞外發(fā)酵液毒殺松材線蟲(chóng)作用進(jìn)行初步研究,還需要對(duì)胞外發(fā)酵液的有機(jī)相和水相殺蟲(chóng)活性部位進(jìn)一步分離純化,以發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物。并對(duì)殺蟲(chóng)活性成分的毒殺松材線蟲(chóng)的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。