俞才蘭,李文亮,張 潔,宋麗雯

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)

截形葉螨(Tetranychustruncatus)屬蛛形綱(Arachnida)葉螨科(Tetranychidae)。其在甘肅河西地區(qū)主要為害玉米,由于該地區(qū)晝夜溫差大,氣候干旱,玉米種植面積大,導(dǎo)致該地區(qū)截形葉螨增長(zhǎng)迅速,已成為玉米害螨的優(yōu)勢(shì)種,對(duì)雜交制種試驗(yàn)田中玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1-2]。葉螨主要集聚于葉片的背部通過(guò)吮吸汁液對(duì)作物產(chǎn)生為害,初期葉片上會(huì)出現(xiàn)小白斑,為害后期會(huì)使寄主植株枯萎甚至死亡[3-4]。

溫度是影響昆蟲(chóng)生存、生長(zhǎng)、繁殖、發(fā)育和傳播的重要因素之一[5-6]。高溫會(huì)加快昆蟲(chóng)個(gè)體發(fā)育,縮短世代歷期,降低昆蟲(chóng)繁殖力[7]。此外,高溫也會(huì)改變昆蟲(chóng)種群動(dòng)態(tài),降低物種豐富度以及昆蟲(chóng)的存活率,可以通過(guò)向高緯度地區(qū)遷移擴(kuò)張來(lái)應(yīng)對(duì)溫度的變化[8]。高溫直接或間接影響昆蟲(chóng)的所有生理過(guò)程,通過(guò)調(diào)整自身的免疫調(diào)節(jié)途徑或一些酶類來(lái)應(yīng)對(duì)逆境脅迫,包括熱激蛋白的上調(diào)表達(dá)以及過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase,GST)等抗氧化酶含量的變化[8-11]。目前,在全球氣候變暖的大背景下,極端高溫天氣出現(xiàn)的頻率顯著增加。因此,昆蟲(chóng)對(duì)高溫的耐受性及其機(jī)理已經(jīng)成為近年來(lái)昆蟲(chóng)學(xué)研究領(lǐng)域中深受重視的問(wèn)題。

目前,關(guān)于溫度對(duì)于截形葉螨影響的研究大多集中在生態(tài)學(xué)和生理生化方面,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室前期研究也證明高溫脅迫對(duì)葉螨的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖造成了一定的影響,并且引起了體內(nèi)蛋白、保護(hù)酶等含量的變化[12-14]。且由于截形葉螨目前尚未公布基因組圖譜。因此,本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法,分析截形葉螨雌成螨應(yīng)對(duì)熱脅迫的差異表達(dá)基因主要功能類群及相關(guān)代謝通路,挖掘潛在的與截形葉螨熱脅迫相關(guān)基因,可為后續(xù)截形葉螨熱脅迫相關(guān)基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試葉螨

截形葉螨(Tt-S):采集于未施任何農(nóng)藥的玉米田,在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室室溫條件下采用雌(體橢圓形,紅色,體軀兩側(cè)有兩對(duì)黑斑,腹部末端呈鈍角)雄(體類似棱形,比雌螨小,淡紅色,腹部末端呈銳角)單系(一雌一雄在飼養(yǎng)臺(tái)上飼養(yǎng))飼養(yǎng)擴(kuò)繁,飼養(yǎng)擴(kuò)繁2個(gè)月后,將葉螨轉(zhuǎn)移至已提前種好的豇豆幼苗上飼養(yǎng)80代以上,飼養(yǎng)期間葉螨不接觸任何藥劑,以保證其具有較高敏感性。

1.2 供試試劑和儀器

試劑:Trizol,美國(guó)Invitrogen公司;NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒,近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司。

儀器:普通T100TMPCR儀,美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad)公司;ABI Q5熒光定量PCR儀,美國(guó)Applied Bio systems(ABI)公司;NanoPhotometer-N50微量分光光度計(jì),德國(guó)Implen公司;B-60S制冰機(jī),太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 葉螨處理

挑取2～3日齡截形葉螨雌成螨200頭于飼養(yǎng)臺(tái),置于40 ℃下處理1 h,記做Tt-MH-S,將處理后存活的葉螨收集到無(wú)酶(RNase)離心管,對(duì)照為25 ℃下飼養(yǎng)的截形葉螨雌成螨(Tt-S),每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù),共計(jì)8個(gè)樣品。將收集好的樣品用液氮冷凍后在―80 ℃的冰箱中保存。

1.4 Illumina測(cè)序與分析

1.4.1 cDNA文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序 將“1.3”收集到的樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司(廣州)進(jìn)行測(cè)序,cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序由該公司完成,測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq 4000。

1.4.2 差異表達(dá)基因功能分析和通路富集分析 由Illumina平臺(tái)測(cè)序得到原始圖像數(shù)據(jù),經(jīng)過(guò)堿基識(shí)別(base calling)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(raw data),對(duì)下機(jī)得到的raw data利用fastp軟件進(jìn)行質(zhì)控,過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù),獲得高質(zhì)量過(guò)濾數(shù)據(jù)(clean data)。再與前期已測(cè)得的截形葉螨三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(由卵和各螨態(tài)雌、雄螨組成的混合樣品經(jīng)測(cè)序平臺(tái)Pacbio測(cè)序技術(shù)得到)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的校正,并對(duì)其進(jìn)行FPKM(基因轉(zhuǎn)錄的每千堿基片段數(shù)/百萬(wàn)片段測(cè)序)轉(zhuǎn)換。使用DESeq2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,獲得高溫處理截形葉螨雌成螨的差異表達(dá)基因集。基于差異分析結(jié)果,篩選FDR(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)<0.05且差異倍數(shù) |log2FC|>2的基因?yàn)轱@著差異基因(DEGs),并對(duì)差異基因集進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。

1.5 RT-qPCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果

1.5.1 cDNA的合成 用Trizol法提取總RNA,每個(gè)樣品雌成螨約150頭,具體方法參照文獻(xiàn)[15]。取少量RNA在超微量分光光度儀進(jìn)行濃度測(cè)定后,根據(jù)寶生物PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA合成第一鏈cDNA,在-20 ℃下保存。

1.5.2 候選基因的引物設(shè)計(jì) 為檢驗(yàn)測(cè)序結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)選取21個(gè)差異基因進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證。根據(jù)篩選出基因的序列,利用Primer 6設(shè)計(jì)出相應(yīng)的定量引物。內(nèi)參基因選用RPS18[16]和Actin[17]。引物序列設(shè)計(jì)如表1所示,合成由廣州擎科生物技術(shù)有限公司完成。

表1 截形葉螨qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR for Tetranychus truncatus

1.5.3 RT-qPCR反應(yīng) 采用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒在ABI Q5熒光定量PCR儀中進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。具體反應(yīng)體系與程序參照文獻(xiàn)[15]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT方法進(jìn)行計(jì)算和分析[18]。采用Origin 2018軟件和SPSS 23軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量測(cè)序評(píng)估

截形葉螨雌成螨在熱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)如表2所示,共得到高質(zhì)量過(guò)濾堿基(Clean bases)約為52.94 Gb,其中各樣本的高質(zhì)量過(guò)濾堿基(Clean bases)均超過(guò)6.86 Gb。過(guò)濾后各樣本讀數(shù)(reads)占比均超過(guò)各自原始reads的99%;序列的質(zhì)量參數(shù)Q20(質(zhì)量值達(dá)到20的堿基所占百分比)百分比大于97%,Q30(質(zhì)量值達(dá)到30的堿基所占百分比)百分比大于92%,過(guò)濾后的堿基GC含量(堿基G和C的總和占總堿基數(shù)的百分比)大于38%。全部可以比對(duì)到參考基因上的讀數(shù)占有效reads的百分比均超過(guò)93%。說(shuō)明此次測(cè)序組裝結(jié)果比較可靠,可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估Table 2 Quality evaluation of transcriptome sequencing

2.2 差異表達(dá)基因分析

2.2.1 截形葉螨熱脅迫下的差異表達(dá)基因 對(duì)高溫和室溫處理下截形葉螨雌成螨的DEGs進(jìn)行火山圖分析(圖1)。發(fā)現(xiàn)相比對(duì)照,截形葉螨雌成螨高溫脅迫后,共有17 577個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化,其中12 831個(gè)基因表現(xiàn)為上調(diào), 4 746個(gè)基因表現(xiàn)為下調(diào)。

紅色表示高溫脅迫上調(diào)表達(dá)的差異基因;藍(lán)色表示高溫脅迫下調(diào)表達(dá)的差異基因(判斷標(biāo)準(zhǔn)為 FDR<0.05, 且差異倍數(shù)兩倍以上),綠色表示沒(méi)有差異

2.2.2 差異表達(dá)基因的GO功能分析 截形葉螨雌成螨經(jīng)熱脅迫后DEGs的GO富集分析如圖2所示,這些差異表達(dá)基因主要被注釋到生物學(xué)過(guò)程(Biological process)、細(xì)胞成分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)3個(gè)類別的56個(gè)GO terms中,其中參與分子功能的7 481個(gè)差異基因注釋到12個(gè)terms中,主要在催化活性(Catalytic activity)以及結(jié)合(Binding)等功能顯著富集;參與細(xì)胞組分的6 017個(gè)差異基因注釋到20個(gè)terms中,顯著富集在細(xì)胞(Cell)、細(xì)胞組分(Cell part)和細(xì)胞器(Organelle)中;參與生物學(xué)過(guò)程的8 174個(gè)差異基因注釋到24個(gè)terms中。主要參與細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)、單一生物過(guò)程(Single-organism process)、代謝過(guò)程(Metabolic process)、生物調(diào)節(jié)(Biological regulation)和發(fā)育過(guò)程(Developmental process)等生物學(xué)過(guò)程。

1.細(xì)胞過(guò)程;2.單一生物過(guò)程;3.代謝過(guò)程;4.生物調(diào)節(jié);5.發(fā)育過(guò)程;6.生物過(guò)程調(diào)控;7多細(xì)胞有機(jī)過(guò)程;8.細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生;9刺激響應(yīng);10.細(xì)胞內(nèi)定位;11.信號(hào);12.繁殖;13.繁殖過(guò)程;14.多有機(jī)體過(guò)程;15.生物過(guò)程的負(fù)調(diào)控;16.運(yùn)動(dòng);17.生物過(guò)程調(diào)控;18.習(xí)性;19.生長(zhǎng);20.生物附著;21.免疫系統(tǒng)過(guò)程;22.節(jié)律過(guò)程;23.參與突觸傳遞的突觸前過(guò)程;24.生物階段;25.細(xì)胞;26.細(xì)胞組分;27.細(xì)胞器;28.大分子配合物;29.膜;30.細(xì)胞器組分;31.膜組分;32.膜封閉腔;33.細(xì)胞結(jié)合;34.胞外區(qū)域;35.胞外區(qū)域組分;36.突觸;37.突觸組分;38.超分子纖維;39.病毒體;40.病毒組分;41.細(xì)胞外基質(zhì);42.其他有機(jī)體;43.其他有機(jī)體組分;44.細(xì)胞外基質(zhì)成分;45.催化活性;46.結(jié)合;47.轉(zhuǎn)運(yùn)活性;48.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性;49.信號(hào)傳感器活動(dòng);50.分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性;51.分子功能調(diào)節(jié)劑;52.結(jié)構(gòu)分子活性;53.轉(zhuǎn)錄因子活性,蛋白質(zhì)結(jié)合;54.抗氧化活性;55.翻譯調(diào)節(jié)活性;56.電子載體活性。橫坐標(biāo)為二級(jí)GO term,縱坐標(biāo)為該term里的基因數(shù)量,紅色表示上調(diào),綠色表示下調(diào)

2.2.3 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集 對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG分析,發(fā)現(xiàn)共有5 882個(gè)DEGs被注釋到144條通路,圖3為富集顯著的前20條通路,差異表達(dá)基因在代謝途徑(Metabolic pathways,2 146條基因)、溶酶體(Lysosome,598條基因)、碳代謝(Carbon metabolism,335條基因)、脂肪酸代謝(Fatty acid metabolism,257條基因)、氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids 207條基因)和氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,204條基因)等6條通路顯著富集。

縱坐標(biāo)表示差異顯著前20通路;橫坐標(biāo)為富集因子(該通路中差異基因除以所有數(shù)量);大小表示數(shù)量多少,顏色越紅Q值越小

2.2.4 RT-qPCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果 本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中13條上調(diào)表達(dá)的基因和8條下調(diào)表達(dá)的基因(圖4)進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,結(jié)果表明,12條基因上調(diào)表達(dá),5條基因下調(diào)表達(dá)(圖5)。即截形葉螨雌成螨熱脅迫后有17條基因的RT-qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。

圖4 截形葉螨差異基因在RNA-Seq中的表達(dá)量Fig.4 Relative expression of T.truncatus in RNA-Seq

*表示基因差異顯著(P<0.05);**表示基因差異極顯著(P<0.01)

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)熱脅迫下的截形葉螨雌成螨進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和差異表達(dá)基因分析,GO功能富集發(fā)現(xiàn)這些DEGs主要在細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)、單生物過(guò)程(Single-organism process)、代謝過(guò)程(Metabolic process)催化活性(Catalytic activity)和細(xì)胞(Cell)中富集,這些富集注釋主要與細(xì)胞分化(cell differentiation)、生殖發(fā)育(Reproductive development)、細(xì)胞組成(Cell composition)、蛋白質(zhì)的分泌和攝入(Protein secretion and intake)以及酶的合成和代謝(Synthesis and metabolism of enzymes)等有關(guān)。因此推測(cè)葉螨可能通過(guò)能量代謝及其代謝產(chǎn)物來(lái)應(yīng)對(duì)溫度脅迫。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)昆蟲(chóng)受到熱應(yīng)激時(shí),大多數(shù)蛋白質(zhì)的合成會(huì)減少。KEGG分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要富集在代謝途徑(Metabolic pathways)和溶酶體(Lysosome)等通路。Vatanparast等[20]對(duì)高溫脅迫秋粘蟲(chóng)后差異基因的研究發(fā)現(xiàn),秋粘蟲(chóng)的DEGs通常在與能量代謝相關(guān)的途徑中積累,且許多代謝過(guò)程基因的轉(zhuǎn)錄在高溫環(huán)境下受到抑制。Ran等[21]發(fā)現(xiàn)氨基酸合成代謝上調(diào),產(chǎn)生大量氨基酸,為耐熱蛋白的合成提供原料。本研究結(jié)果也表明高溫脅迫下DEGs在葉螨各種能量代謝的途徑中富集,其體內(nèi)脂肪酸代謝合成途徑的表達(dá)響應(yīng)高溫而上調(diào)。

有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶是保護(hù)昆蟲(chóng)免受高溫脅迫的一類重要酶系。如程杰[5]研究發(fā)現(xiàn)高溫會(huì)引起昆蟲(chóng)的氧化應(yīng)激反應(yīng),昆蟲(chóng)會(huì)產(chǎn)生CAT、SOD和POD等抗氧化酶來(lái)消除活性氧的影響。崔娟等[22]研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶在昆蟲(chóng)抵御高溫脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,篩豆龜蝽(Megacoptacribraria)成蟲(chóng)可有效抵御熱脅迫誘導(dǎo)的活性氧,進(jìn)而表現(xiàn)出對(duì)高溫較強(qiáng)的適應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)截形葉螨雌成螨在熱脅迫后,體內(nèi)抗氧化酶基因均顯著上調(diào)表達(dá),推測(cè)抗氧化酶基因在截形葉螨應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)發(fā)揮著重要的作用。

此外,熱激蛋白作為一類分子伴侶,也是昆蟲(chóng)響應(yīng)高溫脅迫的重要組成部分。朱宇等[8]發(fā)現(xiàn)二化螟(Chilosuppressalis)熱激蛋白Hsp70、熱激蛋白Hsp90和小分子熱激蛋白能夠提高二化螟幼蟲(chóng)對(duì)高溫的適應(yīng)性。宋杰[9]研究結(jié)果顯示,在42 ℃持續(xù)高溫脅迫下,二化螟熱休克轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào),以抵消高溫對(duì)自身造成的影響。楊麗紅[23]研究發(fā)現(xiàn)柑橘全爪螨(Panonychuscitri)的PcHsp90和PcHsp70基因在抵御高溫脅迫方面發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示,截形葉螨雌成螨熱脅迫后,熱激蛋白基因的表達(dá)量發(fā)生了變化,推測(cè)熱激蛋白可能在截形葉螨雌成螨應(yīng)對(duì)熱脅迫時(shí)也發(fā)揮了作用。

綜上所述,截形葉螨雌成螨可能從能量代謝、抗氧化防御、分子伴侶等多方面應(yīng)對(duì)高溫脅迫,因此,后期可采用RT-qPCR和RNA干擾相結(jié)合的方法篩選對(duì)熱脅迫相關(guān)重要基因進(jìn)行功能分析和驗(yàn)證,為揭示截形葉螨耐熱機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。