李昕冉,景 濤,孫晨曦,郭彩蘋,馬耀杰,徐秉良,張樹武

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室,蘭州 730070)

立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)不僅作為危害黃瓜(Cucumissativus)的重要病原菌之一,還可危害水稻(Oryzasativa)[1]、玉米(Zeamays)[2]、棉花(Gossypiumspp.)[3]和辣椒(Capsicumannuum)[4]等,并且具有侵染力強,侵染后發(fā)病周期短、蔓延快和毀滅性強等特點,危害嚴(yán)重時可造成作物田幼苗成片死亡,嚴(yán)重減產(chǎn)和降低品質(zhì)[5]。目前,黃瓜立枯病的防治主要通過使用殺菌劑進行育苗土處理和種子消毒,但是長期大量施用殺菌劑,不僅導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性,而且導(dǎo)致藥劑殘留,造成污染環(huán)境和惡化土壤等弊端[6]。因此,鑒于化學(xué)農(nóng)藥防治的局限性和蔬菜綠色生產(chǎn)的要求,生物防治已成為國內(nèi)外植物病害防治的熱點之一。

木霉(Trichodermaspp.)是一類對多種植物病原菌具有較好拮抗作用的生防真菌,可作為農(nóng)作物病害生物防治的重要組分,具有重要研究價值和廣闊應(yīng)用前景[7]。前期研究發(fā)現(xiàn),木霉的生防機制主要有競爭作用、寄生作用、抗生作用和誘導(dǎo)植物抗性等[8],并具有促進植物營養(yǎng)吸收、生長、根系發(fā)育,降低病害發(fā)生等特點[9]。王子晴等[10]研究發(fā)現(xiàn)多種木霉對細(xì)辛核盤菌(Sclerotiniaasari)的抑菌率均大于90%。王天君[11]研究發(fā)現(xiàn)多種木霉與立枯絲核菌對峙試驗中拮抗指數(shù)可達1級。尤佳琪等[12]研究發(fā)現(xiàn)擬康寧木霉(T.koningiopsis)發(fā)酵液對灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的生長抑制活性達52.1%。此外,申君等[13]研究發(fā)現(xiàn)木霉對番茄(Lycopersiconesculentum)、茄子(Solanummelongena)、辣椒(Capsicumannuum)、白菜(Brassicapekinensis)等蔬菜病害的病原菌均具有抑制作用。

本試驗以具有自主知識產(chǎn)權(quán)的長枝木霉(T.longibrachiatum)菌株T6為供試菌株,通過對峙培養(yǎng)法、含藥培養(yǎng)基法和顯微觀察法,測定長枝木霉菌株T6及其代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制活性及其作用機制進行初步研究,旨在為高效微生物型殺菌劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 長枝木霉(T.longibrachiatum)菌株T6和立枯絲核菌(R.solani)均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理學(xué)實驗室分離 保存。

1.1.2 代謝產(chǎn)物 長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理學(xué)實驗室分離保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 長枝木霉菌株T6活化及其分生孢子懸浮液制備 將4 ℃低溫保存的長枝木霉菌株T6接種于固體PDA培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng),培養(yǎng) 6 d后加入5 mL無菌水和50 μL Tween-80于布滿大量分生孢子的菌落表面,充分洗脫和混勻后轉(zhuǎn)入無菌離心管,獲得其分生孢子懸浮液原液。使用血球計數(shù)板測定原液濃度并利用無菌水稀釋至1.0×107cfu·mL-1,保存至4 ℃,備用。

1.2.2 長枝木霉菌株T6發(fā)酵液制備 參考王子晴等[10]的方法,將制備好的長枝木霉菌株T6分生孢子懸浮液(1.0×107cfu·mL-1)接種于裝有60 mL發(fā)酵液培養(yǎng)基(甘露醇40 g,蛋白胨 1 g,水1 L)的三角瓶(150 mL)中,并置于160 r·min-1搖床(ZQLY-180N,上海知楚儀器有限公司)中搖培5 d。利用無菌濾紙濾除菌絲,置于低溫離心機(NP-N1-16KR,寧波北角生物科技有限公司)4 ℃下離心20 min,棄去沉淀并吸取上清液經(jīng)無菌微孔濾膜(直徑0.22 μm,北京索萊寶科技有限公司)過濾,即獲得發(fā)酵液原液,于4 ℃保存,備用。

1.2.3 抑菌活性測定及重寄生作用觀察 采用對峙培養(yǎng)法和生長速率法測定長枝木霉菌株T6對立枯絲核菌的生長抑制活性。利用滅菌的打孔器(d=0.5 cm)制備長枝木霉菌株T6和立枯絲核菌的菌餅,并分別將其菌餅正面朝下對峙接種于制備好的PDA平板,立枯絲核菌按照同樣方法接種于PDA平板中央作為對照。接種培養(yǎng)皿置于25 ℃和16 h光照人工氣候箱(HQH-H300,上海躍進醫(yī)療器械有限公司)中培養(yǎng),每天觀察并記錄長枝木霉菌株T6和立枯絲核菌的對峙生長,于接種后第4 天測量各處理和對照菌落直徑,每天測定1次,試驗組每個處理和對照組均設(shè)3次重復(fù)。根據(jù)下列公式計算長枝木霉菌株T6對立枯絲核菌的生長抑制率。

生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑) /(對照菌落直徑-0.5)×100%

1.2.4 長枝木霉菌株T6發(fā)酵液抑菌活性測定 取制備好的長枝木霉菌株T6發(fā)酵液、發(fā)酵液體培養(yǎng)基、無菌水各6 mL分別加入60 mL PDA培養(yǎng)基中,搖勻后分別倒入3個培養(yǎng)皿(85 mm)中制成平板。試驗以發(fā)酵液體培養(yǎng)基和無菌水分別作為陽性對照和陰性對照。利用打孔器(d=0.5 cm)在活化的立枯絲核菌菌落邊緣打取菌餅,將其菌餅正面朝下接種于制備好的各處理組和對照的PDA平板中央,置于25 ℃光照培養(yǎng)箱(HQH-H300,上海躍進醫(yī)療器械有限公司)中培養(yǎng),于培養(yǎng)4 d后采用“十字交叉法”測量菌落直徑,按“1.2.3”中公式計算其生長抑制率。每個處理和對照均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物提取及其活性測定 將提取保存的長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物利用丙酮進行溶解,溶解后利用無菌水依次稀釋梯度濃度為200、300、400、500、600 μg·mL-1進行抑菌活性測定,試驗分別以稀釋等濃度丙酮作為陽性對照,以無菌水作為陰性對照,參照上述方法測定其抑菌活性。同時,以代謝產(chǎn)物濃度對數(shù)值(x)與抑制率幾率值(y)之間的線性回歸關(guān)系,依據(jù)y=ax+b求出毒力回歸方程和EC50值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理和分析,并采用SPSS 20.0軟件(IBM,美國)進行顯著性分析和Duncan氏新復(fù)極差法進行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長枝木霉菌株T6對立枯絲核菌抑菌活性及其重寄生作用

由圖1和表1結(jié)果表明,長枝木霉菌株T6不僅對立枯絲核菌的營養(yǎng)生長具有顯著的抑制作用,而且對其菌絲具有明顯的重寄生作用(表1;圖1-D～F)。接種后4 d和5 d時,長枝木霉菌株T6對立枯絲核菌的菌落生長抑制率分別為 57.82%和66.50%(表1)。接種后5 d時,立枯絲核菌的菌落呈半圓形,生長抑制顯著(圖1-A),而對照則生長正常(圖1-B)。同時,長枝木霉菌株T6和立枯絲核菌菌落相互接觸(圖1-C),顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其在接觸部位出現(xiàn)長枝木霉菌株T6菌絲纏繞和重寄生于立枯絲核菌菌絲表面(圖1-D～F)。因此,長枝木霉菌株T6對立枯絲核菌具有顯著的抑制和重寄生作用。

表1 長枝木霉菌株T6對立枯絲核菌的生長抑制率Table 1 Growth inhibition rate of Trichoderma longibrachiatum isolate T6 against Rhizoctonia solani

A.T6+立枯絲核菌;B.對照;C.T6與立枯絲核菌的菌絲接觸;D、E、F.T6菌絲纏繞和重寄生于立枯絲核菌

2.2 長枝木霉菌株T6發(fā)酵液抑菌活性

與對照相比,長枝木霉菌株T6發(fā)酵液對立枯絲核菌具有較強的抑菌效果。處理后第4天,長枝木霉菌株T6發(fā)酵液處理的菌落直徑(圖2-A)均顯著小于陽性對照(圖2-B)和陰性對照(圖2-C)的菌落直徑,長枝木霉菌株T6發(fā)酵液對立枯絲核菌生長抑制率為72.29%。因此,長枝木霉菌株T6發(fā)酵液對立枯絲核菌具有顯著抑制 作用。

A.發(fā)酵液; B.陽性對照; C. 陰性對照

2.3 長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物抑菌活性

與對照相比,長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌具有顯著的抑制作用,其抑菌作用隨著長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物的濃度增加逐漸增強,不同濃度之間的抑菌作用存在顯著差異。質(zhì)量濃度為600 μg·mL-1的長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物抑菌效果最佳,培養(yǎng)第4天時立枯絲核菌菌落最小(圖3-A),質(zhì)量濃度為500 μg·mL-1(圖3-B)、400 μg·mL-1(圖3-C)和300 μg·mL-1(圖3-D)的菌落次之,質(zhì)量濃度200 μg·mL-1的菌落最大(圖3-E),而陽性(圖3-G)和陰性(圖3-F)對照菌落生長均滿皿。待培養(yǎng)第4天時,質(zhì)量濃度為600 μg·mL-1的菌株T6代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的生長抑制率為 71.91%,EC50值為174.83 μg·mL-1(表2)。500、400和300 μg·mL-1的長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物抑菌率次之,但均大于60%,而質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1時抑菌率較低,為52.32%。因此,不同濃度長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌具有顯著的抑制作用。

表2 長枝木霉菌株T6代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用Table 2 Inhibition effect of Trichoderma longibrachiatum isolate T6 metabolites on Rhizoctonia solani

A. 600 μg·mL-1;B. 500 μg·mL-1;C. 400 μg·mL-1 ;D. 300 μg·mL-1;E. 200 μg·mL-1;F. 陰性對照 Negative control; G.陽性對照 Positive control

3 討論與結(jié)論

陳立華等[14]報道棘孢木霉(T.asperellum)發(fā)酵液對立枯絲核菌的菌核萌發(fā)及菌絲干質(zhì)量均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。咸洪泉等[15]研究發(fā)現(xiàn)木霉菌株的代謝產(chǎn)物可以抑制立枯絲核菌的菌絲生長及菌核的形成和萌發(fā)。彭麗娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)均對立枯絲核菌的菌絲生長產(chǎn)生抑制作用。本試驗發(fā)現(xiàn)長枝木霉菌株T6對立枯絲核菌菌落生長具有顯著的抑制作用,對峙培養(yǎng)第5天時其對立枯絲核菌生長抑制率高達66.46%。

另外,本試驗顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在長枝木霉菌株T6和立枯絲核菌接觸處,菌株T6菌絲能夠纏繞和寄生于立枯絲核菌菌絲表面。夏偉等[17]研究認(rèn)為棘孢木霉發(fā)酵液處理的立枯絲核菌菌絲會出現(xiàn)變形和細(xì)胞質(zhì)濃縮。高葦?shù)萚18]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉可使立枯絲核菌細(xì)胞壁變薄、消解和菌絲破裂。史鳳玉等[19]光學(xué)顯微鏡下觀察到長枝木霉菌絲能夠纏繞和侵入立枯絲核菌菌絲,并導(dǎo)致立枯絲核菌細(xì)胞質(zhì)變薄、消解和斷裂等。田連生等[20]通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)綠色木霉與立枯絲核菌的菌絲交接處,綠色木霉菌絲能夠重寄生于立枯絲核菌菌絲,并吸取其菌絲營養(yǎng)使得病菌營養(yǎng)菌絲失活、氣生菌絲逐漸消亡、解體。

Druzhinina等[7]發(fā)現(xiàn)木霉不僅能夠?qū)χ参锊≡婢哂兄丶纳饔?而且可以通過分泌細(xì)胞壁降解酶、抗菌活性產(chǎn)物、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等機制有效防治多種植物病害。張慧等[21]證實木霉能夠產(chǎn)生豐富的次生代謝物,具有抑制病原菌和促進植物生長等功效,在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)長枝木霉菌株T6發(fā)酵液和次生代謝產(chǎn)物對蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)菌落生長具有抑制作用,而本研究發(fā)現(xiàn)長枝木霉菌株T6發(fā)酵液和代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的生長具有顯著的抑制作用,而且抑菌效果隨著代謝物濃度升高而增強,質(zhì)量濃度為600 μg·mL-1的菌株T6代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的生長抑制率為 71.92%,研究結(jié)果為后續(xù)木霉生物菌劑及種衣劑應(yīng)用于植物病害防治具有廣泛的應(yīng)用前景,但是有關(guān)其拮抗作用機制尚待進一步研究。