劉競 劉東升 朱旭江 王蘭霞

【摘 要】

目的：補充和完善止咳祛痰糖漿質量標準。方法：采用HPLC法測定鹽酸麻黃堿含量：以日立HITACHI HPLC column （4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）為流動相，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL，檢測波長為205 nm。結果：鹽酸麻黃堿在相應范圍內線性關系良好，平均回收率為100.2%（RSD<3%）。結論：優(yōu)化的方法簡便、準確，符合質量標準制定的要求，該研究方法可為其質量控制提供參考。

【關鍵詞】

止咳祛痰糖漿；HPLC；鹽酸麻黃堿

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）06-0042-04

Optimization of Extraction Method of Ephedrine Hydrochloride and Antitussive Syrup

LIU Jing1 LIU Dongsheng2 ZHU Xujiang2 WANG Lanxia1*

1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China;

2.Gansu Institute for Drug Control， Lanzhou 730070，China

Abstract：

Objective To supplement and improve the quality standard of cough relieving and expectorant syrup. Methods The content of ephedrine hydrochloride was determined by HPLC method： Hitachi HITACHIHPLCcolumn （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used as chromatographic column， methanol-0.03 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution-triethylamine （10∶90∶0.02） as mobile phase， flow rate： 1.0 mL/min， injection volume： 10 μL， detection wavelength was 205 nm. Results Ephedrine hydrochloride had a good linear relationship in the corresponding range， and the average recovery was 100.2% （RSD<3%）. Conclusion The optimization method is simple， accurate and meets the requirements of quality standard. this research method can provide reference for its quality control.

Keywords：

Cough and Expectorant Syrup; HPLC; Ephedrine Hydrochloride

止咳祛痰糖漿是由桔梗、百部及苦杏仁三味藥材經(jīng)煎煮、濃縮為清膏，后加入鹽酸麻黃堿加工而成，其功效是潤肺祛痰，止咳定喘［1］。用于傷風咳嗽、慢性支氣管炎及支氣管哮喘。現(xiàn)行標準為國家藥品標準［WS-10036（ZD-0036）-2002-2012Z］，標準中收載性狀、薄層鑒別（鹽酸麻黃堿、桔梗）和鹽酸麻黃堿的含量測定，但在檢驗過程中發(fā)現(xiàn)鹽酸麻黃堿的實際投料和鹽酸麻黃堿的含量測定值存在差異，可能由于供試品溶液制備過程中提取過程過于復雜以及溶液揮干過程中鹽酸麻黃堿損失造成?；谝陨显蜓a充了鹽酸麻黃堿含量測定方法，以期完善止咳祛痰糖漿的質量標準。

1 試驗材料

1.1 儀器 Waters alliance e2695型高效液相色譜儀；e2695 HPLC Pump、2998 DuaLλ Absorbance Detector 和Empower色譜工作站；日立HITACHI HPLC column （4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；METTLER TOLEDO ME204（萬分之一）；METTLER TOLEDO MS205DU（十萬分之一）和XPE 26（百萬分之一）型分析天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試劑與試藥 鹽酸麻黃堿（批號：171241-201508，含量：99.8%）對照品由中國食品藥品檢定研究院提供。止咳祛痰糖漿樣品為A公司生產(chǎn)，批號為：2001056001、2001057001、2001058001、2003056001、2003057001、2003058001、2003060001、2006056001。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱選用日立HITACHI HPLC column（4.6mm×250 mm，5 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）為流動相，檢測波長為205 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 精密量取樣品2 mL置25 mL量瓶中，加稀乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品22.02 mg，置25 mL量瓶中，加稀乙醇溶液至刻線，搖勻，精密量取3 mL，置50 mL量瓶中，加稀乙醇溶液至刻線，搖勻，即得。

2.2.3 陰性溶液制備 按處方比例及制備工藝，配制不含鹽酸麻黃堿的陰性樣品，并按“2.2.1”項下供試品溶液制備方法制成陰性對照液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性考察 取鹽酸麻黃堿對照品溶液、供試品溶液及缺鹽酸麻黃堿的陰性樣品適量，0.45 μm微孔濾膜過濾，各精密吸取10 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測樣，結果如圖1。實驗結果表明陰性色譜圖中在與鹽酸麻黃堿相應的保留時間沒有色譜峰，說明其他藥材及溶劑對鹽酸麻黃堿的測定無干擾，以本法測定止咳祛痰糖漿中鹽酸麻黃堿的含量具有專屬性。

2.3.2 標準曲線 精密吸取對照品溶液3 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定峰面積積分值，以對照品溶液的進樣量為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y）作圖，繪制標準曲線，計算回歸方程，得到鹽酸麻黃堿的回歸方程為Y=2402.6X-9512.6，相關系數(shù)r=0.9999；表明鹽酸麻黃堿在158.544～2113.92 μg范圍內進樣量與峰面積線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取鹽酸麻黃堿對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，測定結果經(jīng)計算，RSD為1.12%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批號的樣品（批號：2001056001），按照“2.2.1”項下制備供試品溶液6份，精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件平行測定，并計算樣品中待測成分的含量。結果含量平均值為0.58 mg/mL，RSD為1.62%，表明該分析方法重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批號（批號：2001056001）供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，分別在0 h、4 h、16 h、24 h、30 h、36 h進樣，測定供試品溶液中鹽酸麻黃堿的峰面積。實驗結果顯示36 h內鹽酸麻黃堿峰面積的RSD為1.29%，說明供試品溶液在36 h內穩(wěn)定可測。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密量取樣品（批號：2001056001）1 mL、對照品溶液1 mL（鹽酸麻黃堿0.7206 mg）置25 mL量瓶中，加稀乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，平行操作6份，按“2.1”項下色譜條件測定含量，計算加樣回收率，結果鹽酸麻黃堿的平均加樣回收率分別為100.4%，RSD=2.99%（n=6），根據(jù)中國藥典2020年版“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”規(guī)定樣品中待測成分含量在0.01%～0.10%時，回收率限度為90%～108%，表明回收率良好。結果見表1。

2.3.7 樣品測定 依法制備供試品溶液并按照“2.1”項下色譜條件，對8批樣品進行了測定，結果見表2。

2.4 單因素方差分析 為探究止咳祛痰糖漿兩種提取方法的鹽酸麻黃堿含量變化是否有顯著性差異，采用單因素方差分析法［3-4］對HPLC法檢測得到的鹽酸麻黃堿數(shù)據(jù)進行分析。運用 SPSS Statistics 22.0對原標準提取方法（A），優(yōu)化后提取方法（B）進行方差分析，結果見表3。

通過對止咳祛痰糖漿中鹽酸麻黃堿含量進行單因素方差分析，由上表可知：鹽酸麻黃堿的含量在A提取方法和B提取方法兩組的比較中存在顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義（P=0.04＜0.05），且B提取方法的含量大于A提取方法。

3 討論

3.1 測定波長考察 取“2.2”項下鹽酸麻黃堿對照品的單標溶液，在190到400 nm之間進行掃描，測得光譜圖。從圖譜可以看出鹽酸麻黃堿在205 nm處有最大吸收。參照《中國藥典》［5］2020年版一部麻黃（檢測波長為210 nm）、鎮(zhèn)咳寧糖漿（檢測波長為205 nm）、鼻炎通噴霧劑（檢測波長為213 nm）和原方法中的檢測波長215 nm分別進行，實驗結果發(fā)現(xiàn)當鹽酸麻黃堿的檢測波長為205 nm時，對照品和樣品都能得到較好的色譜峰，能夠減少溶劑對實驗結果的影響。

3.2 峰純度考察 取止咳祛痰糖漿“2.2”項下供試品溶液、鹽酸麻黃堿對照品溶液10～20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件以DAD檢測器進行190～400 nm掃描檢測，計算峰純度。

峰純度實驗結果表明，樣品中鹽酸麻黃堿峰未檢測到雜質峰，純度因子在計算出的閾值限值內，說明在該色譜條件下，鹽酸麻黃堿純度符合要求。

3.3 提取溶劑的選擇 提取方法修訂主要參照《中國藥典》2020版一部［5］麻黃和鎮(zhèn)咳寧糖漿含量測定項下及相關文獻［6-13］報道中的鹽酸麻黃堿的含量測定方法，精密吸取一定量的樣品加稀乙醇或者原方法中加流動相（0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液）分別進行稀釋實驗；結果發(fā)現(xiàn)相對于原方法中加流動相（0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液）稀釋液，選用稀乙醇對樣品進行稀釋后，供試品溶液色譜圖中雜峰相對減少且基線更加平穩(wěn)，而不同稀釋溶液稀釋后色譜峰的峰面積相同。所以將供試品溶液的提取過程最終修訂為“精密量取本品2 mL置25 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得”。

3.4不同色譜柱考察 為了考察該含量測定方法的耐用性，精密吸取同一批號（批號：2001056001）的供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，除色譜柱分別改為資生堂SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG（250×4.6 mm，5 μm）、費羅門Phenomenex Gemini（250mm×4.6 mm，5 μm）、泰克美（250 mm×4.6 mm，5 μm）和安捷倫 Agilent HC C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）外，其他條件按“2.3”項下色譜條件進樣分析，測定樣品中鹽酸麻黃堿的含量。實驗結果：比較不同色譜柱的分離效果及含量值，各色譜柱分離效果良好，含量RSD為1.57%，表明該分析方法在不同色譜柱下分析耐用性較好。

3.5 不同柱溫考察 精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，除柱溫分別改為25 ℃、30 ℃、35 ℃外，其他條件按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定樣品中鹽酸麻黃堿的含量。實驗結果：比較三種不同柱溫（±5 ℃）的鹽酸麻黃堿的含量值，含量RSD為2.37%，表明該分析方法在柱溫±5℃范圍內耐用性良好，能適應柱溫微小的變動。

3.6 不同流速考察 精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，除流速分別改為0.9 mL/min、1.0 mL/min和1.1 mL/min外，其他條件按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定樣品中鹽酸麻黃堿的含量。實驗結果：比較三種不同流速（±0.2 mL/min）的鹽酸麻黃堿的含量值，含量RSD為1.58%，表明該分析方法在流速±0.2 mL/min范圍內耐用性良好，能適應流速微小的變動，方法耐用性較好。

3.7 不同流動相比例考察 精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，除流動相比例分別改為甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（12∶88∶0.02）、甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）和甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（8∶92∶0.02）外，其他條件按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定樣品中鹽酸麻黃堿的含量，RSD為2.14%。說明該分析方法能適應流動相甲醇、0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液比例的微小變動，方法耐用性較好。

3.8 差異性分析 通過對A方法和B方法進行單因素方差分析得出兩種方法具有顯著性差異，并且B方法測得含量大于A方法。B方法測得鹽酸麻黃堿的含量更接近實際投料值，說明廠家按處方投料，造成差異的原因是A方法可能是制備供試品溶液過程中過于復雜，在萃取、轉移等操作中造成鹽酸麻黃堿損失。而新建立的提取方法，操作方便快捷，也不會造成鹽酸麻黃堿的損失，使得止咳祛痰糖漿的標準更加完善。

綜上所述，本研究所建立的HPLC法測定止咳祛痰糖漿中鹽酸麻黃堿含量測定方法，經(jīng)過方法學驗證，簡便、準確度高、重復性好、耐用性強，為止咳祛痰糖漿質量控制提供了科學依據(jù)。

參考文獻

［1］陳燕，滕寶霞，劉玉玲. 止咳祛痰糖漿鎮(zhèn)咳、祛痰及平喘的藥效學研究［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2007（2）： 20， 69.

［2］國家食品藥品監(jiān)督管理局. 止咳祛痰糖漿： WS-10036（ZD-0036）-2002-2012Z［S］.

［3］楊小勇. 方差分析法淺析——單因素的方差分析［J］. 實驗科學與技術， 2013，11（1）：41-43.

［4］程艷芹，李明春. 中藥提取工藝的實驗設計方案及數(shù)據(jù)處理方法［J］. 實用醫(yī)藥雜志， 2013，30（11）：1035-1037.

［5］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典： 一部 ［M］. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020：333，1834，1857.

［6］譚沛，江斌，鄭曉英，等. HPLC測定清肺排毒顆粒鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量［J］. 中國處方藥，2021，19（2）：39-41.

［7］張勇倉，張成棟，劉蘭，等. HPLC法測定藏麻黃中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量［J］. 中國民族醫(yī)藥雜志，2020，26（10）： 30-32.

［8］楊勇幫，施偉兵，許國棟. 通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿含量的方法優(yōu)化［J］. 中國衛(wèi)生標準管理， 2021， 12（16）： 100-104.

［9］李正剛，曲涵婷，李本淳，等. HPLC法測定復方貝母片中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量［J］. 中國藥品標準， 2021， 22（6）： 560-563.

［10］申麗莎，楊巧虹，楊帆，等. 高效液相色譜法同時測定射麻口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量［J］. 中國藥業(yè)， 2021， 30（17）： 79-82.

［11］王化同，張鑫，王洪瑩. 高效液相色譜法測定復方麻黃止咳顆粒中鹽酸麻黃堿的含量分析［J］. 中國社區(qū)醫(yī)師， 2020， 36（23）： 5-6.

［12］曹蓉蓉，王文金，嚴筱楠，等. 麻杏止咳糖漿的薄層色譜法鑒別及高效液相色譜法測定其中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷［J］. 化學分析計量， 2021， 30（8）： 46-49.

［13］許世富. 高效液相色譜法測定麻黃魚腥草散中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量［J］. 現(xiàn)代農業(yè)科技， 2020（15）： 213-214， 219.

（收稿日期：2022-08-09 編輯：劉 斌）