趙文靜　鄭旭　葛金濤　劉興滿　繆美華　孔祥偉

摘要：海濱木槿（Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.）是一種典型的耐鹽植物，甚至能夠在海水中生長，是沿海灘涂綠化的絕佳綠化樹種，但在栽培試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)海濱木槿不耐寒，很難在北方地區(qū)越冬。為探究海濱木槿在低溫脅迫下的分子應(yīng)答機(jī)制，挖掘海濱木槿的抗寒基因，培育耐寒海濱木槿，通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）的試驗(yàn)方法分析海濱木槿在低溫脅迫下的差異基因表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫脅迫下的處理組與常溫對照相比，共有23 689個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因10 256個，下調(diào)表達(dá)基因13 433個。通過GO富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因大多富集在代謝過程、細(xì)胞過程、膜、催化活性等方面；通過 KEGG的富集分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因大多富集在代謝途徑、次生代謝物的生物合成、光合作用、植物晝夜節(jié)律、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，本研究還篩選了一些潛在的耐寒差異基因，如FKF1、 GI、PYL、PP2C、CML、CPK、SNRK2、NCED和BIN2等。本試驗(yàn)結(jié)果可為研究海濱木槿的耐寒機(jī)制以及培育海濱木槿耐寒品種提供技術(shù)參考和基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：海濱木槿；低溫脅迫；轉(zhuǎn)錄組；差異基因；耐寒

中圖分類號：S718文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）05-0056-09

海濱木槿（Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.） 是錦葵科木槿屬的小喬木或灌木，在我國主要分布于浙江舟山、寧波等沿海一帶，在國外，日本和朝鮮也有發(fā)現(xiàn)報道［1-2］。海濱木槿極耐鹽堿，能夠在含鹽量1.5%的泥灘生長，即使被海水淹浸，仍能正常生長和開花結(jié)實(shí)；同時對土壤的要求不高，在pH值為5.5～8.0之間，無論是泥灘、沙灘、丘陵地都能正常生長［3］。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，海濱木槿是一種典型的鹽生植物，一種優(yōu)良的園林綠化樹種，能夠應(yīng)用到鹽堿地改良和海岸灘涂綠化中，具有很高的生態(tài)價值和經(jīng)濟(jì)價值［4-8］。江蘇地區(qū)灘涂面積較大，海濱木槿的應(yīng)用前景廣闊，但在引種栽培試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)海濱木槿在江蘇北部地區(qū)，如連云港地區(qū)，地上部分枝條基本無法安全越冬，只能在第2年從根部另發(fā)新枝。目前，國內(nèi)外對海濱木槿的研究主要集中于馴化、形態(tài)及耐鹽機(jī)制等方面［4-9］，對耐寒機(jī)制方面的研究較少。因此，基于轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的海濱木槿耐寒機(jī)制的研究將為探索海濱木槿分子標(biāo)記等方面提供新的思路，促進(jìn)海濱木槿耐寒遺傳育種的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

供試材料為1年生海濱木槿扦插盆栽苗，其母本為從浙江舟山引進(jìn)，并在連云港經(jīng)過5年低溫馴化篩選出的耐寒品種。

試驗(yàn)地點(diǎn)為連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)時間與方法

于2019年6月20日將長勢一致的1年生海濱木槿扦插苗置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，模擬低溫脅迫。以20 ℃處理為對照（CK），脅迫處理（T）溫度設(shè)置為4 ℃，低溫處理48 h采集組織，每個處理3次重復(fù)，每組處理各取10張大小均勻的葉片，用錫箔紙包裹后迅速放入液氮中冷凍，然后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA的提取。

1.3 總RNA提取

使用Omega Bio-Tek RNA提取試劑盒（貨號R6827）提取RNA。利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop，檢驗(yàn)提取的RNA的完整性和純度；最后用Agilent 2100生物分析儀確定RNA的完整性。

1.4 建庫和轉(zhuǎn)錄組測序

建庫、Unigene基本注釋和序列分析方法參見趙春旭等的試驗(yàn)方法［10］。

1.5 差異表達(dá)基因的GO分析和KEGG分析

差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）分析采用DESeq2［11］進(jìn)行分析，篩選閾值FDR<0.05 且|log2FC|>1。Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個基因組背景相比，在基因中顯著性富集的Pathway。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)及質(zhì)量情況

通過對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，以減小無效數(shù)據(jù)所來帶的分析干擾。對下機(jī)的 raw reads利用fastp［12］進(jìn)行質(zhì)控，去除不合格的reads得到clean reads。從表1可以看出，未過濾前的原始序列數(shù)據(jù)（raw datas）各處理均在3 900萬以上，過濾后的數(shù)據(jù)（clean data）占比均超過99.8%，不合格的序列數(shù)據(jù)較少。從表2可以看出，Phred數(shù)值大于20的堿基占總體堿基的百分比（Q20）在97%以上，Phred數(shù)值大于30的堿基占總體堿基的百分比（Q30）在93%以上。堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比（GC含量）在46%～47% 之間。說明測序的建庫質(zhì)量良好。

2.2 轉(zhuǎn)錄組的組裝

采用組裝序列的長度分布來衡量轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量。由表3可知，共組裝了123 276個Unigene，平均長度為807 bp，N50長度為1 225 bp，最大長度為 17 146 bp，最小長度為201 bp。由圖1可知，組裝出來的 Unigene集中在0～1 000 bp之間，數(shù)據(jù)量及質(zhì)量均能保證后續(xù)分析要求。

2.3 基因功能注釋

本試驗(yàn)分別在NR、SwissProt、KEGG 和COG/KOG這4個數(shù)據(jù)庫繼續(xù)注釋，結(jié)果如圖2所示，4個數(shù)據(jù)庫可注釋的Unigene數(shù)量共76 175個，其中有34 723個Unigene能在所有數(shù)據(jù)庫中得到注釋。

通過NR數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果（圖3）表明，與海濱木槿同源基因相似度最高的是陸地棉（Gossypium hirsutum），相似率達(dá)到24.36%；其次是亞洲棉（G. arboreum），相似率達(dá)到21.94%；然后是雷蒙德氏棉（G. raimondil），相似率達(dá)到20.68%；與可可樹（Theobroma cacao）的相似率達(dá)到18.60%。

2.4 差異基因表達(dá)分析

差異基因表達(dá)分析采用DESep2［11］，篩選條件為FDR<0.05 且 |log2FC|>1的基因?yàn)轱@著差異基因。如圖4所示，低溫脅迫下的處理組與常溫對照相比，共有23 689個差異表達(dá)基因。其中上調(diào)表達(dá)基因有10 256個，下調(diào)表達(dá)基因有 13 433 個。

2.5 差異表達(dá)基因的GO分析

將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集功能分類，結(jié)果見圖5，主要從生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3個方面進(jìn)行分析。

在生物學(xué)過程中，試驗(yàn)材料DEGs 富集最多的依次為代謝過程（metabolic process），有6 595 個Unigene得到注釋，占比81.3%；細(xì)胞過程（cellular process），有6 019 個Unigene得到注釋，占比 74.2%；單有機(jī)體過程（single-organism process），有4 653 個Unigene得到注釋，占比 57.36%；生物調(diào)節(jié)（biological regulation），有2 493 個Unigene得到注釋， 占比30.73%； 生物過程的調(diào)節(jié)（regulation of biological process），有2 284個Unigene得到注釋，占比 28.16%；對刺激的反應(yīng)（response to stimulus），有1 954 個Unigene得到注釋，占比24.09%；本土化（localization），有1 556個Unigene得到注釋，占比19.18%；發(fā)展過程（developmental process），有1 089個Unigene得到注釋，占比13.42%；細(xì)胞成分組織（cellular component organization or biogenesis），有 1 197 個Unigene得到注釋，占比14.76%；信號（signaling），有712 個Unigene得到注釋，占比8.78%； 多細(xì)胞生物的過程（multicellular organismal process），有834 個Unigene得到注釋，占比10.28%；多有機(jī)體過程（multi-organism process），有390個Unigene得到注釋，占比4.81%；生殖（reproduction），有516個Unigene得到注釋，占比6.36%；生殖過程（reproductive process），有511個Unigene得到注釋，占比6.3%；免疫系統(tǒng)過程（immune system process），有175個Unigene得到注釋，占比2.16%；生物過程的正向調(diào)控（positive regulation of biological process），有203個Unigene得到注釋，占比2.5%；生長（growth），有159個Unigene得到注釋，占比1.96%；生物過程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of biological process），有189個Unigene得到注釋，占比2.33%；節(jié)奏過程（rhythmic process），有62 個Unigene得到注釋，占比0.76%；生物黏附（biological adhesion），有40個Unigene得到注釋，占比0.49%；排毒（detoxification），有10 個Unigene得到注釋，占比0.12%；運(yùn)動（locomotion），有5個Unigene得到注釋，占比0.06%；細(xì)胞死亡（cell killing），有1個Unigene得到注釋，占比0.01%。

在細(xì)胞組分中，試驗(yàn)材料DEGs 富集最多的依次為細(xì)胞（cell和cell part），有3 832 個Unigene得到注釋，占比74.99%；細(xì)胞器（organelle），有3 173個Unigene得到注釋，占比 62.09%；膜（membrane），有2 142個Unigene得到注釋，占比 41.92%；膜部分（membrane part），有1 536個Unigene得到注釋，占比 30.06%；細(xì)胞器部分（organelle part），有1 392 個Unigene得到注釋，占比27.24%；大分子復(fù)合物（macromolecular complex），有742個Unigene得到注釋，占比14.52%；細(xì)胞連接（cell junction），有228 個Unigene得到注釋，占比4.46%；細(xì)胞外區(qū)（extracellular region），有134 個Unigene得到注釋，占比2.62%；膜封閉腔（membrane-enclosed lumen），有74 個Unigene得到注釋，占比1.45%；病毒粒子（virion），有20個Unigene得到注釋，占比0.39%；類核素（nucleoid），有8 個Unigene得到注釋，占比0.16%；細(xì)胞外區(qū)部分（extracellular region part），有4個Unigene得到注釋，占比0.08%；細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix），有4 個Unigene得到注釋，占比0.08%；超分子纖維（supramolecular fiber），有3個Unigene得到注釋，占比0.06%。

在分子功能中，試驗(yàn)材料DEGs 富集最多的依次為催化活性（catalytic activity），有5 259 個Unigene得到注釋，占比68.86%；黏合物（binding），有4 632個Unigene得到注釋，占比60.65%；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（transporter activity），有454個Unigene得到注釋，占比5.94%；核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity），有382個Unigene得到注釋，占比5%；信號傳感器活動（signal transducer activity），有119個Unigene得到注釋，占比1.56%；結(jié)構(gòu)分子活性（structural molecule activity），有85個Unigene得到注釋，占比1.11%；分子換能器活性（molecular transducer activity），有81 個Unigene得到注釋，占比1.06%；分子功能調(diào)節(jié)劑（molecular function regulator），有42 個Unigene得到注釋，占比0.55%；抗氧化活性（antioxidant activity），有18個Unigene得到注釋，占比0.24%；轉(zhuǎn)錄因子活性，蛋白質(zhì)結(jié)合（transcription factor activity，protein binding），有14個Unigene得到注釋，占比0.18%；電子載流子活性（electron carrier activity），有10個Unigene得到注釋，占比0.13%；翻譯調(diào)節(jié)活性（translation regulator activity），有1個Unigene得到注釋，占比0.01%。

其中，按富集程度（qvalue＜0.05）由高到底排序依次為質(zhì)體（plastid）、質(zhì)體部分（plastid part）、類囊體（thylakoid）、質(zhì)體類囊體（plastid thylakoid）、葉綠體（chloroplast）、葉綠體部分（chloroplast part）、質(zhì)體基質(zhì)（plastid stroma）、質(zhì)體被膜（plastid envelope）等（圖6）。

2.6 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

生物個體的功能表達(dá)通常需要大量基因的共同協(xié)作才能完成，因此通過對代謝通路的分析，能夠更加清晰地表達(dá) DEGs 的生物學(xué)功能。將差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析，并在130個代謝通路中得到注釋。富集程度（qvalue＜0.05）最高的20個通路分別是：代謝途徑（metabolic pathways）、次生代謝物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、光合作用（photosynthesis）、植物的晝夜節(jié)律（circadian rhythm-plant）、卟啉和葉綠素代謝（porphyrin and chlorophyll metabolism）、光合作用-天線蛋白（photosynthesis-antenna proteins）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（glycine，serine and threonine metabolism）、光合生物中的碳固定（carbon fixation in photosynthetic organisms）、二萜生物合成（diterpenoid biosynthesis）、類胡蘿卜素生物合成（carotenoid biosynthesis）、碳代謝（carbon metabolism）、植物-病原體相互作用（plant-pathogen interaction）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism）、氮代謝（nitrogen metabolism）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）等。表示富集程度的qvalue均＜0.001，其中得到注釋的 DEGs數(shù)量最多的代謝通路是代謝途徑，共有1 752個。其次，次生代謝物的生物合成有995個DEGs，植物的晝夜節(jié)律有121個DEGs，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝有100個DEGs（圖7）。

2.7 抗寒差異表達(dá)基因

本試驗(yàn)在對差異表達(dá)基因功能分析的基礎(chǔ)上，對試驗(yàn)材料特異表達(dá)的基因進(jìn)行進(jìn)一步的分析，挑選出一些與植物耐寒相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)這些基因主要分布在代謝途徑、次生代謝物的生物合成、卟啉和葉綠素代謝、氨基酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、光合作用與碳代謝、晝夜節(jié)律、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中。

如表4所示，與代謝途徑相關(guān)的表達(dá)基因有E1.6.5.4、NCED、E2.4.1.13；與次生代謝物的生物合成相關(guān)的表達(dá)基因有katE，CAT，catB，srpA、G6PD，zwf；與卟啉和葉綠素代謝相關(guān)的表達(dá)基因有hemD，UROS、hemA；與氨基酸代謝相關(guān)的表達(dá)基因有AGXT2、serC，PSAT1；與類胡蘿卜素生物合成相關(guān)的表達(dá)基因有CYP707A、AAO3、ZEP，ABA1；與光合用與碳代謝相關(guān)的表達(dá)基因有petH、psaG、LHCB6、MDH2、IDH3、PGD，gnd，gntZ；與植物晝夜節(jié)律相關(guān)的表達(dá)基因有GI、FKF1；與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的表達(dá)基因有CML、CPK、SNRK2、BIN2、IAA、PP2C、PYL。

3 討論與結(jié)論

溫度是植物生長發(fā)育過程中最受環(huán)境制約的因素之一，限制了植物的生長發(fā)育和地理分布［13］，以至于有了“江南冬景似春華，江北冬嶺只枯丫”的對比。植物在受到低溫脅迫的時候，細(xì)胞膜系統(tǒng)首先遭到破壞，膜透性改變，繼而擾亂細(xì)胞內(nèi)正常代謝，如光合作用、呼吸作用等，嚴(yán)重時導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14-19］。為了研究植物體內(nèi)應(yīng)答低溫脅迫的調(diào)控機(jī)制，隨著近年來技術(shù)的發(fā)展，RNA-seq、Chip-seq、iTRAQ、TMT、LC-MS/MS 等新一代技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，分別從轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組及轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控等不同方向?qū)χ参锏目购畽C(jī)制進(jìn)行解析［20］。其中，轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）是對某一物種的mRNA進(jìn)行高通量測序的技術(shù)，反映在特定條件和特定時間下該物種的基因表達(dá)情況［21-22］，因此，通過轉(zhuǎn)錄組測序，有利于揭示作物在冷脅迫下的生理及分子機(jī)制。目前為止，轉(zhuǎn)錄組測序手段已經(jīng)揭示了小麥、水稻、茶樹、薰衣草、草地早熟禾、煙草、擬南芥、西葫蘆等經(jīng)濟(jì)作物的耐寒分子機(jī)制，為培育其耐寒品種提供了信息技術(shù)參考［10，13，15，23-24］。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序方法，研究了經(jīng)過低溫馴化的耐寒海濱木槿在低溫脅迫處理下的基因表達(dá)情況。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)組裝和注釋后，通過NR數(shù)據(jù)庫比對與海濱木槿同源基因相似度最高的是陸地棉（G. hirsutum），相似率達(dá)到24.36%；其次是亞洲棉（G. arboreum），相似率達(dá)到21.94%；然后是雷蒙德氏棉（G. raimondil）的相似率達(dá)到20.68%；可可樹（Theobroma cacao），相似率達(dá)到18.60%。其中，陸地棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉均為錦葵科木槿族棉屬，與海濱木槿同為錦葵科植物，可可樹也是錦葵目植物，說明測序準(zhǔn)確性是比較高的。采用DESep2進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，篩選出FDR<0.05 且 |log2FC|>1 的基因?yàn)轱@著差異基因，共得到23 689個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因有10 256個，下調(diào)表達(dá)基因有13 433個。通過GO富集分析，發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集在代謝過程、細(xì)胞過程、膜、催化活性、黏合物等方面。這與相關(guān)報道較為一致，植物在遭遇低溫脅迫后，首先細(xì)胞膜透性會改變，傳遞信號，調(diào)控細(xì)胞代謝，以應(yīng)對低溫帶來的傷害［25-26］。通過 KEGG的富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在代謝途徑、次生代謝物的生物合成、光合作用、植物晝夜節(jié)律、卟啉和葉綠素代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、二萜生物合成、類胡蘿卜素生物合成、碳代謝、植物-病原體相互作用、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氮代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，說明這些途徑可能在海濱木槿低溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。

通過進(jìn)一步的發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)耐寒相關(guān)的差異基因主要分布在代謝途徑、次生代謝物的生物合成、卟啉和葉綠素代謝、氨基酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、光合作用與碳代謝、晝夜節(jié)律、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中。梁雨晨等認(rèn)為，在薰衣草晝夜節(jié)律通路中，植物受光敏色素（PHY）調(diào)控，誘導(dǎo)產(chǎn)生相關(guān)抗性基因，通過蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析和篩選，發(fā)現(xiàn)樞紐基因 FKF1和GI，在晝夜節(jié)律通路中上調(diào)表達(dá)，參與調(diào)控植物晝夜節(jié)律信號通路，表明生物鐘調(diào)控在薰衣草應(yīng)答寒冷脅迫中發(fā)揮了重要作用［24］。本研究中，篩選出晝夜節(jié)律中的差異基因GI和FKF1均為上調(diào)表達(dá)，與梁雨晨的研究結(jié)果［24］一致。Chen等通過對經(jīng)過低溫脅迫處理后耐寒基因型菠蘿的轉(zhuǎn)錄組測序分析，DEGs 通過 KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞壁特性、氣孔關(guān)閉以及脫落酸（ABA）和活性氧（ROS）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因在菠蘿耐寒性中起重要作用，其中，所有與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的冷脅迫響應(yīng)基因表達(dá)均上調(diào)，包括PYR/PYL同源基因和PP2C同源基因［27］。本研究與之相一致，在本研究中，篩選出的差異基因PYL和PP2C均上調(diào)表達(dá)。趙春旭等在探究青海野生草地早熟禾低溫脅迫下的分子應(yīng)答機(jī)制時，發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下，差異基因主要富集在光合作用、氧化還原反應(yīng)過程、碳水化合物代謝、細(xì)胞膜系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及次生物代謝中，另外通過耐寒和不耐寒2種材料轉(zhuǎn)錄組的對比，篩選出一批在耐寒材料中上調(diào)表達(dá)的潛在的抗寒基因，如CML、CPK、CALM、DHAR、GST、NCED、SNRK2、BSK、CKX、BIN2、ARF和PEK等［11］。本研究的結(jié)果與之一致，在本研究中，篩選出的CML、CPK、SNRK2、NCED、BIN2等與趙春旭研究中重合的基因，也均上調(diào)表達(dá)。

本研究利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)建立了海濱木槿低溫脅迫前后葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選出差異表達(dá)基因，為研究海濱木槿的耐寒機(jī)制以及培育海濱木槿耐寒品種提供了技術(shù)參考和基礎(chǔ)。

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收稿日期：2022-05-16

基金項(xiàng)目：江蘇省林業(yè)科技創(chuàng)新與推廣項(xiàng)目（編號：LYKJ-連云港［2021］01）；連云港市財政專項(xiàng)（編號：QNJJ1921）。

作者簡介：趙文靜（1991—），女，江蘇連云港人，碩士，助理研究員，主要從事植物病理學(xué)和植物育種研究。E-mail：ZWJ6691@163.com。

通信作者：劉興滿，碩士，副研究員，主要從事園藝和植物育種。E-mail：13611551930@126.com。