許芳芳　劉文祥　鄭偉　孫耀清　王輝

摘要：NF-Y（nuclear factor-Y，NF-Y）通常是以NF-YA （CBF-B/HAP2）、NF-YB （CBF-A/HAP3）和NF-YC （CBF-C/HAP5） 3種亞基構(gòu)成異源三聚體的形式調(diào)控下游基因的表達(dá)，并在生物與非生物脅迫耐受性等方面起著重要作用。本研究在茶樹基因組中鑒定分類了茶樹NF-Y基因家族成員，為后續(xù)的功能分析研究做準(zhǔn)備。在研究中鑒定出45個NF-Y轉(zhuǎn)錄因子亞基（10個NF-YA，20個NF-YB，15個NF-YC）。染色體定位和同義分析表明，茶樹NF-Y基因分布在14條染色體上，9對基因具有大片段復(fù)制，4對基因串聯(lián)復(fù)制，片段復(fù)制是家族成員擴(kuò)張的主要方式。通過序列分析，所有的NF-Y基因具有高度的結(jié)構(gòu)保守性，大多數(shù)NF-Y基因有2個以上的內(nèi)含子。通過啟動子順式元件分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因含有激素和應(yīng)激反應(yīng)元件。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，一部分基因在干旱情況下出現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)錄組豐度增加，而在鹽處理后基本沒有變化或出現(xiàn)不同程度的豐度下降。隨后的qRT-PCR結(jié)果顯示，在選定的4個基因中，CsNF-YA6、CsNF-YB4在20%PEG處理下出現(xiàn)不同幅度的上調(diào)，200 mmol/L 鹽處理下，CsNF-YA6、CsNF-YB4、CsNF-YC5在鹽處理后2 d出現(xiàn)輕微上調(diào)。結(jié)合qRT-PCR結(jié)果分析表明，在候選基因中存在介導(dǎo)茶樹響應(yīng)干旱脅迫與鹽脅迫途徑的基因。綜上所述，茶樹NF-Y基因在茶樹非生物脅迫防御等多方面響應(yīng)并發(fā)揮作用，本研究也為揭示相關(guān)NF-Y基因在茶樹干旱脅迫與鹽脅迫下的確切作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：茶樹；NF-Y家族；干旱脅迫；全基因組分析；基因表達(dá)

中圖分類號：S571.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）05-0081-13

干旱是限制全球農(nóng)作物產(chǎn)量的主要制約因素之一。干旱脅迫等非生物脅迫不僅導(dǎo)致植物細(xì)胞損傷、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并降低酶的活性等，更重要的是會對植物生長發(fā)育造成影響，導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降［1-2］。研究還表明，茶葉的超氧化物歧化酶活性在短期或輕度干旱脅迫下增加，但在長期或嚴(yán)重干旱脅迫下降低，茶樹［Camellia sinensis （L.） O. Ktze.］衰老會更快。干旱脅迫不僅會影響茶樹代謝活動以及生長發(fā)育，同時干旱還會導(dǎo)致茶樹芽葉數(shù)量、長度以及百芽質(zhì)量等方面明顯下降，造成茶產(chǎn)量下降；并且導(dǎo)致茶葉中主導(dǎo)茶葉品質(zhì)的總游離氨基酸、咖啡堿和水浸出物等品質(zhì)成分降低。近年來隨著研究深入，NF-Y基因家族也被發(fā)現(xiàn)響應(yīng)干旱處理，在干旱處理下，過表達(dá)BnNF-YA3的擬南芥在種子萌發(fā)、根生長上發(fā)揮作用［3］；NF-Y基因作為參與非生物脅迫的基因在調(diào)節(jié)植物抗逆性上的功能逐漸被挖掘，這在其他物種中也已經(jīng)被證實(shí)，NF-YB 基因與NF-YA、NF-YC基因之間具有協(xié)同作用并介導(dǎo)干旱等非生物脅迫。

核因子NF-Y是普遍分布于真核生物中的一類轉(zhuǎn)錄因子，又叫亞鐵血紅素激活蛋白（heme-activator proteins，簡稱HAPs）或CCAAT結(jié)合因子（CCAAT-binding factor，簡稱CBF），NF-Y蛋白是轉(zhuǎn)錄因子家族，普遍存在于真核生物中，每個基因家族不僅代表其蛋白結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，更是代表基因之間具有功能上的相似性。NF-Y基因家族屬于CCAAT結(jié)合因子家族，最初定義為酵母蛋白中的血紅素激活蛋白（HAP）家族。NF-Y轉(zhuǎn)錄因子因含有3種不同亞基被分為3個部分：NF-YA （HAP2/CBF-A）、NF-YB （HAP3/CBF-B）、NF-YC （HAP5/CBF-C）。由于近年來NF-Y基因在干旱脅迫下功能逐漸被挖掘，在植物中，已經(jīng)有多種植物的NF-Y家族基因被鑒定出來，在擬南芥中一共鑒定出36個（10個NF-YA，13個NF-YB、13個NF-YC亞基）NF-Y基因［4］，同時在擬南芥的轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)擬南芥大多數(shù)NF-YA基因在干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)［5］。在楊樹中，共鑒定出52個NF-Y基因，并通過生信分析預(yù)測候選基因PtNF-YA3在抗逆性上可能有作用［6］。目前已有研究證實(shí)NF-YA相關(guān)基因在非生物脅迫中發(fā)揮作用，過量表達(dá)小麥TaNF-YA10-1的擬南芥植株在鹽脅迫下顯著上調(diào)［7］，AtNF-YA5的過度表達(dá)也可以提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性，減少葉片失水［8］；此外，OsNF-YA7還被證實(shí)有可能以不依賴脫落酸（ABA）的方式增強(qiáng)水稻的耐旱性［9］。在NF-YB相關(guān)基因的研究中發(fā)現(xiàn)在狗尾草中SiNF-YB8在提高大豆抗旱性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，同樣的在TaNF-YB3的研究中發(fā)現(xiàn)TaNF-YB3參與調(diào)節(jié)ABA信號通路，并呈現(xiàn)出改善植物抗旱性的作用［10］。在NF-YC相關(guān)基因的研究中發(fā)現(xiàn)在百慕大草中Cdt-NF-YC1的過表達(dá)水稻植株在干旱和鹽脅迫下增強(qiáng)了植株的耐受性，并對ABA的敏感性增加，擬南芥ABF3和ABF4與NF-YC一起通過在干旱條件下誘導(dǎo)SOC1轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)開花［11］。

茶樹原產(chǎn)于東亞，在我國云南省、四川省等地分布廣泛。茶因含有多酚類化合物、咖啡堿等多種生物活性物質(zhì)以及抗氧化、延緩衰老、治療疾病等多種功效在某某領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不僅營養(yǎng)豐富而且具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。盡管對于NF-Y基因的研究已經(jīng)很多，茶樹全基因組重組序列的公布為茶樹NF-Y基因家族的鑒定與挖掘提供了便利，但是對于茶樹NF-Y基因家族的分析由于基因組未完全組裝存在著不確定性。本研究依據(jù)生物信息學(xué)方法從茶樹基因組中鑒定并分類CsNF-Y家族成員，并確認(rèn)家族基因染色體位置，在分析基因重復(fù)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和保守域以及順式元件的基礎(chǔ)上闡述CsNF-Y基因的生物學(xué)功能。通過 qRT-PCR 分析CsNF-Y基因的表達(dá)模式，分析它們在干旱與干旱A(chǔ)BA脅迫下的作用。以期為后續(xù)研究提供信息支撐。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗(yàn)材料來源于信陽農(nóng)林學(xué)院教學(xué)實(shí)踐茶園，選取生長狀態(tài)良好、長勢基本一致的二年生福鼎大白茶樹移栽花盆中（丹麥泥炭土），設(shè)置人工氣候室生長條件為溫度（22±2） ℃，濕度65%，以未處理的植株作為對照（CK），進(jìn)行模擬干旱（20% PEG-6000）、高鹽（200 mmol/L NaCl）處理，200 mmol/L 氯化鈉溶液和20% PEG-6000溶液分別澆灌植物（500 mL溶液），處理（0、24、48、72 h）后使用1芽3葉（混樣）的方法采樣。每個處理保持3個生物學(xué)重復(fù)，取樣后液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 茶樹NF-Y基因家族鑒定

在擬南芥信息資源庫（TAIR；http：//www.arabidopsis.org/）下載36個已經(jīng)報(bào)道的擬南芥 NF-Y 蛋白序列備用，茶樹候選基因是通過在Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)上下載隱馬爾可夫模型（PF02045和PF00808），以E-value<1.0e-10對茶樹基因組進(jìn)行檢索?；蚪M與蛋白組數(shù)據(jù)從TPIA數(shù)據(jù)庫（http：//tpia.teaplant.org/）下載。為了確認(rèn)結(jié)果無誤篩掉非基因家族基因，將所得的基因蛋白序列上傳至PfamScan （https：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/）與SMART （http：//smart.embl-heidelberg.de/）上，以E-value<1.0e-10進(jìn)行檢索，通過檢索結(jié)果查看基因是否含有NF-Y結(jié)構(gòu)域，然后做進(jìn)一步篩選。此外，Siefer對NF-Y 3個亞族結(jié)構(gòu)的描述如下：NF-YA保守結(jié)構(gòu)域序列：f-V-N-A-K-Q-Y-h-x-I-l-r-R-R-q-x-R-A-k-l-E-a-x-x-K-l-i-k-x-R-K-P-Y-l-H-E-S-R-H-x-H-A-x-r-R-p-R-G-s-G-G-R-E，NF-YB保守結(jié)構(gòu)域序列：r-e-q-D-r-x-L-P-I-A-N-v-x-R-I-M-K-x-x-L-P-x-x-n-x-k-i-s-k-D-A-K-e-t-x-Q-E-C-v-s-E-F-I-S-F-v-T-s-E-A-s-d-k-C-q-x-E-k-R-K-T-I-n-g-d-D-x-L-w-A-m-x-t-L-G-F-x-d-Y-x-e-p-L-x-k-x-Y-x-L-x-k-y-R-e-x-x-e-g-e，NF-YC保守結(jié)構(gòu)域序列：l-P-l-a-R-I-K-K-I-M-K-x-D-e-D-V-x-m-I-s-a-e-A-P-x-l-f-a-K-A-c-E-M-F-I-x-e-L-T-x-R-s-W-x-h-t-e-e-n-k-R-r-T-l-q-k-x-d-i-a-a-A-v-x-r-x-d-x-x-f-D-F-L-x-x-D-x-V-P，大寫字母是完全保守的位點(diǎn)，小寫字母x代表非保守位點(diǎn)，其他均為相對保守的位點(diǎn)，通過保守結(jié)構(gòu)域序列比對進(jìn)一步篩選。

1.3 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

首先對CsNF-Y使用DNAMAN6.0進(jìn)行蛋白序列比對并對保守結(jié)構(gòu)域（>75%）進(jìn)行標(biāo)記，其次將茶樹、擬南芥［4］的NF-Y基因一起進(jìn)行多重序列比對（Clustal W），再構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行進(jìn)化分析。使用MEGA 6.0軟件以ML（maximum likelihood）法構(gòu)建并進(jìn)行bootstrap測試（n=1 000），進(jìn)化樹使用Evolview （https：//evolgenius.info//evolview-v2）在線工具進(jìn)行美化。

1.4 茶樹NF-Y基序與啟動子順勢作用元件分析

使用MEME （https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對NF-Y基因的保守基序進(jìn)行鑒定，設(shè)置參數(shù)：基序數(shù)量12，每個基序出現(xiàn)0或者1次，最佳基序?qū)挾确秶鸀?～50個氨基酸殘基，最大錯配15個。使用TBtools將CsNF-Y基因上游2.0 kb啟動子序列提取并提交于PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）鑒定順勢作用元件。結(jié)果作圖使用TBtools軟件［12］。

1.5 染色體定位與復(fù)制事件

將鑒定基因通過提供的信息進(jìn)行過濾整理，使用TBtools將鑒定的CsNF-Y基因可視化定位在茶樹染色體上，使用TBtools V1.098669進(jìn)行同義分析，同時利用DNASP6.0軟件對重復(fù)復(fù)制事件的Ka、Ks、Ka/Ks［13］值進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)一步分析重復(fù)復(fù)制發(fā)生的時間。

1.6 RNA提取，cDNA文庫獲取

根據(jù)十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法從葉片組織中提取總RNA。每個樣品為0.5 g，進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)。使用 NanoDrop ND-1000 （Thermo Fisher Scientific，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國）測定RNA濃度，并在1％瓊脂糖凝膠上測定質(zhì)量。TBtools用于生成熱圖。RNA-seq數(shù)據(jù)可從NCBI-SRA獲得（干旱與鹽脅迫：ERP012919），首先使用IlluminaRNA-seq軟件將原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量reads，并使用HISAT2與茶樹基因組［C. sinensis var. sinensis ‘Shuchazao（CSS-SCZ）］對齊。采用KALLISTO軟件首先對基因組轉(zhuǎn)錄本建立索引，將整理好的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對建立好的索引計(jì)數(shù)獲得TPM （每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Transcripts）轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)。根據(jù)TPM表達(dá)量制作熱圖，熱圖使用TBtools 生成。

1.7 實(shí)時熒光定量分析

對試驗(yàn)處理不同節(jié)點(diǎn)樣品cDNA使用實(shí)時熒光定量PCR用于分析基因表達(dá)。首先使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)基因引物，引物長度150～250 bp。使用實(shí)時熒光定量分析，以1 μL cDNA模板，10 μL SYBR Premix ExTaq （TaKaRa，日本），2 μL特異性引物，7 μL ddH2O為反應(yīng)體系；PCR熱循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，45個循環(huán)。CsPTB-RT是茶樹肌動蛋白的特異性引物，用于內(nèi)部對照，使基因表達(dá)正常化.基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，每個樣品進(jìn)行3次生物重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)方差分析并進(jìn)行學(xué)生t檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹NF-Y基因家族鑒定

在茶樹CSS-SCZ基因組中共鑒定出45個 NF-Y 基因（10個NF-YA、20個NF-YB、15個NF-YC）。為了區(qū)分這些基因，根據(jù)基因的亞族與染色體位置進(jìn)行分類命名：CsNF-YA1～CsNF-YA10、CsNF-YB1～CsNF-YB20、CsNF-YC1～CsNF-YC15（表1）。所有基因的基因名稱、基因ID、染色體位置、開放閱讀框（open reading frame，ORF）、氨基酸（amino acids）、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量（molecular weight ）、等電點(diǎn)（isoelectric point）見表1。通過序列分析，45個CsNF-Ys的氨基酸長度從87 aa （CsNF-YB16）到353 aa（CsNF-YA5）不等，CsNF-Y 3個亞家族中，CsNF-YA長度（范圍為147～353 aa，平均長度255.1 aa）最長，其次是 CsNF-YC 長度（范圍為118～291 aa，平均長度223.73 aa），CsNF-YB 長度（范圍為87～330 aa，平均長度191.35 aa）最短，氨基酸長度具有明顯的差異。開放閱讀框長度為264 bp （CsNF-YB16）～1 062 bp （CsNF-YA5），預(yù)測的分子量為9.62 ku （CsNF-YB16）～38.72 ku（CsNF-YA5），預(yù)測理論等電點(diǎn)為4.60（CsNF-YB8）～10.01（CsNF-YC14）。

2.2 2種植物 NF-Y 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究根據(jù)其氨基酸序列，結(jié)合45個茶樹 NF-Y（10個NF-YA，20個NF-YB，15個 NF-YC），36個擬南芥NF-Y基因的氨基酸序列構(gòu)建了進(jìn)化樹（圖1）。通過成員數(shù)量比較發(fā)現(xiàn)，相比擬南芥NF-YB、NF-YC分別擴(kuò)展了7、2個基因，NF-YA數(shù)量一致。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，茶樹與擬南芥的NF-Y蛋白序列同源性較高，結(jié)果表明，相似基因可能在功能上具有相似性。

2.3 CsNF-Y基因的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

保守基序分析顯示，茶樹NF-Y基因家族保守基序數(shù)量為12個（圖2），基序長度范圍為15～50 aa，基因保守基序數(shù)量范圍為2～6個，大多數(shù)基因都含有2～6個基序，有趣的是NF-YAs特異性的含有基序（3）和（8），NF-YBs與NF-YCs特異性的都含有基序（1），除了NF-YB16沒有基序（2），NF-YBs、NF-YCs其他基因都含有基序（2），同時NF-YCs特異性含有基序（6）。因此，茶樹 NF-Y 基因在進(jìn)化發(fā)育過程中是具有很大的差異性的。本研究對茶樹NF-Y基因外顯子-內(nèi)含子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析（圖2），分析發(fā)現(xiàn)，14個（31.1%）無內(nèi)含子，6個（13.3%）只有1個內(nèi)含子，25個（55.6%）為2～6個內(nèi)含子。因此，大多數(shù)基因都有內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜。

2.4 染色體定位，基因復(fù)制與進(jìn)化分析

染色體定位顯示45個基因分布在14條染色體上（圖3），大部分染色體上分布2～4個基因，總體來看，基因分布比較均勻，每條染色體上均勻分布了2～4個CsNF-Ys。本研究對茶樹NF-Y基因的復(fù)制事件進(jìn)行分析（圖4），發(fā)現(xiàn)在CsNF-Y基因中，9對基因?qū)槠螐?fù)制，4對基因?qū)榇?lián)復(fù)制。片段復(fù)制事件在染色體分布方面在Chr04上最多，其次是Chr03，而在Chr10上沒有復(fù)制事件產(chǎn)生。對復(fù)制事件發(fā)生時間進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在剔除CsNF-YA3/CsNF-YA9和CsNF-YB15/CsNF-YB13 2對發(fā)生同義突變位點(diǎn)較多、進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的基因?qū)?shù)據(jù)后得到11對復(fù)制事件的信息，有趣的是所有基因?qū)a/Ks比值小于1，進(jìn)化時間范圍為5.58×106～93.80×106年（表2）。

2.5 茶樹CsNF-Y基因的保守結(jié)構(gòu)域

本研究使用DNAMAN 6.0對CsNF-YAs、CsNF-YBs、CsNF-YCs的蛋白序列進(jìn)行多重比對。結(jié)果表明，3個亞科都有保守結(jié)構(gòu)域，在CsNF-YAs中，由52個氨基酸組成的與擬南芥NF-YA保守結(jié)構(gòu)域高度相似的氨基酸結(jié)構(gòu)（圖5-A）；與CsNF-YAs一樣，經(jīng)過多重序列比對，CsNF-YBs與 CsNF-YCs 分別由84和75個氨基酸組成其保守結(jié)構(gòu)域（圖5-B、圖5-C），并且結(jié)構(gòu)域與擬南芥 NF-YB 和NF-YC亞家族保守結(jié)構(gòu)域高度相似，這與Siefers對NF-Y3個亞族結(jié)構(gòu)的描述［4］一致。但是，在CsNF-Y基因中個別基因保守氨基酸序列存在缺失和改變，說明基因在進(jìn)化過程中功能出現(xiàn)分化。

2.6 茶樹CsNF-Y基因啟動子順式作用元件

通過順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，基因家族成員相關(guān)順式作用元件共有3類，分別是脅迫相關(guān)（防御和壓力反應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)、缺氧特異性誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)、傷口反應(yīng)元件、低溫）；發(fā)育相關(guān)（胚乳表達(dá)、種子特異性調(diào)控、分生組織表達(dá)、玉米蛋白代謝調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律控制、柵欄葉肉細(xì)胞、細(xì)胞周期調(diào)控、胚乳特異性陰性表達(dá)、順式作用調(diào)控元件根特異性、光敏色素下調(diào)表達(dá)）；激素相關(guān)（赤霉素反應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、生長素反應(yīng)、MeJA響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)）的順勢作用元件（圖6-a）。在對非生物脅迫相關(guān)順式作用元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，有22個基因含有1個或多個干旱響應(yīng)順式作用元件MBS，3個基因含有GC-motif，35個基因含有脫落酸響應(yīng)順式作用元件ABRE（圖6-b），結(jié)合進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，3個亞家族成員中除了CsNF-YB9沒有ARE抗氧化順式作用元件，其余均有ARE順式作用元件，比較突出的是NF-YB亞家族90%成員含有ABRE順式作用元件，遠(yuǎn)高于NF-YA亞家族（60%）、NF-YC亞家族（73%）。

2.7 茶樹CsNF-Y基因脅迫下的表達(dá)分析

本研究從NCBI-SRA獲得RNA-seq數(shù)據(jù)（干旱與鹽脅迫：ERP012919），根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得出的TPM表達(dá)量篩選出NF-Y基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)構(gòu)建45個基因的熱圖，以觀察這些基因的表達(dá)水平（圖7）。結(jié)合熱圖與啟動子分析，本研究發(fā)現(xiàn)5個完全無表達(dá)基因（CsNF-YB3、CsNF-YB11、CsNF-YC13、CsNF-YC14、CsNF-YC15），表達(dá)的40個基因中有22個基因含有不同數(shù)量的MBS順勢作用元件，8個基因干旱脅迫下表達(dá)量升高，5個基因不表達(dá)，其余基因出現(xiàn)不同程度表達(dá)量降低。結(jié)合進(jìn)化樹分類分析發(fā)現(xiàn)，在鹽處理下，相對于對照處理3個亞家族大部分基因轉(zhuǎn)錄組豐度變化差異很小，沒有明顯的上升出現(xiàn)，大部分出現(xiàn)降低或維持同一水平，部分基因如NF-YA6與NF-YC5明顯響應(yīng)鹽脅迫并負(fù)反饋；對于干旱脅迫NF-YB13與NF-YB4、NF-YC7等基因表達(dá)出現(xiàn)顯著差異。

挑選了4個差異表達(dá)基因， 通過qRT-PCR分析進(jìn)一步驗(yàn)證基因在干旱與鹽脅迫下的功能（圖8、圖9），結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個選定的基因（CsNF-YA6、CsNF-YB4、CsNF-YC5、CsNF-YC7）中除CsNF-YC7出現(xiàn)負(fù)調(diào)控，其他3個基因在鹽處理的第2天（48 h）均出現(xiàn)不同程度的顯著上調(diào)；在進(jìn)行模擬干旱處理后，CsNF-YA6、CsNF-YB4在處理后4 d均出現(xiàn)明顯上調(diào)（圖9），CsNF-YC5無明顯差異，CsNF-YC7明顯下調(diào)并負(fù)反饋。

3 討論

NF-Y基因已經(jīng)在很多物種中被證實(shí)響應(yīng)干旱脅迫，目前已經(jīng)在棉花［14］、柑橘［15］、大麥［16］、小麥［10］、桃［17］中鑒定出NF-Y基因并響應(yīng)干旱脅迫。Mantovani 對NF-Y基因家族的特性做了描述，其中包括相對保守結(jié)構(gòu)域、亞基分類以及相應(yīng)的生物學(xué)功能［18］，這為接下來的分析提供了便利。在茶樹中共鑒定出45個NF-Y成員，擬南芥（36個）、柑橘（22個）、西瓜（19個）、梨（24個）、番茄（59個）［19］，對比之下茶樹的NF-Y基因相對較多，這可能是茶樹基因組相對較大或者在進(jìn)化過程中出現(xiàn)大量的基因復(fù)制造成的?；驈?fù)制是基因多樣化的基礎(chǔ)，從而實(shí)現(xiàn)了遺傳新穎性，因此基因復(fù)制也是物種進(jìn)化與適應(yīng)的主要來源［20］。本研究中，筆者所在課題組鑒定了45個基因分布在14條染色體上，大多數(shù)CsNF-Y基因分布于2端，這可能為CsNF-Y基因復(fù)制提供了便利。在45個CsNF-Y基因組中發(fā)現(xiàn)有18個基因參與片段復(fù)制，7個基因參與串聯(lián)復(fù)制，因此片段復(fù)制是其擴(kuò)張的主要復(fù)制方式。由于基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1，表明所有CsNF-Y基因選擇了負(fù)純化選擇，同時發(fā)現(xiàn)，同源基因?qū)sNF-YC8和CsNF-YC13氨基酸保守序列相對較少，這可能與發(fā)生非同義突變有關(guān)。此外茶樹的進(jìn)化起始點(diǎn)尚不清楚，無法判斷這些基因的進(jìn)化是否影響評估物種的產(chǎn)生，但是在 CsNF-Y 基因中可以看到最老的基因重復(fù)時間為93.80百萬年前，我們從中可以看到這些基因的進(jìn)化痕跡。

根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域序列可以對基因進(jìn)行分類，NF-YB 和NF-YC通過他們的組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域（HFD）二聚，它可以以非序列特異性的方式結(jié)合DNA，同時作為NF-YA三聚化的支架，然后 NF-YA 特異性識別CCAAT box序列，因此NF-Y成員相互作用于相互作用域與CCAAT位點(diǎn)的DNA結(jié)合域識別［21］；NF-Y基因在植物發(fā)育、生長和繁殖中的特異性特征生長發(fā)揮關(guān)鍵作用，這主要得益于NF-Y的亞基組織和DNA結(jié)合特性，以及對不同蛋白質(zhì)模塊的適應(yīng)能力［22］。以已知的酵母、植物和哺乳動物的NF-Y的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閰⒄?，CsNF-A保守區(qū)C端21個氨基酸序列Y-L-H-E-…G-G-R-F被認(rèn)為，在CCAAT位點(diǎn)與DNA相互作用，推測CsNF-YA保守區(qū)N端21個氨基酸序列Y-V-N-A-...-A-K-A-E與其他2個亞基（CsNF-YB和CsNF-YC）相互作用。

NF-YB和NF-YC的保守序列在結(jié)構(gòu)和氨基酸上具有相似性。NF-YB亞基與H2B組蛋白的組蛋白折疊基序相關(guān)，而NF-YC亞基與H2A組蛋白相關(guān)。以擬南芥中NF-YB的保守區(qū)域?yàn)閰⒄眨?1個氨基酸序列：R-x-L-P-…-E-T-x-Q被認(rèn)為是CsNF-YB的DNA結(jié)合域；此外，氨基酸序列A-N-V-x-…T-x-E-A與氨基酸序列 x-R-K-T-…Y-L-x-x長度分別為40 aa與32 aa，被認(rèn)為是核心區(qū)域與CsNF-YA和CsNF-YC相互作用。在CsNF-YC中發(fā)現(xiàn)，保守區(qū)域的長度為73個氨基酸序列L-P-L-A-D-F-L-V與擬南芥相互作用域相似，被認(rèn)為是CsNF-YC與CsNF-YA/CsNF-YB相互作用的核心區(qū)域，而DNA結(jié)合域由2個氨基酸殘基“A”和“R”組成，這也是NF-Y基因形成異源三聚體復(fù)合物的前提［17］，個別氨基酸的突變可能是在進(jìn)化過程中由于片段復(fù)制等原因造成同源性下降，同時也說明了基因家族成員的擴(kuò)張不僅導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化也導(dǎo)致基因功能分化。

為了確定CsNF-Y基因的進(jìn)化關(guān)系，基于茶樹、擬南芥NF-Y基因的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，茶樹NF-Y基因家族分為3個亞家族（NF-YA、NF-YB、NF-YC），同源關(guān)系越近代表著可能具有相似的生物學(xué)功能，相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)擬南芥NF-YA基因在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)［23］，11個CsNF-YA基因有10個在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)。此外相關(guān)研究中，AtNF-YA5在高ABA濃度下被廣泛誘導(dǎo)［8］，同樣的在茶樹中 CsNF-YA6 在干旱誘導(dǎo)下出現(xiàn)上調(diào)，而在NF-YB中CsNF-YB4也出現(xiàn)了上調(diào)，而對于鹽脅迫下只在第2天出現(xiàn)不同程度的上升，表明CsNF-YB4與CsNF-YA6響應(yīng)干旱脅迫同時響應(yīng)鹽脅迫。在CsNF-YC中，CsNF-YC5、CsNF-YC7對于干旱脅迫與鹽脅迫下的表達(dá)出現(xiàn)差異，這也驗(yàn)證了之前的結(jié)論NF-YC對于干旱的耐受性表達(dá)不一致［24］，CsNF-YA與CsNF-YB基因與干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄模式相似，而CsNF-YC基因與其他非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄模式相似。同時這些基因可以作為研究的候選基因，為進(jìn)一步研究茶樹的抗旱抗鹽機(jī)制提供可能。

基因結(jié)構(gòu)分析表明，大多數(shù)茶樹CsNF-Y基因有內(nèi)含子，表明基因結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，內(nèi)含子可以增強(qiáng)它們所含基因的表達(dá)［25］，CsNF-YA基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，并且都具有較多的內(nèi)含子。為了更全面地研究CsNF-Y基因的進(jìn)化，對CsN-Y基因保守基序進(jìn)行研究。每個亞科都具有相似的保守基序與外顯子-內(nèi)含子組織，基因保守基序數(shù)為1～6個，其中NF-YA特異性的含有基序（3）和（9），有趣的是NF-YB與NF-YC特異性的都含有基序（1），這可能與NF-YB和NF-YC的保守區(qū)域具有同源性有關(guān)。

基因啟動子中的順式元素已被證明，在植物生理反應(yīng)和環(huán)境脅迫中是必不可少的。在CsNF-Y基因中筆者所在課題組確定了其激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和植物發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，其中壓力響應(yīng)順式作用元件最多，其次是激素響應(yīng)順式作用元件。整體上可以看出，NF-YA（4.9個）與NF-YB （4.5個）基因在含有壓力順式作用元件種類和數(shù)量上平均值都比NF-YC （4.4個）基因要多。從側(cè)面也驗(yàn)證了NF-YA、NF-YB、NF-YC 3個亞族響應(yīng)了不同的轉(zhuǎn)錄模式，同時NF-YC可能在響應(yīng)脅迫上不如其他2個亞族。在水稻中，在干旱和高鹽脅迫下，響應(yīng)這2種非生物脅迫的基因啟動子區(qū)，ABRE元素比那些專門響應(yīng)單一脅迫的基因啟動子區(qū)更多。在CsNF-Y基因中都含有1-7個抗氧化順式作用元件ARE，大部分基因都包含1至6個與ABA相關(guān)的順式作用元件ABRE，同時每個CsNF-Y基因都有光信號響應(yīng)元件，說明CsNF-Y基因不僅參與了ABA生物通路同時也對植物生長發(fā)育具有影響。

相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)包括擬南芥NF-YA5、百慕大草Cdt-NF-YC1［26］、大豆GmNF-YA3［27］、擬南芥AtNF-YB1與同源基因玉米ZmNFYB2等基因能顯著提高植株干旱抗性［28］。筆者所在課題組通過qRT-PCR分析表明，4個選定的基因中2個基因在干旱4 d后均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，在鹽處理下，大部分在2 d均出現(xiàn)上調(diào)。在BnNF-YA19、BnNF-YB16的啟動子區(qū)都包含1個或多個ABRE順式調(diào)控元件，這些基因?qū)aCl有特異性響應(yīng)［3］，結(jié)合順式作用元件分析，在選定的4個基因中發(fā)現(xiàn)大多含有不同數(shù)量的ABRE和MBS順式調(diào)控元件。眾所周知，ABREs、MBSs、G-boxs、W-boxs這些順式作用元件在干旱脅迫響應(yīng)和對下游基因表達(dá)的調(diào)控上起著重要作用。表明茶樹NF-Y基因在干旱與鹽脅迫下存在潛在的響應(yīng)機(jī)制。結(jié)合在脅迫、發(fā)育、激素中存在的其他順式作用元件，可以說明在茶樹中 NF-Y 基因在應(yīng)激反應(yīng)和生理發(fā)育過程中都有參與。研究結(jié)果表明，NF-Y基因響應(yīng)干旱脅迫與鹽脅迫，響應(yīng)程度的不一致說明了基因參與干旱脅迫與鹽脅迫響應(yīng)途徑的不同。

4 結(jié)論

自NF-Y家族基因被發(fā)現(xiàn)與非生物脅迫密切相關(guān)以來，NF-Y基因家族也引來了大家的關(guān)注與研究。其中已經(jīng)在玉米、番茄、桃、大豆上鑒定出了 NF-Y 基因家族成員，并對干旱脅迫等非生物脅迫響應(yīng)。本研究以茶樹為對象，并在茶樹中鑒定確認(rèn)了45個基因成員。通過結(jié)構(gòu)分析、基序分析顯示每個亞家族具有典型的特征，對重復(fù)事件的分析可以清晰地看到CsNF-Y基因在基因組內(nèi)通過片段復(fù)制進(jìn)行擴(kuò)展，通過構(gòu)建茶樹、擬南芥的進(jìn)化樹與抗旱響應(yīng)啟動子順式元件分析，借助于擬南芥等植物相關(guān)基因的功能性報(bào)道，筆者所在課題組分析了基因的生物學(xué)功能、基因同源關(guān)系，并證實(shí)了一些基因?qū)θ鏑sNF-YA6、CsNF-YB4具有響應(yīng)非生物脅迫的功能。這為進(jìn)一步分析茶樹的抗旱與抗鹽相關(guān)機(jī)制打下了基礎(chǔ)。最終選取了CsNF-YA6、CsNF-YB4 作為候選基因，為進(jìn)一步分析研究茶樹NF-Y基因的功能并為茶樹的抗旱抗鹽分子機(jī)制提供信息。

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收稿日期：2022-08-04

基金項(xiàng)目：河南省林草局科技興林項(xiàng)目（編號：YLK202138）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號：212102110186）；信陽農(nóng)林學(xué)院青年基金（編號：QN2021013、QN2021016）。

作者簡介：許芳芳（1993—），女，河南駐馬店人，碩士，助教，主要從事植物抗逆脅迫及生態(tài)保護(hù)研究。E-mail：906792515@qq.com。

通信作者：王 輝，碩士，副教授，從事植物造景與養(yǎng)護(hù)研究與教學(xué)。E-mail：13733159426@163.com。