高楊　田燦　姜京京　唐永凱　張成鋒　馮文榮　李冰　陳銘　盧澤宇　蘇勝彥　朱健

摘要：為了解當(dāng)前我國不同地區(qū)克氏原螯蝦種群的遺傳背景情況，以期為人工養(yǎng)殖、新品種選育和資源保護(hù)提供參考依據(jù)。選取江蘇洪澤湖（HZH）、湖北洪湖（HH）、湖南洞庭湖（DTH）、山東微山湖（WSH）、安徽巢湖（CH）、江西鄱陽湖（PYH）6個(gè)典型區(qū)域的克氏原螯蝦群體作為研究對(duì)象，采用14對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)來自6個(gè)地區(qū)的168份樣品進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)。結(jié)果可知，各群體不同標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因數(shù)在3～14之間，平均期望雜合度為0.81，平均多態(tài)信息含量分布在0.42～0.59之間，各群體均處于中高度遺傳多樣性水平。6個(gè)群體均發(fā)生一定程度Hardy-Weinberg平衡偏離，僅有少數(shù)位點(diǎn)在單一群體滿足Hardy-Weinberg平衡，同時(shí)連鎖不平衡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)9個(gè)連鎖座位對(duì)處于不平衡狀態(tài)。遺傳距離結(jié)果顯示，6個(gè)克氏原螯蝦群體的遺傳一致度（I）處于0.127 8～0.643 9之間，各群體間遺傳距離（D）處于0.440 2～2.057 3之間。群體間遺傳分化指數(shù)（Fst）接近0.5，反映出群體間的基因交流水平較弱，存在高度的遺傳分化。AMOVA分析發(fā)現(xiàn)，39.65%的遺傳變異來源于群體間，97.99%的遺傳變異來源于個(gè)體間。遺傳結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，K=5時(shí)，6個(gè)群體間存在顯著的結(jié)構(gòu)差異。上敘結(jié)果可知，6個(gè)地區(qū)的克氏原螯蝦群體具有豐富的遺傳多樣性，群體間出現(xiàn)了顯著分化，可通過隔離保種、雜交、選擇育種等方式保護(hù)利用克氏原螯蝦的種質(zhì)資源，為我國克氏原鰲蝦產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展提供良種支持。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦；遺傳多樣性：微衛(wèi)星標(biāo)記；遺傳結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S917；S966.12文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）05-0191-09

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）別稱淡水小龍蝦，原產(chǎn)自北美洲，20世紀(jì)前中葉引入我國。該蝦具有肉質(zhì)鮮美、生長速度快、環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)的特點(diǎn)，進(jìn)而深受漁民和消費(fèi)者的喜愛［1-2］。21世紀(jì)以來，我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖技術(shù)日益成熟完善，養(yǎng)殖方式愈發(fā)多元，養(yǎng)殖產(chǎn)量也日益增長。據(jù)中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒統(tǒng)計(jì)，我國克氏原螯蝦2018年產(chǎn)量達(dá)163.87萬t，2019年達(dá)208.96萬t，首次突破200萬t，2020年雖受疫情影響，產(chǎn)量仍達(dá)239.37萬t［3］，創(chuàng)下歷史新高。當(dāng)前，克氏原螯蝦已成為我國第六大淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。然而在逆向選擇、捕大留小的生產(chǎn)模式下，養(yǎng)殖后代病害頻發(fā)、規(guī)格參差不齊，嚴(yán)重制約克氏原鰲蝦產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，亟需通過良種選育來提高種質(zhì)性能，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。大量的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)告訴我們，優(yōu)秀的種質(zhì)來源決定了水產(chǎn)生物生產(chǎn)養(yǎng)殖的命脈，而在新品種選育過程中，對(duì)國內(nèi)已存在的主要遺傳資源進(jìn)行遺傳評(píng)估成為首先需要解決的問題。

遺傳多樣性常用來評(píng)估用于選育種質(zhì)的選擇空間，因而受到國內(nèi)外學(xué)者的重點(diǎn)關(guān)注。對(duì)于克氏原螯蝦遺傳多樣性的研究，當(dāng)前主要集中在分子標(biāo)記及區(qū)域群體的選擇上。關(guān)于分子標(biāo)記，常用的檢測(cè)方法有Random Amplified Polymorphic DNA（RAPD）［4-5］、Amplified fragment length polymorphism （AFLP）［6］和Simple Sequence Repeats（SSR）［7-8］。其中，SSR以高的多態(tài)性和共顯性［9］，成為研究克氏原螯蝦遺傳多樣性和遺傳關(guān)系的首選技術(shù)。關(guān)于區(qū)域群體的選擇則較為廣泛，遍及全國克氏原螯蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)省份。邢智珺等采用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了江蘇省境內(nèi)8個(gè)地區(qū)克氏原螯蝦的遺傳多樣性［10］；黃小芳等利用8對(duì)微衛(wèi)星引物分析了廣西境內(nèi)5個(gè)地區(qū)克氏原螯蝦遺傳多樣性［11］。研究結(jié)果均表明，選點(diǎn)區(qū)域內(nèi)克氏原螯蝦群體遺傳多樣性豐富。以上研究選點(diǎn)分布集中于單一或少數(shù)的省份，尚未就全國范圍內(nèi)典型水域的野生克氏原螯蝦群體開展研究。為此本研究進(jìn)行了江蘇洪澤湖（HZH）、湖北洪湖（HH）、湖南洞庭湖（DTH）、山東微山湖（WSH）、安徽巢湖（CH）、江西鄱陽湖（PYH）6個(gè)典型水域克氏原螯蝦野生種質(zhì)資源遺傳多樣性水平的差異研究，以期為克氏原螯蝦養(yǎng)殖提供重要的親本來源，為新品種的選育和野生種的資源保護(hù)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

分別從江蘇洪澤湖（HZH）、湖北洪湖（HH）、湖南洞庭湖（DTH）、山東微山湖（WSH）、安徽巢湖（CH）、江西鄱陽湖（PYH）六大淡水湖泊中捕撈克氏原螯蝦群體，各群體取22～30尾個(gè)體。由表1可知，雌雄加以區(qū)分，剪去尾節(jié)，置于預(yù)先備好裝有乙醇的2 mL離心管中，-20 ℃保存。

1.2 基因組DNA提取

總基因組DNA提取采用苯酚/三氯甲烷法［12］提取尾節(jié)組織的總基因組DNA，DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)純度，[HJ1.5mm]紫外分光光度計(jì)測(cè)定D260 nm和D280 nm，合格的DNA稀釋濃度至0.05 mg/L，保存于 -20 ℃ 加以備用。

1.3 微衛(wèi)星引物擴(kuò)增

參考GenBank已發(fā)表的微衛(wèi)星序列［13］及本實(shí)驗(yàn)室自行開發(fā)的微衛(wèi)星序列共14對(duì)（表2）。正向引物的5′端FAM標(biāo)記，委托無錫天霖生物有限公司加以合成。PCR反應(yīng)總體系：DNA模板 2.0 μL，Taq酶12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，最后加滅菌的超純水至25.0 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，在最適退火溫度下退火10 s，72 ℃延伸 15 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過ABI3730XL測(cè)序儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，通過GeneMarker軟件進(jìn)行基因型分型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用14對(duì)SSR標(biāo)記鑒定到的6個(gè)克氏原螯蝦群體的基因型，使用Popgene32（v1.3.2）軟件［14］對(duì)6個(gè)克氏原螯蝦群體的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、似然比檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡、遺傳分化指數(shù)Fst（F-statistics，F(xiàn)st）、Neis標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離（Ds）和中性進(jìn)行分析檢測(cè)。使用Genepop的列聯(lián)表方法進(jìn)行連鎖不平衡分析［15］。使用Botstein等的方法計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）［16］。遺傳結(jié)構(gòu)分析采用Structue 2.3軟件［17］，遺傳結(jié)構(gòu)圖繪制采用CLUMPP1.1.2［18］和distruct軟件［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 克氏原螯蝦遺傳多樣性分析

通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)14對(duì)微衛(wèi)星引物在168份樣品中的基因型及其頻率分布，14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在6個(gè)克氏原螯蝦群體內(nèi)共檢測(cè)到等位基因124個(gè)。由表3可知，這些標(biāo)記在單個(gè)的克氏原螯蝦群體中的等位基因數(shù)在3～14之間，等位基因數(shù)最多的是PCLG08位點(diǎn)。各群體內(nèi)的等位基因數(shù)在1～8之間不等，平均等位基因數(shù)最低的是巢湖群體，僅為1.93；最高的是洪澤湖群體，數(shù)值達(dá)4.14；其余群體的平均等位基因數(shù)均處于2～3之間不等。各群體的有效等位基因數(shù)在1.00～5.16之間，數(shù)目最多的同樣是PCLG08位點(diǎn)。從等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)的結(jié)果來看，洪澤湖群體分別有11個(gè)和9個(gè)位點(diǎn)的數(shù)值最高，數(shù)值最高的位點(diǎn)數(shù)量遠(yuǎn)超其他群體。而在觀察雜合度和期望雜合度2項(xiàng)指標(biāo)上，洪澤湖群體同樣多數(shù)位點(diǎn)指標(biāo)數(shù)值顯著高于其他群體。14對(duì)微衛(wèi)星的中性測(cè)試分析見表4，可知各個(gè)位點(diǎn)都處于95%置信區(qū)間范圍內(nèi)，屬中性位點(diǎn)。

由表5可知，根據(jù)香農(nóng)指數(shù)分析，洪澤湖克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性最為豐富， 其余5組克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性相差較小，群體間變異程度低。此外，各群體的多態(tài)信息含量介于0.26～0.73之間。當(dāng)PIC值>0.5時(shí)，定義為高多態(tài)性；當(dāng)PIC值處于0.25～0.50之間，定義為中度多態(tài)性。本調(diào)查分析中，洪澤湖群體在14個(gè)位點(diǎn)中均處于高度多態(tài)水平。巢湖群體有3個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)，11個(gè)高度多態(tài)；洞庭湖群體有6個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)，8個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)；洪湖群體有3個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)，11個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)；鄱陽湖群體有5個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)，9個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)；微山湖群體有2個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)，12個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)。綜合可知，洪澤湖群體多態(tài)性水平最高，遺傳多樣性也最為豐富，最適合作為養(yǎng)殖生產(chǎn)中的親本來源。

2.2 6個(gè)群體Hardy-Weinberg平衡分析和連鎖不平衡檢驗(yàn)

Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果，由表6可知，沒有1對(duì)位點(diǎn)在6個(gè)群體中都符合哈代溫伯格平衡，各個(gè)位點(diǎn)在各群體中均存在明顯的哈代溫伯格平衡偏離現(xiàn)象。其中，僅有PCLG10位點(diǎn)在2個(gè)群體中存在哈代溫伯格平衡偏離，剩余的標(biāo)記位點(diǎn)均在多個(gè)群體出現(xiàn)Hardy-Weinberg平衡偏離情況。

對(duì)6組克氏原螯蝦群體進(jìn)行連鎖不平衡檢測(cè)，共檢測(cè)到59個(gè)基因座位對(duì)，其中，巢湖群體和洪澤湖群體均存在6個(gè)連鎖座位對(duì)的不平衡狀態(tài)，鄱陽湖群體是連鎖座位對(duì)處于不平衡狀態(tài)最少的群體，僅為3對(duì)，與此同時(shí)，各個(gè)群體處于不平衡狀態(tài)時(shí)相應(yīng)的連鎖座位對(duì)并不相同。對(duì)于整個(gè)群體而言，一共檢測(cè)到9個(gè)連鎖座位對(duì)處于不平衡狀態(tài)。

2.3 6個(gè)群體遺傳距離分析

遺傳距離結(jié)果見表7，可知6個(gè)克氏原螯蝦群體的遺傳一致度（I）在0.127 8～0.643 9之間，遺傳距離（D）在0.440 2～2.057 3之間。遺傳一致度的數(shù)值結(jié)果同遺傳距離數(shù)值成反比關(guān)系，遺傳一致度數(shù)值越大，遺傳距離越小，反映出的親緣關(guān)系也越接近。6組不同區(qū)域的克氏原螯蝦群體中，微山湖和鄱陽湖群體間的遺傳一致度最高，數(shù)值達(dá)0.643 9，對(duì)應(yīng)的遺傳距離則為最小的0.440 2，說明微山湖和鄱陽湖這2個(gè)群體親緣關(guān)系較近。親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是洪湖和鄱陽湖群體，這2個(gè)群體的遺傳距離達(dá)2.057 3，數(shù)值相比其他群體差距明顯。長年遷徙下，群體間的遺傳距離結(jié)果偏大，各群體間交流受阻，群體為適應(yīng)當(dāng)?shù)厣瞽h(huán)境而出現(xiàn)分化現(xiàn)象。

2.4 克氏原螯蝦遺傳結(jié)構(gòu)分析

Fis結(jié)果顯示，14個(gè)位點(diǎn)均出現(xiàn)負(fù)值，數(shù)值最小的是PCLG28位點(diǎn)，F(xiàn)it結(jié)果顯示，8個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)負(fù)值，數(shù)值最大的是PCLG10位點(diǎn)，僅為0.3，尚未達(dá)0.5水平。Nm反映了群體間的交流程度，Nm越大，基因交流越為頻繁［20］，在數(shù)值上同F(xiàn)st值成反比，F(xiàn)st是反映遺傳分化的指標(biāo)。PCLG02位點(diǎn)下的群體交流程度較為頻繁，達(dá)4.81，同時(shí)，群體間的Fst數(shù)值大多接近0.5，6個(gè)群體僅存在微弱的基因交流，同時(shí)群體間已經(jīng)出現(xiàn)高度分化現(xiàn)象。這可能與克氏原螯蝦自身習(xí)性密切相關(guān)，大部分時(shí)間棲息于自掘的洞穴內(nèi)，且游泳運(yùn)動(dòng)水平不強(qiáng)引起相互間交流較少。AMOVA分析結(jié)果見表8，可知39.65%的變異來自于群體間，97.99%的變異來自于個(gè)體間（P<0.01），個(gè)體間的遺傳變異程度遠(yuǎn)大于群體間。

運(yùn)用Structure軟件對(duì)6個(gè)克氏原螯蝦群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，執(zhí)行K=2～6的假設(shè)，設(shè)定10次重復(fù)，結(jié)果見圖1。K=2時(shí)，巢湖群體和鄱陽湖群體遺傳結(jié)構(gòu)沒有差異；K=3時(shí)，鄱陽湖群體和洪澤湖群體遺傳結(jié)構(gòu)沒有差異；K=4時(shí)，巢湖群體和洪澤湖群體遺傳結(jié)構(gòu)差異不明顯； K=6時(shí)， 各群體間遺傳結(jié)構(gòu)差異不如K=5時(shí)更為明顯。綜合來看，K=5時(shí)，結(jié)果最佳。

3 結(jié)論

3.1 我國大型淡水湖泊克氏原螯蝦遺傳多樣性豐富

遺傳多樣性作為生物多樣性的重要組成部分，是衡量生物攜帶遺傳信息程度的重要指標(biāo)，其水平可直接反映物種的遺傳變異程度，而遺傳變異程度恰能反映物種的生長性能、繁育性能等育種指標(biāo)情況。對(duì)克氏原螯蝦的溯源及入侵路線問題，國內(nèi)的許多水產(chǎn)研究者已經(jīng)進(jìn)行過長足的研究，收集了多個(gè)水系多重地域的克氏原螯蝦種質(zhì)群體進(jìn)行遺傳分析，已經(jīng)初步得出，克氏原螯蝦從我國江蘇省南京市引入，同時(shí)伴隨長江、淮河兩大水系逐漸向外擴(kuò)展［21］。

相較以往的研究，本研究采樣點(diǎn)符合主要克氏原螯蝦群體養(yǎng)殖分布和遷移路線，涉及湖南、湖北、安徽、江西、江蘇、山東6省，且均來源于我國境內(nèi)知名的大型淡水湖泊，研究對(duì)象更加富有代表性。其次，所選取的14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為中高度多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)果更能精確反映這些群體的真實(shí)遺傳多樣性水平。運(yùn)用14對(duì)微衛(wèi)星引物測(cè)出6個(gè)不同克氏原螯蝦群體的平均期望雜合度0.81，平均多態(tài)信息含量0.42～0.59，綜合觀察發(fā)現(xiàn)，六大淡水湖泊的克氏原螯蝦具有較高的遺傳多樣性。遺傳多樣性大小依次為洪澤湖>洪湖>微山湖>巢湖>鄱陽湖>洞庭湖。造成這樣的原因可能是克氏原螯蝦從南京市引入，而洪澤湖隸屬淮河水系地理位置上同屬江蘇省，較好地保留了初始時(shí)的種質(zhì)特征。另外很重要的一點(diǎn)是洪澤湖水域環(huán)境復(fù)雜，水生植物豐富，給個(gè)體間的交流提供了良好的環(huán)境條件。洪湖地處的湖北省近些年來一直都是我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的省份，圍繞水域湖泊更是興建了許多人工養(yǎng)殖基地，人為的引進(jìn)種同野生種之間獲得了基因交流的機(jī)會(huì)，自身遺傳多樣性相對(duì)較高。此外，環(huán)境因素與生物遺傳多樣性息息相關(guān)，物種迫于環(huán)境壓力而引起自身的遺傳變異，同樣也是造成區(qū)域物種遺傳多樣性水平變化的重要原因。綜合發(fā)現(xiàn)，洪澤湖克氏原螯蝦群體遺傳多樣性最豐富，最適合作為人工選育的親本來源。除此外，還可通過建立適當(dāng)規(guī)模的克氏原螯蝦種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)，進(jìn)而有效地留住野生種資源。與之前研究相比，雖說存在采樣點(diǎn)經(jīng)緯度上微弱的差異，但產(chǎn)生的結(jié)果卻是一致的，即我國大型淡水湖泊內(nèi)克氏原螯蝦野生種群的遺傳多樣性豐富，可進(jìn)一步為良種選育提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。一般來說，外來引進(jìn)物種常受瓶頸效應(yīng)和遺傳漂變作用影響，生物多樣性會(huì)有所降低［22］，外來引入的克氏原螯蝦可能經(jīng)過多次雜交及人為的多次引入，造成自身遺傳多樣性不降反升，這一問題需要引起重點(diǎn)關(guān)注。

3.2 我國克氏原螯蝦群體分化現(xiàn)象嚴(yán)重

克氏原螯蝦的引入至今已有60～70年，喜攀爬使其很容易從當(dāng)前水體跨越進(jìn)入其他水體，進(jìn)而同其他水體的相同物種進(jìn)行長期雜交，加上受到不同的空間水文影響、山川河流阻隔，為群體間的分化創(chuàng)造了條件。除此，人為引種也會(huì)加劇原本親緣關(guān)系相近的物種在不同區(qū)域的分布［23］。

本研究采用14個(gè)多態(tài)位點(diǎn)對(duì)6個(gè)地域的克氏原螯蝦分析測(cè)試發(fā)現(xiàn)，各群體均存在顯著的雜合子不足現(xiàn)象。雜合子不足現(xiàn)象多由物種間非隨機(jī)交配或近親雜交引起，常見于多個(gè)物種間［24］。其中，近親雜交在克氏原螯蝦的群體內(nèi)極為普遍。首先，幼年蝦體初期會(huì)附著于母體腹部尋求庇護(hù)，此期間內(nèi)親緣關(guān)系相近的幼蝦會(huì)發(fā)生近交現(xiàn)象。更重要的是，受市場(chǎng)需求刺激，大規(guī)模的捕撈引起野生種群數(shù)量銳減，種群世代間基因比例波動(dòng)大。非隨機(jī)交配和近交結(jié)果導(dǎo)致了所有檢測(cè)位點(diǎn)在所有群體中均偏離哈代溫伯格平衡，僅有少數(shù)位點(diǎn)在單一群體滿足哈代溫伯格平衡，這說明群體間已經(jīng)出現(xiàn)基因型的分化差異。分化的原因可能源于為了適應(yīng)環(huán)境變化的壓力。除此之外，克氏原螯蝦作為一種經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)作物，近些年養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，人工養(yǎng)殖區(qū)域和密度日益增加，而大型淡水湖泊恰好提供了適合進(jìn)行克氏原螯蝦養(yǎng)殖的天然理想化場(chǎng)所，再經(jīng)長期的地理隔離效應(yīng)，已形成相對(duì)獨(dú)立的類群。

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收稿日期：2022-04-13

資助項(xiàng)目：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（編號(hào)：2022XT01）；江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項(xiàng)目（編號(hào)：JBGS［2021］123）；中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（編號(hào)：2021JBFM21）。

作者簡(jiǎn)介：高 楊（1997—），男，安徽銅陵人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物遺傳育種。E-mail：1463455739@qq.com。

通信作者：蘇勝彥，博士，副研究員，研究方向?yàn)槲r蟹遺傳育種，E-mail：ouhaicourse@hotmail.com；朱 健，博士，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物遺傳育種和水產(chǎn)養(yǎng)殖，E-mail：zhuj@ffrc.cn。