陳自華

（定遠(yuǎn)縣林業(yè)局，安徽滁州 239000）

杜仲（Eucommia ulmoides）為杜仲科杜仲屬藥用落葉喬木，中國(guó)所特有的第三世紀(jì)孑遺植物、國(guó)家二類重點(diǎn)保護(hù)植物，不僅是重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，也是中國(guó)名貴滋補(bǔ)藥材，使用量極大，具有很高的栽培價(jià)值[1-5]。杜仲的藥用部位一般是指杜仲樹(shù)干燥后的樹(shù)皮。據(jù)《本草綱目》記載，杜仲干燥后的樹(shù)皮味甘，性溫，有調(diào)理沖任、固經(jīng)安胎的功效，且在《神農(nóng)本草經(jīng)》中也被列為上品。目前，我國(guó)藥用木本植物資源的開(kāi)發(fā)利用還具有一定的局限性，隨著人們養(yǎng)生意識(shí)的增強(qiáng)及植物組織培養(yǎng)新領(lǐng)域的發(fā)展，植物組培將成為苗木培育和開(kāi)發(fā)藥用植物資源重要的、新的途徑。

杜仲為雌雄異株、異花授粉的植物，在進(jìn)行繁殖時(shí)，如果采用有性方式，獲得的子代沒(méi)辦法完全保留母株的優(yōu)良基因，且受到時(shí)間和季節(jié)的限制。因此，為增加杜仲種苗的擴(kuò)繁速度和育苗效率，同時(shí)保留母本植株的優(yōu)良基因性狀，滿足市場(chǎng)需求，采用植物組培的方式來(lái)進(jìn)行育苗。筆者選用華中8 號(hào)優(yōu)良母株作為外植體，采取其不同外植體部位，利用不同的消毒方式進(jìn)行處理，并進(jìn)行試驗(yàn)研究，以期找出杜仲外植體選擇和消毒的適宜方式方法，為其組培快繁技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料。試驗(yàn)地位于安徽省滁州市皇甫山三界林場(chǎng)內(nèi)，該林場(chǎng)自21 世紀(jì)20 年代開(kāi)始引種杜仲并進(jìn)行優(yōu)選，目前主要有華中8 號(hào)、華中5 號(hào)、彩葉杜仲3 個(gè)品種。試驗(yàn)組選在4 月上旬至下旬無(wú)風(fēng)晴朗的上午，挑選華中8號(hào)健康、長(zhǎng)勢(shì)良好的優(yōu)良母株作為外植體，分別采集其帶頂芽、幼嫩莖段、中部莖段和基部莖段的上部枝條，并立即帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 主要的藥品和儀器。組培育苗實(shí)驗(yàn)室位于滁州市定遠(yuǎn)縣西卅店鎮(zhèn)東方金橋公司組培室內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備齊全先進(jìn)，條件良好，非常適宜進(jìn)行植物的組織培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室具有培養(yǎng)基配制常用的化學(xué)藥品、外植體處理消毒劑、滅菌鍋、自動(dòng)灌裝機(jī)、筆式酸度計(jì)等，及接種用的超凈工作臺(tái)和電子分析天平、電子精密天平、鼓風(fēng)干燥箱等其他試驗(yàn)所需的儀器設(shè)備。

1.2 試驗(yàn)方法

將采集回來(lái)的帶頂芽、幼嫩莖段、中部莖段和基部莖段的上部枝條取出，去除多余葉片和雜枝，放置在自來(lái)水下用流水和洗潔精液體清洗掉表面雜物，取出后放置陰涼處晾干，再用自來(lái)水沖洗2.0～2.5 h。預(yù)處理結(jié)束后，拿到實(shí)驗(yàn)室中，在無(wú)菌條件下用剪刀分別按照試驗(yàn)需求長(zhǎng)度剪成頂芽、幼嫩莖段、中部莖段和基部莖段，先用75%酒精浸泡30～40 s，后用無(wú)菌水反復(fù)清洗5～6 次，再用配制好的不同消毒劑分別浸泡處理，浸泡過(guò)程中不斷輕輕搖晃，用無(wú)菌水反復(fù)清洗6～8 次，結(jié)束后取出放入無(wú)菌的容器中備用。在無(wú)菌接種操作臺(tái)上切去外植體材料與液體接觸的約2 cm 傷口部分，再分別根據(jù)所需大小切接于配制好的無(wú)菌培養(yǎng)基上[6-7]。

基本培養(yǎng)基采用經(jīng)過(guò)試驗(yàn)室改良的MS 培養(yǎng)基，即改良的MS+6-BA（0.1～0.5 mg/L）+NAA（0.3～0.5 mg/L），培養(yǎng)基需要在接種前1 周就配制好并放在無(wú)菌室中靜置觀察1周左右，確保沒(méi)有污染或者其他情況方可使用。轉(zhuǎn)接好的培養(yǎng)物放置在恒溫培養(yǎng)室中進(jìn)行觀察，培養(yǎng)室溫度保持在（25±2）℃，空氣濕度保持在70%～75%，光照時(shí)間設(shè)置前7 d 每天10 h，之后每天14 h，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx。統(tǒng)計(jì)3～20 d不同處理的污染率、存活率、枯死率等，并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑處理對(duì)杜仲外植體消毒效果的影響

根據(jù)試驗(yàn)，采用不同的消毒方法，杜仲外植體在消毒處理后的效果也不同，為了獲得更多無(wú)菌苗的數(shù)量，找到相對(duì)有效的消毒方法，試驗(yàn)采用幾種不同的消毒劑對(duì)其外植體進(jìn)行處理。以杜仲的幼嫩莖段作為外植體材料，采用木本外植體常用的0.1% HgCl2、10%次氯酸鈉、6%次氯酸鈉、8%～10% 84 消毒液4 種不同的方式消毒10 min，其他處理步驟保持一致。將處理好的外植體材料轉(zhuǎn)接到改良的MS+6-BA（0.1～0.5 mg/L）+NAA（0.3～0.5 mg/L）培養(yǎng)基上，每盒接種2 個(gè)點(diǎn)，1 個(gè)月后統(tǒng)計(jì)獲得的無(wú)菌苗個(gè)數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

由表1 可見(jiàn)，幾種處理方式中，采用0.1% HgCl2消毒的無(wú)菌苗獲得數(shù)最多，污染率最低，按照污染率從低到高排序，依次為0.1% HgCl2（15%）＜10%次氯酸鈉（30%）＜6%次氯酸鈉（55%）＜8%～10% 84 消毒液（80%），因此，選用0.1% HgCl2進(jìn)行消毒較為適宜。

表1 不同消毒方式對(duì)杜仲外植體的消毒效果

2.2 消毒時(shí)間對(duì)杜仲外植體的影響

經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果可知，0.1% HgCl2消毒劑處理杜仲外植體時(shí)，污染率較低，比較適宜。但表面消毒劑為重金屬化學(xué)劑，對(duì)于植物組織也可能會(huì)有毒害作用，如消毒時(shí)間過(guò)短無(wú)法起到好的消毒效果，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則導(dǎo)致植物組織死亡，因此時(shí)間不同會(huì)產(chǎn)生不一樣的消毒效果，在進(jìn)行外植體消毒時(shí)應(yīng)當(dāng)根據(jù)具體植物種類而選擇消毒劑合適的處理時(shí)間，盡量減少外植體的死亡[8]。因此，研究不同的消毒時(shí)間對(duì)杜仲外植體無(wú)菌苗獲得的影響，以期獲得更佳的消毒方式。將杜仲幼嫩莖段放在0.1% HgCl2消毒劑中浸泡的時(shí)間分別設(shè)置為4、6、8、10、12 min 5 個(gè)時(shí)間段。

由圖1 可知，在0.1% HgCl2消毒劑進(jìn)行外植體消毒時(shí)，在剛開(kāi)始的6～8 min 污染量隨著滅菌時(shí)間的增長(zhǎng)而降低，超過(guò)8 min 后污染率雖仍在下降，但是枯死率卻在不斷上升，從而導(dǎo)致存活率降低，可能是外植體浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)受到重金屬汞離子的毒害而產(chǎn)生死亡。綜上，采用0.1%HgCl2進(jìn)行外植體消毒時(shí)，在考慮降低污染率的同時(shí)也要控制好消毒時(shí)間。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，在消毒8 min 時(shí)杜仲外植體的存活率最高，為92%，此時(shí)污染率和枯死率都較低，因此，杜仲無(wú)菌體系建立外植體以0.1% HgCl2進(jìn)行消毒處理時(shí)，時(shí)間以8 min 最佳。此結(jié)果對(duì)于杜仲組培技術(shù)外植體的處理方式起到了很好的指導(dǎo)作用，有利于外植體處理獲取無(wú)菌苗。

圖1 0.1% HgCl2 消毒劑不同消毒時(shí)間對(duì)杜仲外植體的影響

2.3 不同外植體取材部位對(duì)杜仲存活率的影響

找到最適宜的消毒方式后再進(jìn)行最佳外植體取材部位的研究，將預(yù)處理后的杜仲不同植物組織部位（頂芽、幼嫩莖段、中部莖段、基部莖段）放入0.1% HgCl2消毒劑中浸泡消毒8 min，后用無(wú)菌水反復(fù)清洗5～6 次，再把各部位剪切成所需大小分別接入經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室改良的基本培養(yǎng)基中，每盒2 個(gè)點(diǎn)，共100 個(gè)，于培養(yǎng)室中按照上文所述方法進(jìn)行培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)其污染、枯死以及存活的數(shù)量。

從表2 可以看出，統(tǒng)計(jì)結(jié)果中外植體的頂芽沒(méi)有統(tǒng)計(jì)到枯死數(shù)量，且采用上述方式處理的污染率最低，因此相對(duì)存活率最高，達(dá)到96%。存活率由高到低的順序?yàn)轫斞浚居啄矍o段＞中部莖段＞基部莖段，基部莖段的存活率最低，只有28%。說(shuō)明在4 月取外植體時(shí)間比較適宜，且杜仲的頂芽帶菌數(shù)量較少，比較適宜作為外植體材料。

表2 杜仲外植體不同取材部位的消毒效果

2.4 不同外植體取材部位對(duì)杜仲不定芽誘導(dǎo)的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)了不同部位存活后不定芽的誘導(dǎo)情況，結(jié)果見(jiàn)表3。在進(jìn)行杜仲組培時(shí)，不定芽誘導(dǎo)能力的強(qiáng)弱與其存活率呈正比，其中部分點(diǎn)雖然未被污染，但后期也未曾誘導(dǎo)出不定芽，說(shuō)明不同部位不定芽誘導(dǎo)能力也不同。誘導(dǎo)不定芽能力最強(qiáng)的是頂芽，基部莖段誘導(dǎo)不定芽能力最低；杜仲誘導(dǎo)愈傷組織能力較強(qiáng)。

表3 杜仲不同外植體部位的不定芽誘導(dǎo)效果

3 結(jié)論與討論

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)研究時(shí)最關(guān)鍵的是植物無(wú)菌苗的獲得，外植體的材料大多來(lái)自自然環(huán)境中，其在生長(zhǎng)過(guò)程中不可避免會(huì)帶有各種各樣的細(xì)菌和真菌[9]，且植物在生長(zhǎng)的不同成熟階段，其本身攜帶的菌類數(shù)量和種類也會(huì)有差異，為了讓植物材料能夠減少被細(xì)菌或者真菌感染，獲得足夠多的無(wú)菌苗，需要對(duì)外植體材料進(jìn)行特殊處理。所以在開(kāi)展組織培養(yǎng)時(shí)，外植體材料的選擇和消毒的方式是決定組培成功率的一個(gè)重要且必不可少的環(huán)節(jié)[1]。一般情況下新發(fā)出來(lái)的嫩芽因?yàn)榻佑|外界環(huán)境的時(shí)間較短，所以受到菌群感染的幾率也會(huì)更低；根據(jù)多年的組培經(jīng)驗(yàn)，HgCl2溶液進(jìn)行消毒處理效果相對(duì)其他方式會(huì)更加有效，但因?yàn)槭侵亟饘偃芤海詽舛纫M(jìn)行嚴(yán)格控制。該試驗(yàn)所用試劑藥品廢棄液都按照實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理要求進(jìn)行了處理。

外植體帶菌程度直接關(guān)系到組培質(zhì)量的優(yōu)劣，如何才能高效得到無(wú)菌材料是木本植物進(jìn)行組織培養(yǎng)的難點(diǎn)所在[10]。所以，在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，所選擇的外植體材料在進(jìn)行接種前都必須滅菌，盡可能不帶菌，這也是確定接種成功率的關(guān)鍵。研究證明，在杜仲組培時(shí)選用植物幼嫩部位作為外植體材料，無(wú)菌環(huán)境下采用0.1% HgCl2消毒劑處理8 min 效果最佳，所得到的無(wú)菌苗量也最多。70%～75%酒精有雙重效果，既能夠浸潤(rùn)，又有較高的殺菌作用，卻無(wú)法完全殺滅菌類，必須搭配其他殺菌劑使用。由于HgCl2中的Hg2+可以和帶負(fù)電性的蛋白質(zhì)交叉融合，因而使細(xì)菌中蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性，從而導(dǎo)致酶失活，因而具有良好的消毒效果。該試驗(yàn)表明，采用0.1% HgCl2消毒劑處理杜種外植體時(shí)的最佳時(shí)間是8 min。在用0.1%HgCl2消毒劑處理外植體時(shí)，殺菌時(shí)間不同，殺菌效果不同。同種消毒劑應(yīng)用后，由于殺菌時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然污染量逐漸減少，但植物組織枯死率卻在增加。天然狀態(tài)下杜仲的頂芽、幼嫩莖段、中間莖段和基部莖段都能成為外植體，其中又以頂芽為最佳，幼嫩莖段次之。頂芽帶菌率低，細(xì)胞活性高，容易再分化；而其他部分外植體則較老，細(xì)胞的再分化能力低。所以，在杜仲組織繁殖外植體篩選試驗(yàn)中，幼嫩部位為最佳的外植體。