占坤，楊正利，徐子怡，賴章鳳，李軍，陳羅君，周四喜，李明璽，甘玉迪*

1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2. 修水縣茶葉科學(xué)研究所，江西 九江 332400；3. 江西省寧紅集團(tuán)有限公司，江西 九江 332400

寧紅茶是江西省茶葉“四綠一紅”中的“一紅”，也是我國最早的傳統(tǒng)工夫紅茶之一，具有滋味甜醇，香高持久，葉底紅亮等品質(zhì)特征，受到眾多消費者青睞[1]。在紅茶加工過程中，多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO，EC1.10.3.1）是參與茶葉變色的關(guān)鍵酶[2]，能夠催化多酚類物質(zhì)生成茶黃素類物質(zhì)，對紅茶品質(zhì)形成起著重要作用[3-4]。茶樹品種是決定茶葉品質(zhì)重要因素之一，茶樹良種是茶葉優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的基礎(chǔ)[5]。寧紅茶主產(chǎn)區(qū)九江市修水縣，適制茶樹品種有國家級良種寧州群體種和寧州2 號，以及修水縣茶葉科學(xué)研究所寧州群體種品種園突變的無性系繁殖株系大葉龍[6]等，分析適制寧紅茶茶樹品種PPO 酶學(xué)特性對茶葉品質(zhì)提升具有實際生產(chǎn)意義。

PPO 是由多基因控制的蛋白酶，不同品種間PPO 存在較高遺傳多樣性，有大量單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，品種間含有差異突變位點，可能導(dǎo)致品種間PPO 活性和酶學(xué)性質(zhì)存在較大差異[7-8]。已有研究表明，不同葡萄品種PPO 對鄰苯二酚親和力存在差異性[9]，不同品種馬鈴薯PPO 最適溫度、pH 等都有差異[10]，不同品種蘋果mPPO 表現(xiàn)出顯著不同的特性[11]。不同茶樹品種PPO 性質(zhì)已有諸多研究，如福鼎大白茶和金觀音PPO 活性顯著高于英紅9 號、櫧葉齊[12]；春季采摘期，福鼎大白茶PPO 活性呈現(xiàn)顯著上升趨勢，白葉1號PPO 活性偏低，黃金芽、紫鵑、龍井43 的PPO 活性變化趨勢一致[13]。

PPO 在細(xì)胞中以可溶態(tài)（sPPO）和膜結(jié)合態(tài)（mPPO）兩種形式存在[14]。sPPO 和mPPO的合成和運輸是一個非常復(fù)雜的過程，PPO 進(jìn)入葉綠體前會在細(xì)胞質(zhì)中合成PPO 前體肽，PPO 前體肽先依賴ATP 導(dǎo)入葉綠體基質(zhì)，再通過基質(zhì)肽酶將其進(jìn)一步加工，然后依靠光進(jìn)入到管腔形成成熟的PPO，即sPPO，而前體肽則被轉(zhuǎn)運肽轉(zhuǎn)運至內(nèi)囊體膜上形成mPPO[15-17]。植物體內(nèi)sPPO 直接參與酚類物質(zhì)化學(xué)反應(yīng)，mPPO 要在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞后才能被釋放出來進(jìn)行反應(yīng)[18]。sPPO 和mPPO酶學(xué)性質(zhì)差異較大，兩者對不同底物、不同抑制劑等都有較大差異。寧紅茶風(fēng)味獨特，但目前對寧紅茶品質(zhì)形成機(jī)理相關(guān)研究較少，適制寧紅茶茶樹品種的sPPO 和mPPO 酶學(xué)活性比較也鮮見報道。本研究擬通過對適制寧紅茶茶樹品種的sPPO 和mPPO 進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，確定高PPO 酶活性寧紅茶茶樹品種，助力高茶黃素寧紅茶生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寧州群體種、寧州2 號、大葉龍茶樹品種鮮葉于2022 年7 月19 日上午8 時采摘自九江市修水茶葉生態(tài)科技園種質(zhì)資源圃，寧州群體種樹齡60 a、大葉龍樹齡20 a、寧州2 號樹齡40 a，鮮葉采摘標(biāo)準(zhǔn)均為一芽二葉，采摘后立即用液氮冷凍并置于-80℃的冰箱冷藏。

醋酸鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、抗壞血酸、氯化鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、苯甲基磺酰氟、Triton X-100、Tris-HCl、硫酸銨、叔丁醇、鄰苯二酚、綠原酸、愈創(chuàng)木酚、沒食子酸、咖啡酸、冰醋酸等均為分析純，購自于北京索萊寶科技有限公司。

SpectraMax-M2 酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；Centrifuge 5920 R 冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；DK-98-IIA 型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；pH400 臺式pH 計，安萊立思儀器科技（上海）有限公司。

1.2 mPPO 和sPPO 粗酶提取

取茶樹鮮葉10 g，按照料液比1∶2 加入含有2%（W/V）PVPP、30 mmol·L-1抗壞血酸、1 mmol·L-1EDTA 的50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 6.80），冰浴充分研磨，所得漿液在4 ℃浸提12 h，隨后在4 ℃、8 000 r·min-1離心30 min。收集的上清液即為sPPO 粗酶液。

PPO 粗酶提取參考劉芳等[19]方法，用去離子水沖洗提取的sPPO 濾渣5 次，然后將其溶解于含有0.25% Triton X-100 的50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液（pH 6.8）中；將混合物攪拌2 min，進(jìn)行10 min 超聲處理，在4 ℃下培養(yǎng)1 h，并在8 000 r·min-1下離心15 min。4 ℃環(huán)境下靜置30 min，然后35 ℃水浴鍋保溫15 min，在25 ℃、8 000 r·min-1下離心15 min。透明上清液即為mPPO 粗酶液。

1.3 酶含量與酶活性的測定

1.3.1 酶含量的測定

使用Bradford 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒，根據(jù)BSA 蛋白標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品中的蛋白質(zhì)濃度。利用BSA 標(biāo)樣制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3.04X＋0.51（R2=0.999）。

1.3.2 酶活性的測定

反應(yīng)混合物由0.15 mL 0.20 mol·L-1鄰苯二酚、1.25 mL 0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 6.80）和0.10 mL 酶溶液組成。在37 ℃下靜置5 min，1 個單位的PPO 酶活性（U）被定義為在 420 nm 波長條件下的吸光度每分鐘0.001 單位的變化[20]。

1.4 不同條件下適制寧紅茶茶樹品種酶學(xué)性質(zhì)比較試驗

1.4.1 最適溫度測定

按照1.3.2 章節(jié)方法，其他條件不變，將反應(yīng)溫度分別調(diào)整為25、35、45、55、65、75、85 ℃，測定mPPO 和sPPO 酶活性。

1.4.2 最適pH 值測定

按照1.3.2 章節(jié)方法，其他條件不變，分別在濃度為 50 mmol·L-1的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 分別為3.50、4.00、4.50、5.00、5.50），磷酸鹽緩沖液（pH 分別為6.00、6.50、7.00、7.50），Tris-HCl 緩沖液（pH 8.00 和pH 8.50）條件下，測定sPPO 和mPPO 酶活性。

1.4.3 酶動力學(xué)參數(shù)的測定

分別配制濃度為 6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 mmol·L-1和200.00 mmol·L-1的鄰苯二酚溶液，測定不同底物濃度下酶的活性， 繪制米氏曲線， 并參照雙倒數(shù)（Lineweaver-Burk）作圖，得出直線Y1=ax＋b，其中縱截距值為1/Vmax，斜率為Km/Vmax，即a/b[21]。

1.4.4 底物特異性比較試驗

分別配制0.20 mol·L-1的鄰苯二酚、綠原酸、愈創(chuàng)木酚、沒食子酸和咖啡酸5 種底物溶液與提取酶液反應(yīng)，將底物為鄰苯二酚時測定的活力大小設(shè)置為100%，并按照1.3.2 章節(jié)方法測定sPPO 和mPPO 酶活性。

1.4.5 不同抑制劑條件下酶學(xué)性質(zhì)比較試驗

分別配制 5.00、50.00、100.00 mmol·L-1的抗壞血酸、EDTA、草酸、檸檬酸、碘化鉀、氯化鈉，將1.15 mL 0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 6.80）和0.10 mL mPPO 或sPPO 與0.15 mL 0.20 mol·L-1鄰苯二酚及0.10 mL 抑制劑混合，按照1.3.2 章節(jié)方法測定sPPO 和mPPO 酶活性。

1.4.6 mPPO 和sPPO 熱失活動力學(xué)分析試驗

在不同溫度（45、55、65 ℃和75 ℃）和不同時間（10、20、30、40、50 min 和60 min）下，將0.10 mL mPPO 或sPPO 裝入試管中進(jìn)行處理。待樣品溫度恢復(fù)室溫后，通過公式1～6 測定殘余活性[22]。

式中，A0是初始多酚氧化酶活性；At是時間t時的剩余多酚氧化酶活性；t1/2為多酚氧化酶的失活半衰期（min）；k為熱失活速率（min-1）；D是酶降低至10%活性所需要的時間（min）；ZT值表示D值對溫度的敏感性，即D值變化一個對數(shù)時對應(yīng)的溫度變化；T值為熱力學(xué)溫度（K）；Ea表示多酚氧化酶的反應(yīng)活化能（kJ·mol-1）；R是理想氣體常數(shù)（8.314 J·mol-1·K-1）。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Origin 8.0 繪圖，SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。采用鄧肯法進(jìn)行多重差異比較，當(dāng)P＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶樹品種PPO 比活力比較

如表1 所示，以鄰苯二酚為底物，不同茶樹品種mPPO 比活力均高于sPPO 比活力。不同品種間 mPPO 比活力相差較大，大葉龍mPPO 比活力最高，分別約為寧州2 號和寧州群體種mPPO 比活力的2.02 倍和2.15 倍。不同品種間sPPO 比活力相差較小，大葉龍sPPO比活力最高，為(262.71±12.59)U·mg-1，寧州2 號 sPPO比活力最低，為(112.57 ±14.01)U·mg-1。

表1 不同茶樹品種mPPO 與sPPO 比活力比較Table 1 Comparison of the specific vitalities of mPPO and sPPO in different tea cultivars

2.2 不同茶樹品種PPO 最適溫度比較

如圖1 所示，不同茶樹品種mPPO 和sPPO酶活性隨溫度的升高呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢。mPPO 最適反應(yīng)溫度在40～60 ℃，寧州2號和大葉龍的 mPPO 最適反應(yīng)溫度均為55 ℃，寧州群體種 mPPO 最適反應(yīng)溫度為45 ℃。75 ℃時，寧州群體種和寧州2 號mPPO均出現(xiàn)小峰。sPPO 最適反應(yīng)溫度在30～50 ℃。寧州2 號和寧州群體種sPPO 酶活性變化趨勢基本一致，最適反應(yīng)溫度為 35 ℃，大葉龍sPPO 最適反應(yīng)溫度為45 ℃。

圖1 不同茶樹品種在不同溫度下mPPO 和sPPO 酶活性的比較Fig. 1 Comparison of mPPO and sPPO enzyme activities of different tea cultivars under different temperatures

2.3 不同茶樹品種PPO 最適pH 比較

mPPO 與sPPO 在pH 3.00～9.00 范圍內(nèi)酶活變化分別如圖2 所示。mPPO 酶活性隨pH升高，先上升后下降，再上升后下降，呈現(xiàn)出雙峰型，最適pH 在5.00～8.00。寧州群體種和大葉龍mPPO 最適pH 均為6.00，寧州2 號mPPO 最適pH 為5.50，大葉龍和寧州2 號mPPO 在pH 7.00 出現(xiàn)第二個峰值，寧州群體種mPPO 在pH 7.50 出現(xiàn)第二個峰值。sPPO酶活性隨pH 升高先上升再下降，呈現(xiàn)單峰型，sPPO 最適pH 值在7.00～8.50，大葉龍和寧州2 號sPPO 最適pH 值為7.50，寧州群體種最適pH 值為8.00。

圖2 不同茶樹品種在不同pH 下mPPO 和sPPO 酶活性的比較Fig. 2 Comparison of mPPO and sPPO enzyme activities of different tea cultivars under different pH

2.4 不同茶樹品種PPO 的底物特異性

如圖3 所示，各茶樹品種sPPO 和mPPO對二羥基酚親和力較高，其中，對鄰苯二酚親和力最強(qiáng)，寧州2 號mPPO 對鄰苯二酚親和力最強(qiáng)。以咖啡酸為底物，寧州2 號、寧州群體種和大葉龍的mPPO 酶活性相對較高。以綠原酸和沒食子酸為底物，mPPO 和sPPO 的酶活性比以咖啡酸為底物低。各茶樹品種sPPO 和mPPO 對一羥基酚愈創(chuàng)木酚親和力較弱。

圖3 不同茶樹品種在不同底物下酶活性的比較Fig. 3 Comparison of enzyme activities in different tea cultivars under different substrates

2.5 抑制劑對不同茶樹品種PPO 活性的影響

如表2 所示，在不同抑制劑作用下PPO活性差異顯著，在抗壞血酸和草酸作用下PPO活性差異較顯著?？箟难釋PPO 抑制效果最好，尤其是寧州群體種sPPO，半抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）值為(2.98±0.13)。螯合劑類型的抑制劑，EDTA、草酸、檸檬酸對酶活性的抑制效果有較大的差別，EDTA 對大葉龍sPPO 抑制效果最弱，IC50值為(25.74±0.05)，而EDTA 對適制寧紅茶茶樹品種mPPO 均有活化作用。草酸、檸檬酸對各品種sPPO 與mPPO 酶活性有不同程度的抑制作用。鹵化物抑制劑碘化鉀、氯化鈉對sPPO 與mPPO 活性均無抑制作用。

表2 抑制劑對不同茶樹品種酶活力的抑制參數(shù)比較Table 2 Comparison of inhibition parameters of inhibitors on enzyme activity in different tea cultivars

2.6 不同茶樹品種的PPO 動力學(xué)分析

圖4、圖5 分別為以鄰苯二酚為底物，mPPO 與sPPO 活性倒數(shù)與底物濃度倒數(shù)的線性回歸結(jié)果，寧州群體種mPPO 和sPPO 米氏方程分別為Y=1 613.24X+15.95、Y=952.55X+18.90，大葉龍mPPO 和sPPO 米氏方程分別為Y=6 188.95X+27.62、Y=4 396.45X+20.88，寧州2 號mPPO 和sPPO 米氏方程分別為Y=376.09X+10.87、Y=2 161.55X+20.45。表3 為mPPO 與sPPO 的酶動力學(xué)參數(shù)，Km數(shù)值反應(yīng)酶和底物親和能力大小，Km越小親和力越強(qiáng)，不同品種mPPO 與sPPO 的Km差別較大，寧州2 號mPPO 的Km最小為34.60 mmol·L-1，大葉龍mPPO 的Km最大為224.04 mmol·L-1，寧州2 號mPPO 與鄰苯二酚結(jié)合能力最強(qiáng)。寧州2 號mPPO 的Vmax最大為9.20×10-2ΔA·min-1，大葉龍mPPO 的Vmax最小為3.62×10-2ΔA·min-1。寧州2 號mPPO 的Vmax/Km值最大為265.89，催化效率最高。

表3 不同茶樹品種中sPPO 與mPPO 的酶動力學(xué)參數(shù)Table 3 Enzyme kinetic parameters of sPPO and mPPO in different tea cultivars

圖4 不同茶樹品種的mPPO 活性的米氏曲線（A）和Lineweaver-Burk（B）圖Fig. 4 Michael's curves (A) and Lineweaver-Burk plots (B) of mPPO activity of different tea cultivars

圖5 不同茶樹品種的sPPO 活性的米氏曲線（A）和Lineweaver-Burk（B）圖Fig. 5 Michael's curves (A) and Lineweaver-Burk plots (B) of sPPO activity in different tea cultivars

2.7 不同茶樹品種PPO 的熱失活動力學(xué)比較

不同茶樹品種sPPO 與mPPO 熱失活的一級動力學(xué)模型參數(shù)如表4 所示，45～75 ℃各品種sPPO 與mPPO 的失活速率常數(shù)k、半衰期t(1/2)存在顯著差異。sPPO 與mPPO 的k值隨著溫度升高而增大，表明sPPO 和mPPO 隨溫度升高失活速率越快，sPPO 和mPPO 高溫條件下不耐熱。半衰期t(1/2)、D值是酶穩(wěn)定性的重要參數(shù)[23]，75 ℃時，sPPO 的k值均比mPPO大，sPPO 的半衰期t(1/2)、D值均比mPPO 小，mPPO 比sPPO 耐熱性更好。大葉龍mPPO 失活速率常數(shù)k最低為(41.88±3.16)×10-3min-1，寧州群體種sPPO 失活速率常數(shù)k最高，比大葉龍 mPPO 失活速率常數(shù)k高 2 倍，為(92.42±9.31)×10-3min-1。大葉龍mPPO 半衰期t(1/2)=(17.68±4.61)min，D=(58.73±5.31)min 均為最高， 而寧州群體種 sPPO 半衰期t(1/2)=(8.96±3.66)min，D=(29.76±2.15)min 均為最低，表明大葉龍mPPO 耐熱性最好，寧州群體種sPPO 耐熱性最差。

表4 不同茶樹品種sPPO 與mPPO 失活的一級動力學(xué)模型參數(shù)Table 4 First-order kinetic model of sPPO and mPPO inactivation in different tea cultivars

Ea值反映酶構(gòu)象結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，ZT值表明酶對溫度的敏感性[24-25]。不同品種 sPPO 的Ea值在59.24～131.86 kJ·mol-1，mPPO 的Ea值在39.35～79.38 kJ·mol-1，sPPO 比mPPO 熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，寧州群體種sPPO 的Ea值最高為131.86 kJ·mol-1，大葉龍mPPO 的Ea值最低為39.35 kJ·mol-1，寧州群體種sPPO 熱敏感性最強(qiáng)，大葉龍mPPO 熱敏感性最差。mPPO 的ZT值在 38.93～61.50 ℃，sPPO 的ZT值在19.26～47.57 ℃，sPPO 比mPPO 對溫度敏感性更強(qiáng)，大葉龍mPPO 的ZT值為61.50 ℃，表明大葉龍mPPO 對溫度敏感性最弱，寧州群體種sPPO 對溫度敏感性最強(qiáng)。

3 討論

茶葉加工過程中，PPO 酶活性是決定茶樹品種適制性的重要指標(biāo)，PPO 酶活性高有助于高茶黃素紅茶品質(zhì)的形成[26]。劉仲華等[27]研究表明，不同茶樹品種同工酶存在差異性，PPO 酶活性也存在差異。本研究中適制寧紅茶的茶樹品種間PPO 酶活性也存在差異，以鄰苯二酚為底物，mPPO 比活力均高于sPPO 比活力，這與Zaini 等[28]的研究結(jié)果一致。大葉龍 mPPO比活力最高，為(542.59 ±25.13)U·mg-1，寧州2 號sPPO 比活力最低，為(112.57±14.01)U·mg-1，表明大葉龍mPPO可作為寧紅茶加工較適制酶源。

PPO 有mPPO 和sPPO 兩種存在形式，在細(xì)胞內(nèi)所處的位置不同，參與反應(yīng)所需條件也不相同。不同茶樹品種PPO 理化性質(zhì)差異較大，對影響酶活性主要因素的敏感程度也存在差異。本研究中3 個茶樹品種的sPPO 和mPPO最適反應(yīng)溫度在30～60 ℃，寧州2 號和大葉龍mPPO 最適反應(yīng)溫度最高，均為55 ℃，與孫慕芳等[29]研究信陽群體種 PPO 最適溫度為50～55 ℃一致。寧州2 號和寧州群體種sPPO最適反應(yīng)溫度最低，為35 ℃，與伍夢瑤等[30]研究勐庫大葉種PPO 最適溫度37 ℃接近。因此適制寧紅茶的茶樹品種間PPO 最適溫度存在差異。PPO 酶活性中心、底物離子強(qiáng)度、酶的來源等因素導(dǎo)致PPO 最適pH 值存在差異[31]，本研究結(jié)果顯示，mPPO 最適pH 在5.00～8.00，有2 個峰，pH 為5.50 和7.00 時寧州2 號mPPO活性較高；sPPO 最適pH 值在7.00～8.50，有1 個峰，pH 為8.00 時寧州群體種sPPO 活性最高，與Wang 等[32]結(jié)果一致，可能由于品種間存在不同的同工酶，也可能由于PPO 酶活性中心不同[19]；茶樹品種間各PPO 與不同底物反應(yīng)結(jié)果顯示，mPPO 比sPPO 與底物親和能力強(qiáng)，且mPPO 和sPPO 對二羥基酚有較強(qiáng)親和力，對一羥基酚、三羥基、多羥基酚親和力較弱，寧州2 號mPPO 對鄰苯二酚親和力最強(qiáng)，催化效率最高，PPO 對底物的親和能力與底物結(jié)構(gòu)以及自身同工酶構(gòu)成有關(guān)[31,33]；不同抑制劑對PPO 酶活性抑制機(jī)理和作用效果不同，抗壞血酸主要通過其還原力對PPO 產(chǎn)生抑制作用，能夠?qū)⒅虚g產(chǎn)物鄰醌還原成相應(yīng)的酸，也可將Cu2+還原為Cu+，而且它的抑制作用和濃度有關(guān)[34]。本研究中抗壞血酸對寧州群體種sPPO 抑制效果最好，鹵化物抑制劑對sPPO 與mPPO 活性均無抑制作用。EDTA 可通過耦合銅離子抑制PPO 活性，EDTA 對大葉龍sPPO 抑制效果最弱，而EDTA 對各品種mPPO 均有活化作用，與Liu 等[11]研究結(jié)果一致。有效通過底物或抑制劑調(diào)控PPO 酶活性對寧紅茶品質(zhì)提升具有十分重要的作用。適制寧紅茶的茶樹品種間sPPO 和mPPO 的熱失活遵循一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律，mPPO 比sPPO 耐熱性更好，sPPO 比mPPO 熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，sPPO比mPPO 對溫度的敏感性更強(qiáng)，與Zhou 等[35]和 Han 等[36]研究結(jié)果一致，這可能是由于mPPO 是sPPO 的前體蛋白，在mPPO 成熟過程中前導(dǎo)肽被多肽酶裂解所導(dǎo)致的。大葉龍mPPO 耐熱性最好，熱敏感性最差，對溫度敏感性最弱，而寧州群體種sPPO 耐熱性最差，熱敏感性最強(qiáng)，對溫度敏感性最強(qiáng)。

綜上所述，在不同反應(yīng)條件下，適制寧紅茶的3 個茶樹品種mPPO 和sPPO 存在一定差異，大葉龍茶樹品種mPPO 比活力最高，耐熱性最好，可為寧紅茶生產(chǎn)加工提供合適的酶源。本研究結(jié)果為進(jìn)一步得到高茶黃素寧紅茶奠定一定理論基礎(chǔ)。