孫婭 解修超 徐易潔 鄧百萬

摘 要：為提取紫玉蘭花朵中的揮發(fā)油，分析其揮發(fā)油中的組分，探討其揮發(fā)油的生物活性，為開發(fā)利用這一資源提供科學(xué)依據(jù)。采用正己烷萃取法提取紫玉蘭花的揮發(fā)油，利用氣相色譜

-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分離和鑒定其化學(xué)成分，并通過濾紙片擴散法和MTT法初步研究揮發(fā)油的抑菌活性和抗腫瘤活性。結(jié)果表明：從紫玉蘭花的揮發(fā)油中共鑒定出46種化學(xué)成分，占總揮發(fā)油含量的92%，主要為烯烴類（17種，16.9%）、烷烴類（8種，18.43%）、酯類（6種，3.46%）、酚醇類（6種，4.18%）、醛酮類（4種，1.9%）、雜環(huán)類（1種，9.26%）醚類（1種，1.09%）及其他類別（3種，3.76%），其中含量較高的組分是加爾加拉文（二苯基四氫呋喃衍生物），相對含量達9.26%，其次是烷烴類的二十六烷、二十四烷以及正二十三烷，其相對含量分別為5.05%、4.57%和3.28%，余下物質(zhì)的相對含量均低于2.5%。活性檢測表明揮發(fā)油樣品對枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 、大腸桿菌Escherichia coli、沙門氏菌Salmonella typhl、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus均有抑菌活性，當揮發(fā)油濃度為1 000.0 μg·mL-1時，對枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑達14.8 mm；對人早幼粒急性白血病細胞HL-60顯示出較強的抗腫瘤活性，其IC50達到84.3 μg·mL-1。

關(guān)鍵詞：紫玉蘭花；揮發(fā)油；GC-MS；抑菌活性；抗腫瘤活性

中圖分類號：S 685.15 ??文獻標志碼：A ??文章編號：0253-2301（2023）01-0018-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.1.003

Component Identification and Biological Activity Analysis of theVolatile Oil from the Flowers of Magnolia liliflora

SUN Ya1， XIE Xiu-chao1，2，3，4， XU Yi-jie1， DENG Bai-wan1，2，3，4

（1. Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723001， China; 2. Shaanxi Province Key Laboratory

of Biological Resources， Hanzhong， Shaanxi 723001， China; 3. Qinba Mountain Area Collaborative Innovation

Center of Biological Resources Comprehensive Development in Shaanxi Province， Hanzhong， Shaanxi 723001，

China; 4. Qinba State Key Laboratory of Biological Resources and Ecological Environment （Breeding Base）

Built by Province and Ministry， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723001， China）

Abstract： This paper aimed to extract the volatile oil from the flowers of Magnolia liliflora， analyze the components of the volatile oil， and explore the biological activity of the volatile oil， in order to provide scientific basis for the development and utilization of this resource. The volatile oil from the flowers of Magnolia liliflora was extracted by using the n-hexane extraction， and its chemical constituents were isolated and identified by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Then， the antibacterial activity and antitumor activity of the volatile oil were preliminarily studied through the filter diffusion method and MTT method. The results showed that： A total of 46 chemical components were identified from the volatile oil of Magnolia liliflora flowers， accounting for 92% of the total content of volatile oil， which were mainly alkenes （17 kinds， accounting for 16.9%）， hydrocarbon （8 kinds， accounting for 18.43%）， esters （6 kinds， accounting for 3.46%）， phenolic alcohol （6 kinds， accounting for 4.18%）， aldehydes （4 kinds， accounting for 1.9%）， heterocyclics （1 kind， accounting for 9.26%）， ethers （1 kinds， accounting for 1.09%） and other categories （3 kinds， accounting for 3.76%）， among which the component with a relatively high content was Galgaravin （diphenyl tetrahydrofuran derivatives） with a relative content of 9.26%， followed by hexacosane， tetracosane and n-tricosane with the relative contents of 5.05%， 4.57% and 3.28%， respectively. The relative contents of the remaining substances were all lower than 2.5%. The activity detection showed that the volatile oil samples all had antibacterial activity against Bacillus subtili， Escherichia coli， Salmonella typhl and Staphylococcus aureus. When the concentration of volatile oil was 1 000.0 μg·mL-1， the inhibition zone diameter against Bacillus subtilis was 14.8 mm. It showed stronger antitumor activity against the human acute promyelocytic leukemia cell line HL-60 with IC50 of 84.3 μg·mL-1.

Key words： Flowers of Magnolia liliflora； Volatile oil； GC-MS； Antibacterial activity； Antitumor activity

紫玉蘭Magnolia liliflora Desr.，木蘭科木蘭屬，又名木蘭，為中國特有植物，主要分布在云南、福建、湖北、四川等地，生長于海拔300～1 600 m的地區(qū)，一般生長在山坡林緣［1-3］，現(xiàn)在常用于園林觀賞。其樹皮、葉和花蕾均可入藥，花蕾曬干后稱辛夷，主治鼻炎、頭痛，作鎮(zhèn)痛消炎劑，為我國傳統(tǒng)中藥［4-5］，也可以從花中提煉天然香精，用于化妝品制作。木蘭屬植物的主要成分為揮發(fā)油類化合物，其中單萜和倍半萜類化合物占比例較大［6］。

近年來，研究者從紫玉蘭葉片中提取多酚類、木質(zhì)素類化學(xué)成分并發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化活性、抗炎活性［7-9］。謝章巧［10］采用多種色譜技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代波普技術(shù)分離純化紫玉蘭和白玉蘭干燥葉片中的化學(xué)成分，在分離鑒定的化合物中，得到一種有抑制NO生成的抗炎活性物質(zhì)。研究者還從白玉蘭花朵和花蕾代謝產(chǎn)物的差異來區(qū)別其不同的生理活性，花朵的代謝物在抗癌與抗腫瘤、抗流感與抗菌中均有重要的潛在應(yīng)用，花蕾的代謝物在抗氧化及抗炎和糖尿病治療中有更大潛在作用［11］。胡明麗［12］采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對不同發(fā)育階段的望春玉蘭和寶華玉蘭采用不同的提取方法進行揮發(fā)油成分的比較研究，確定玉蘭花的不同發(fā)育階段其揮發(fā)油含量和有效藥用成分總含量有一定差異。綜上，對紫玉蘭花揮發(fā)油抑菌及抗腫瘤等生物活性分析的研究尚未見報道，特別是紫玉蘭花朵揮發(fā)油的開發(fā)利用研究較少。

本研究以紫玉蘭花為試驗材料，采用正己烷萃取法萃取其中的揮發(fā)油，運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）結(jié)合計算機檢索對其化學(xué)成分進行分析鑒定，并初步研究其揮發(fā)油的抗菌活性和抗腫瘤活性，為進一步合理開發(fā)利用紫玉蘭資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗材料

紫玉蘭花采自陜西省漢中市陜西理工大學(xué)校園內(nèi)。

1.1.2 靶標菌株

大腸桿菌Escherichia coli、沙門氏菌Salmonella typhl、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、白色念珠菌Candida albicans、人骨肉瘤細胞MG-63、人早幼粒急性白血病細胞HL-60，購自美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC），由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

GCMS-TQ8040Ｇ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；JJ224BF型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；OLYNPUS-BX53生物顯微鏡（奧林巴斯株式會社）；德國IKA-VB10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海相凡儀器有限公司）。

1.2.2 主要試劑

試驗用分析純試劑正己烷、甲醇、氫氧化鉀（購于漢中市鑫盛化玻）；培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基（購于上海生工生物工程有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 揮發(fā)油的提取

采集新鮮的紫玉蘭花，稱重，經(jīng)攪拌機攪碎后迅速裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，加入適量正己烷，加熱至40℃，回流提取4 h，同溫回收正己烷得油狀物，稱重、計算得率。采用氫氧化鉀-甲醇酯化法對樣品做酯化處理，得GC-MS檢測用樣品。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜檢測

色譜柱：美國J&W.HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱。程序升溫：以5 ℃·min-1的升溫速率由50℃程序升溫至290℃，恒溫保持20 min。GC氣化室溫度為250℃，載氣為99. 999%高純度氦，流速2.0 mL·min-1。質(zhì)譜條件：離子源為EI源，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230℃。倍增電壓1.28 kVz，質(zhì)量掃描范圍為10～550 aum，掃描速度3.8次·s-1。

定性和定量方法：通過對紫玉蘭花揮發(fā)油成分進行氣相色譜-質(zhì)譜檢測，得到GC-MS分析總離子流圖。檢索美國NIST02L和WILEY275標準質(zhì)譜圖庫確認其成分，運用峰面積歸一化法，借助G170LBA化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，求得各揮發(fā)油成分的相對含量。

1.3.3 抗菌活性檢測

采用濾紙片擴散法測定樣品對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑制作用。取適量揮發(fā)油原液，分別配制成濃度為1 000.0、100.0、10.0和1.0 mg·mL-1的樣品溶液，各加入適量過氧化氫酶，用于消除可能帶來的活性影響。將直徑為6.0 mm的無菌濾紙片置于各濃度樣品的上清液中浸濕，待溶劑揮干后貼在涂有100.0 μL靶標菌懸液（菌液濃度為0.8～1.2×106 CFU·mL-1）的培養(yǎng)基平板上，重復(fù)3次，細菌選用LB培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h；真菌采用YPD培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，分別測量各濃度樣品在不同靶標菌平板上的抑菌圈直徑。以含有過氧化氫酶的正己烷溶液作為空白對照，操作步驟與試驗組相同。

1.3.4 抗腫瘤活性檢測

取對數(shù)生長的人骨肉瘤細胞MG-63和人早幼粒急性白血病細胞HL-60，用胰酶消化后吹打成懸液，以5×104 mL-1的密度接種于96孔板，每孔90 μL，再每孔補加100 μL培養(yǎng)液。以含細胞的1% DMSO培養(yǎng)基為陰性對照。待24 h細胞完全貼壁后，各孔相應(yīng)加入經(jīng)培養(yǎng)液稀釋10倍后的各樣品20 μL（DMSO含量終濃度為1 %），培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后在酶標儀490 nm處測量各孔吸光值。以空白對照孔調(diào)零，重復(fù)3次根據(jù)吸光值計算：腫瘤細胞生長抑制率（％）=（1-OD實驗組/OD對照組） ×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫玉蘭花揮發(fā)油的提取

采集新鮮紫玉蘭花10.0 g。以正己烷作為溶劑，采用正己烷萃取法經(jīng)4 h回流提取，得到淡黃色透明油狀揮發(fā)油1.4 g，其具有特殊香味，密度小于水，經(jīng)計算得率為14.0%。

2.2 紫玉蘭花揮發(fā)油的化學(xué)成分檢測

通過對紫玉蘭花揮發(fā)油成分進行氣相色譜-質(zhì)譜檢測，運用峰面積歸一化法，求得各揮發(fā)油成分的相對含量，結(jié)果見表1。

由表1可知，從紫玉蘭花的揮發(fā)油樣品中共檢出50種成分，經(jīng)多重比對鑒定其中46種化學(xué)成分，占總油量的92%，主要檢測出8類化合物，分別是烯烴類（17種，16.9%）、烷烴類（8種，18.43%）、酯類（6種，3.46%）、酚醇類（6種，4.18%）、醛酮類（4種，1.9%）、雜環(huán)類（1種，9.26%）、醚類（1種，1.09%）及其他類別（3種，3.76%），相對含量最高的主要成分為木質(zhì)素類物質(zhì)：加爾加拉文（二苯基四氫呋喃衍生物）（9.26%），其次為烷烴類物質(zhì)：二十六烷（5.05%）和二十四烷（4.57%）。

2.3 紫玉蘭花揮發(fā)油的抑菌活性測定

由表2可知，紫玉蘭花揮發(fā)油對枯草芽孢桿菌有較強的抑制活性，且揮發(fā)油濃度為1 000.0 μg·mL-1時，對枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑達14.8 mm。而對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌顯示出較小的抑制活性，對白色念珠菌沒有顯示出抑制活性。

2.4 紫玉蘭花揮發(fā)油的抗腫瘤活性分析

由表3可知，紫玉蘭花揮發(fā)油的抗腫瘤活性較強。通過計算得出紫玉蘭揮發(fā)油對兩種腫瘤細胞的IC50分別為543.1 μg·mL-1和84.3 μg·mL-1。當濃度達到100 μg·mL-1時，54.3%的HL-60細胞和45.8%的MG-63細胞受到抑制；當濃度達到1 000 μg·mL-1時，63.1%的MG-63細胞和73.8%的HL-60細胞受到抑制，表明紫玉蘭花揮發(fā)油對HL-60的抗腫瘤活性更強。

3 討論與結(jié)論

劉艷清［13］將采自肇慶學(xué)院校園內(nèi)的紫玉蘭花，采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油，共檢測出56種化合物，其主要組分為γ-衣蘭油烯、（-）δ-杜松醇、杜松-l（10）-4-二烯、α-松油醇以及β-芹子醇。張永欣等［14］對采自北京地區(qū)栽種的紫玉蘭花采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，共鑒定了20種化合物，主要組分為桉樹腦，香檜烯和正庚醛。本研究采用正己烷萃取法提取紫玉蘭花的揮發(fā)油，并運用GC-MS聯(lián)用分析技術(shù)共鑒定出46種化學(xué)成分，主要為烷烴類、烯烴類、雜環(huán)類、酚醇類和其他類化合物，且所含的成分與已報道的主要成分基本一致，但具體含量有所區(qū)別。這說明生境不同的紫玉蘭花，采用不同的提取方法，揮發(fā)油的成分和含量存在一定差異。因此，研究不同生境下藥用植物的揮發(fā)油是非常必要的，通過對紫玉蘭花揮發(fā)油化學(xué)成分的分析，為其化學(xué)成分的深入研究和進一步的資源開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

木蘭屬的化學(xué)成分多在研究木質(zhì)素類、生物堿類以及萜類物質(zhì)［6］，研究較多的是其抗腫瘤、抑菌、抗炎等生物活性［15］。本研究提取的揮發(fā)油原液對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌均顯示出抑菌活性?？鼓[瘤活性檢測表明，紫玉蘭揮發(fā)油對HL-60具有較強的抗腫瘤活性。揮發(fā)油原液主要成分中相對含量最高的為加爾加拉文（二苯基四氫呋喃衍生物）（9.26 %），是一種煙曲霉素衍生物，同時也是一種木質(zhì)素類物質(zhì)，在體內(nèi)具有強烈的抑制內(nèi)皮細胞增殖和血管形成的作用［16］，比煙曲霉素的作用大50倍，且毒副作用小，為較好的抗生素［17］?；诖?，后期可進行相關(guān)試驗，進一步驗證加爾加拉文的生物活性。朱雄偉等［18］提出15%～30%辛夷煎劑對趾間毛癬菌等10種致病性的真菌有抑制作用，高濃度辛夷制劑對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、白喉桿菌、痢疾桿菌、炭疽桿菌和流感病毒也有不同程度抑制作用。梁振等［19］給家兔上頜竇前壁裂隙處向竇腔內(nèi)注入金黃色葡萄球菌，以慶大霉素為對照，考察辛夷注射液抗病原微生物的作用效果，結(jié)果顯示實驗組的治療效果明顯高于對照組。以上研究表明，辛夷的揮發(fā)油中含有抑菌活性成分。而本研究進行的抑菌活性試驗結(jié)果表明，紫玉蘭鮮花揮發(fā)油的抑菌活性并不高，分析原因可能是由于紫玉蘭的花朵在開放的過程中，其揮發(fā)油成分在空氣中揮發(fā)，其中部分有效的活性成分也隨之發(fā)散，后期在進行紫玉蘭花的藥理分析時，可采集未開放的花蕾來開展相關(guān)試驗。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）