周連妹 李智深 黃敏如

(廣東省儲備糧管理集團有限公司韶關直屬庫 512000)

目前，嘔吐毒素檢測方法主要有高效液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法等[10]，其中高效液相色譜法雖可精確定量，但樣品前處理較繁瑣，對操作人員的素質(zhì)要求較高，且儀器昂貴，檢測成本較高，適合大型企業(yè)、科研院校、檢測機構或?qū)z測靈敏度要求較高的單位零散使用，不適合基層糧庫應用于大批量收糧現(xiàn)場。相比之下，便捷、靈敏、低成本及適合大批量樣品篩選的酶聯(lián)免疫檢測方法(ElISA)越來越受到關注[11-12]。本文以膠體金快速定量法檢測玉米嘔吐毒素為例，通過實驗分析總結(jié)了影響檢測結(jié)果的因素，以期為提高檢測結(jié)果的準確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2021年產(chǎn)自吉林和黑龍江的普通黃玉米。

1.2 主要設備和試劑

主要設備及試劑如表1。

表1 主要設備及試劑

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理 樣品按以下5種前處理方式分別進行制備。

(1)將2 kg玉米充分混勻后用四分法分出4份，每份約500 g，分別去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm孔徑的篩子，混勻備用。

(2)將2 kg玉米充分混勻后用四分法分出4份，每份約100 g，分別去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm孔徑的篩子，混勻備用。

(3)將2 kg玉米去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm孔徑的篩子，充分混勻后用四分法分出4份，每份約500 g，混勻備用。

(4)將2 kg玉米去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm孔徑的篩子，充分混勻后用四分法分出4份，每份約100 g，混勻備用。

(5)將2 kg玉米充分混勻后用四分法分出2份，每份約500 g，分別去除雜質(zhì)后粉碎至全部通過0.9 mm和2.0 mm孔徑的篩子，混勻備用。

1.3.2 測定步驟

(1)準確稱量5.0 g粉碎樣品于50 mL離心管，加入25 mL去離子水，渦旋振蕩1 min，靜置1 min。

(2)取1000 μL上清液于1號離心管中，放入離心機5000 r/min，離心1 min。

(3)從1號離心管中取100 μL樣品提取液放入2號離心管，加入1000 μL稀釋緩沖液(DONQ)，渦旋振蕩10 s。

(4)將嘔吐毒素快檢試劑條放入孵育器中，膠紙撕開至黑線處，取300 μL待測稀釋液，緩慢加入試劑條凹槽中后蓋上膠紙，45℃孵育5 min。

(5)讀數(shù)儀調(diào)至DON-00檔，讀數(shù)。

(6)當數(shù)值顯示1501+時，需二次稀釋：從2號離心管取300 μL溶液放入3號離心管，加入1000 μL稀釋緩沖液(DONQ)，渦旋振蕩10 s。再重復上述步驟(4)。

(7)讀數(shù)儀調(diào)至DON-01檔，讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控樣品檢測

按照產(chǎn)品說明要求，分別檢測檢測條自帶的陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控樣品，結(jié)果如表2。

表2 質(zhì)控樣品檢測情況表

由表2可知，陽性質(zhì)控檢測結(jié)果均在500 μg/kg～1500 μg/kg范圍內(nèi)，陰性質(zhì)控檢測結(jié)果均小于100 μg/kg，說明本檢測試條質(zhì)量合格。

2.2 重復性試驗

根據(jù)設備操作步驟說明，將一個1040 μg/kg實物標準樣品重復檢測6次，結(jié)果如表3。

表3 重復性試驗情況表

由表3可知，實物標準樣品嘔吐毒素檢測值的相對標準偏差未超出10%，說明該方法重復性較好。

2.3 粉碎樣品量和樣品縮分方式

取DON未超標的玉米(樣品1-1和樣品1-2)和超標的玉米(樣品2-1和樣品2-2)各一份，分別按樣品前處理(1)和(2)方式制得待測樣品，檢測結(jié)果見表4-1。

表4-1 先縮分后粉碎檢測結(jié)果對比表

分別取DON未超標的玉米(樣品1-3和樣品1-4)和超標的玉米(樣品2-3和樣品2-4)各一份，分別按樣品前處理(3)和(4)方式制得待測樣品，檢測結(jié)果見表4-2。

表4-2 先粉碎后縮分檢測結(jié)果對比表

從表4-1和表4-2可知：粉碎樣品量和樣品縮分方式均對樣品DON檢測數(shù)值的離散度有影響，且毒素超標樣品的檢測值離散度變化更為顯著。同一DON含量水平的玉米樣品，其檢測值的變異系數(shù)隨粉碎樣品量減少而增大。從表4-1來看，粉碎樣品量從500 g降到100 g時，DON含量未超標樣品的檢測值，變異系數(shù)增加了6.2個百分點；DON含量超標樣品的檢測值，變異系數(shù)增加了16.1個百分點。且粉碎樣品量為100 g時，同一份原始樣品分出的四份次級樣品的檢測值已超出該方法的重復性要求[13]。從表4-2來看，同一粉末狀樣品，即先粉碎混勻后縮分，檢測值離散程度最小，但較高含量樣品的變異系數(shù)仍比低含量樣品的大。

分析可能有以下原因：一是讀數(shù)儀本身在不同數(shù)值范圍的精密度不同導致。讀數(shù)儀在數(shù)值未超過1000 μg/kg時，采用50進制，數(shù)值超過1000 μg/kg時，采用100進制。二是樣品本身毒素含量分布不均勻?qū)е?。先粉碎后縮分一方面是樣品粉碎量增加了，另一方面經(jīng)研磨粉碎后樣品粒徑大大降低，在此基礎上充分混勻有助于被測組分的均勻分布。玉米籽粒中水分等營養(yǎng)成分較高，在生長、運輸、存儲等環(huán)節(jié)易受真菌感染，在光照、溫度、水分活度等環(huán)境條件適宜時，產(chǎn)毒霉菌會生長代謝出真菌毒素，產(chǎn)生的真菌毒素在玉米籽粒間的分布具有隨機性、不均勻的特點[14]。有些糧堆中受產(chǎn)毒霉菌污染的糧食顆粒很少，而被污染的籽粒中毒素含量極高[15]，在樣品量較少時，玉米顆粒較大的特點使樣品不均勻性進一步凸顯。三是試樣量較少(5.0 g)對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定程度的影響。試樣量越少檢測結(jié)果誤差越大，研究證明適當增加試樣量可縮小雙試驗誤差[16]。

綜上所述，檢測玉米嘔吐毒素時，制樣環(huán)節(jié)非常關鍵。特別是處理毒素含量較高的樣品時，簡單地縮分出少量樣品進行粉碎，極有可能出現(xiàn)同一樣品檢測值超出允許偏差范圍的情況。因此，需特別注意制備樣品的均勻性和代表性，適當增加粉碎樣品量和試樣量。在確保準確的同時兼顧考慮經(jīng)濟和效率，應在充分混勻的原始樣品中縮分出不少于500 g進行粉碎，且粉碎后的待測樣品要充分混勻再稱取足量試樣檢測。處理臨界值樣品時，在充分混勻原始樣品基礎上，適當增加粉碎樣品量，并結(jié)合多次獨立檢測取平均值的方式確定。

2.4 樣品細度影響分析

取9個玉米樣品，按樣品前處理(5)方式制得待測樣品，檢測結(jié)果見表5。

表5 樣品細度檢驗結(jié)果對比表

由表5可知：經(jīng)配對T檢驗方差分析，T=2.395>T0.05，8=2.31，表明兩種樣品細度的檢測值之間存在顯著性差異，說明樣品粗細對DON檢測值有顯著影響。無論樣品DON含量高低，樣品粉碎顆粒大的檢測值均比粉碎顆粒小的低。且樣品DON含量越高，相差值越大。原因可能是樣品粒徑大的樣品表面積小，同等提取條件下大樣樣品中的DON提取不充分，導致檢測結(jié)果偏低。

2.5 與高效液相色譜法一致性

取6個樣品，分別充分混勻后用四分法各分成兩份，其中一份委托廣東省質(zhì)量監(jiān)督糧油檢驗站用免疫親和層析凈化高效液相色譜法檢測，另一份用膠體金快速定量法檢測。樣品充分混勻后分出500 g，去除雜質(zhì)后粉碎至完全通過0.9 mm孔徑的篩子，混勻備用，檢測時室溫控制在20℃～25℃。檢測結(jié)果見表6。

表6 快速法與高效液相色譜法檢測玉米樣品結(jié)果對比

從表6可知：通過配對T檢驗方差分析，Tmax=2.086

2.6 與高效液相色譜法相關性

以HPLC檢測值為橫坐標，快速法檢測值為縱坐標，通過一般線性模型擬合，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測值具有一定相關性，如圖1所示。當樣品DON含量(<1500 μg/kg)較低時，兩種方法檢測值具有良好的線性關系。如圖2所示，從線性回歸方程：Y=0.9058X+5.3762可知，膠體金快速定量法測得值普遍比HPLC測得值高，且含量越高，相差越大。這與朱云等[17]的研究結(jié)論一致。

圖1 兩種方法檢測值的線性擬合

圖2 低濃度嘔吐毒素兩個方法檢測值的線性擬合

3 結(jié)論

3.1 膠體金快速定量法檢測玉米嘔吐毒素樣品前處理簡單，操作簡便，檢測速度快，重復性較好。在檢測DON含量小于1500 μg/kg時，與高效液相色譜法具有良好的線性相關性，適合基層糧庫應用于大批量樣品的篩查；在檢測高濃度樣品時，準確度與高效液相色譜法相比還存在一定差距。

3.2 制樣環(huán)節(jié)對DON含量的準確分析尤為關鍵，應特別注意樣品代表性和均勻性，粉碎樣品量應不少于500 g；處理臨界值樣品時，在充分混勻原始樣品基礎上，適當增加粉碎樣品量，并結(jié)合多次獨立檢測取平均值的方式確定。

3.3 樣品粉碎顆粒細度對檢測值影響顯著，粉碎粒徑應能全部通過0.9 mm孔徑的篩子。而在原有提取條件下增大粒徑可能會使樣品中DON提取不充分，導致結(jié)果偏低。

4 討論

由于玉米DON含量高低取決于是否感染相應的產(chǎn)毒霉菌，而通過外觀觀察生霉粒和霉變粒多少無法準確判斷DON含量，只能通過專業(yè)設備的檢測得知[18-19]，而檢測分析的每一個環(huán)節(jié)都有可能影響檢測結(jié)果。經(jīng)總結(jié)實驗室制樣環(huán)節(jié)對檢測結(jié)果的影響，同一份原始樣品充分混勻后縮分得出多份小樣粉碎，檢測值的變異系數(shù)仍有不同的差異。進一步思考，DON在玉米等糧食中分布不均勻的特點在扦樣環(huán)節(jié)同樣需要特別注意。扦樣是檢測分析的第一步，樣品扦樣是真菌毒素檢測分析過程中最主要的變異或誤差來源，是準確分析的決定因素[20]。扦樣點、扦樣量對真菌毒素檢測結(jié)果影響較大[21]。如果扦樣操作不規(guī)范或比較隨意，導致樣品代表性失真，再準確的檢測結(jié)果對于被扦樣品來說也將毫無意義。隨著檢測分析中新技術和新方法的應用，檢測準確度和精密度不斷提高，而扦樣環(huán)節(jié)卻沒有引起足夠重視。因此，為更好保證檢測結(jié)果的準確性，保障糧食安全，筆者認為需進一步針對DON等真菌毒素分析檢測制定相應的標準，細化扦樣操作規(guī)范，并加強相關人員技能培訓，確保扦樣代表性。

由于檢測過程涉及的提取液體積較小，在規(guī)范操作移液槍的前提下，應考慮檢驗室環(huán)境溫度變化對溶液體積的影響，而相關標準僅要求稀釋緩沖液從冷藏取出放置室溫后再使用[13]。根據(jù)工作經(jīng)驗，不同室溫對檢測結(jié)果有不同程度的影響，因此建議進一步研究討論明確室溫嚴格控制在20℃～25℃，有助于保障檢測準確性。