夏瀾，傅偉紅，應(yīng)永濤，徐杏，王海瑋，王三紅*

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095；2. 新沂阿湖葡萄產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，江蘇徐州 2214122；3. 新沂市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局作物栽培站，江蘇徐州 221499）

油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid，BR）又稱蕓薹素內(nèi)酯，是廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等器官中的天然甾體化合物[1-2]，在植物的生長發(fā)育過程中起調(diào)節(jié)功能，主要包括細(xì)胞分裂與伸長、參與和調(diào)控植物光形態(tài)建成、促進(jìn)導(dǎo)管分化、影響花粉發(fā)育與育性、衰老等諸多生長發(fā)育過程及對(duì)逆境響應(yīng)過程[3]。在各種植物中共發(fā)現(xiàn)了40余種油菜素內(nèi)酯化合物，總稱為BRs。24-表油菜素內(nèi)酯（24-Epibrassinolide，EBR）是一種人工合成的BRs，不僅具有BRs的各種生理作用，而且具有較高活性，極低濃度即可表現(xiàn)出對(duì)植物的生理調(diào)節(jié)效應(yīng)[4]。目前，EBR已被廣泛使用于促進(jìn)農(nóng)作物生長和提高作物對(duì)逆境的抗性，在改善果實(shí)品質(zhì)和果蔬類產(chǎn)品采后保鮮上的應(yīng)用也日益增加[5]。

已有研究表明，外源噴施EBR可促進(jìn)番茄生長，增加果實(shí)生物量和番茄紅素、游離氨基酸、鈣元素含量及糖酸比，改善其營養(yǎng)品質(zhì)[6]。外源EBR處理促進(jìn)了桃果冷藏過程中能量和蔗糖代謝相關(guān)酶的活性和轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)蔗糖和己糖的積累[7]。采前0.5 mg·L-1EBR處理可提高‘瑞都紅玉’葡萄中花青素、果糖、葡萄糖和多種脂肪酸等不同代謝產(chǎn)物含量[8]。在黃瓜不同生育期噴施NAA和EBR時(shí)，可提高光同化產(chǎn)物從花到果實(shí)的運(yùn)輸效率，最終增加果實(shí)大小[9]。趙芳芳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，EBR處理可以促進(jìn)釀酒葡萄‘美樂’果皮中花色苷積累，進(jìn)而改善果實(shí)著色。采后EBR處理可以延緩藍(lán)莓硬度、總可溶性固形物和酸度的下降，有助于保持藍(lán)莓果實(shí)的營養(yǎng)成分[11]。在果實(shí)膨大期噴施EBR可促進(jìn)‘美樂’葡萄果實(shí)總糖和總花色苷的積累，降低可滴定酸、單寧和總酚含量，從而提高果實(shí)品質(zhì)[12]。

‘陽光玫瑰’葡萄是中晚熟歐美雜交品種[13]，近年來在江蘇省的種植規(guī)模迅速擴(kuò)大，2022年全省種植面積已超過1.33萬 hm2。由于種植戶缺乏栽培管理經(jīng)驗(yàn)，花果精細(xì)化管理不夠，導(dǎo)致果實(shí)成熟不充分，存在糖分、香氣物質(zhì)等積累不足的問題，致使葡萄品質(zhì)參差不齊[14]。針對(duì)這一問題，本試驗(yàn)在‘陽光玫瑰’葡萄的幼果期到膨大期葉面噴施不同濃度的EBR，調(diào)查EBR對(duì)葡萄果實(shí)品質(zhì)和香氣積累的影響，為生產(chǎn)高品質(zhì)‘陽光玫瑰’葡萄提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年3—9月在江蘇省新沂市阿湖鎮(zhèn)葡萄產(chǎn)業(yè)研究院基地進(jìn)行。以‘陽光玫瑰’葡萄為試材，2年生，南北行向，“H”形整形，株行距2.0 m×5.2 m，主干高約1.2 m，采用塑料大棚避雨栽培。選取長勢(shì)一致、生長健壯的植株用于試驗(yàn)。供試藥劑：24-表油菜素內(nèi)酯（純度≥92%，Genview公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4個(gè)處理，采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，以2株為1個(gè)小區(qū)，重復(fù)3次，共24株。在幼果期（5月29日）到膨大期葉面噴施濃度為處理A：0.2 mg·L-1；處理B：0.6 mg·L-1、處理C：1.0 mg·L-1的EBR，以清水為對(duì)照（CK），間隔15 d噴施一次，共噴施3次。噴施時(shí)間為16:00。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 葡萄果實(shí)抗氧化酶活性的測(cè)定

于2021年7月1日、7月3日、7月7日、7月14日、7月29日和9月21日即處理后第1天、第3天、第7天、第14天、第29天、第83天分別取樣測(cè)定果實(shí)抗氧化酶活性。各處理隨機(jī)選取3穗，每穗隨機(jī)剪取10粒。超氧化物歧化酶[15]活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光還原法；過氧化物酶[16]活性、過氧化氫酶[17]活性、丙二醛[18]含量測(cè)定均使用Solarbio公司提供的試劑盒。

1.3.2 葡萄果實(shí)品質(zhì)測(cè)定

果實(shí)于2021年9月21日成熟時(shí)采收，進(jìn)行品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定。各處理隨機(jī)選取9穗葡萄，每穗隨機(jī)剪取10粒，用電子天平測(cè)量粒質(zhì)量；用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量果實(shí)縱橫徑，以縱橫徑之比表示果形指數(shù)。將果肉用紗布擠汁，取上清液用PAL-1手持式糖度儀測(cè)定可溶性固形物含量。用ITALY型水果硬度計(jì)測(cè)定果實(shí)硬度，每個(gè)處理隨機(jī)取27粒，在果實(shí)赤道部位測(cè)量3次，取平均值。用酸堿中和滴定法測(cè)定可滴定酸含量。采用蒽酮比色法測(cè)定葡萄中可溶性糖含量。采用2,6-二氯靛酚滴定法測(cè)定Vc含量。采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量[8]。

1.3.3 果實(shí)香氣物質(zhì)的測(cè)定

采用頂空固相微萃取[19]法萃取果實(shí)香氣成分。新鮮果肉樣品加液氮研磨成粉狀，稱取2 g置于20 mL頂空瓶，加入1.5 g飽和NaCl，以2 μL的3-辛醇0.08 g·L-1作為內(nèi)標(biāo)，用乙醇進(jìn)行梯度稀釋，完成后迅速封口。取樣前先在氣相色譜儀進(jìn)樣口將固相萃取纖維頭250 ℃老化30 min。將制備好的樣品瓶放入Thermo RSH自動(dòng)進(jìn)樣器中等待萃取。萃取過程由進(jìn)樣器的SPME模塊自動(dòng)完成，程序?yàn)椋涸O(shè)定爐溫箱50 ℃平衡25 min，固相微萃取纖維頭250 ℃老化3 min后，在樣品瓶上空吸附20 min，插入進(jìn)樣口（250 ℃）解析5 min，啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

氣相色譜與質(zhì)譜條件：香氣成分的分離與采集在三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（Trace1310/TSQ 9000，Thermo Scientific）上完成。色譜條件：分離用TG-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He（99.999%），流量1.0 mL·min-1，分流比4∶1；程序升溫，進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱溫起始溫度50 ℃保持6 min，以3 ℃·min-1升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min-1升溫至260 ℃保持2 min。質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度270 ℃；離子源溫度280 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍33～350 amu。3次重復(fù)，取均值。

化合物鑒定基于與標(biāo)準(zhǔn)譜庫NISTlibrary (2017)匹配的質(zhì)譜、實(shí)驗(yàn)所得各化合物的保留指數(shù)與譜庫中保留指數(shù)比對(duì)以確定最終成分。首先在質(zhì)譜的匹配數(shù)據(jù)中篩選出得分大于80分，正反比對(duì)分值大于800的物質(zhì)，而后再參考各化合物計(jì)算出的保留指數(shù)與數(shù)據(jù)庫中的差值，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)最后確定香氣成分。香氣成分的保留指數(shù)計(jì)算：根據(jù)化合物保留指數(shù)的原理，實(shí)驗(yàn)中用40 ng·μL-1的烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（C7-C30，Sigma-Aldrich），得到各個(gè)烷烴的保留時(shí)間，在數(shù)據(jù)處理軟件TraceFinder中計(jì)算各香氣成分的保留指數(shù)。

定量計(jì)算方法：香氣組分含量（ng·g-1）=[各組分峰面積×內(nèi)標(biāo)濃度(g·L-1)×內(nèi)標(biāo)體積(μL)]/[內(nèi)標(biāo)峰面積×樣品量(g)]×1000。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel進(jìn)行圖表制作，用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析、相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施EBR對(duì)葡萄果實(shí)抗氧化酶活性的影響

如圖1所示，所有處理葡萄果實(shí)SOD活性隨時(shí)間均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。處理后第1天至第14天，果實(shí)SOD活性上升。各處理組果實(shí)SOD活性與CK相比均有所升高，且處理B的果實(shí)SOD活性在處理后第3天、第14天提高明顯。果實(shí)成熟采收時(shí)，果實(shí)SOD活性與其它時(shí)間相比均達(dá)到最低，其中處理B的果實(shí)SOD活性顯著高于CK 16.93%。

圖1 不同濃度EBR處理對(duì)‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)SOD、POD、CAT活性和MDA含量的影響Figure 1 Effects of different concentrations of EBR on the SOD, POD, CAT activities and MDA contents of 'Shine Muscat' grape

如圖1所示，各處理葡萄果實(shí)的POD活性隨果實(shí)生長呈現(xiàn)與SOD活性相似的趨勢(shì)。處理后第29天與CK相比，處理A和處理B的POD活性顯著升高。果實(shí)成熟采收時(shí)，POD活性達(dá)到最低。

如圖1所示，各處理葡萄果實(shí)CAT活性隨時(shí)間整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。與CK相比，處理后第1天至第7天，各處理組的果實(shí)CAT活性均有所升高，其中第3天和第7天升高顯著。果實(shí)成熟采收時(shí)，果實(shí)CAT活性與其它時(shí)間相比均達(dá)到最低，且各處理組的果實(shí)CAT活性均高于CK。

由圖1可知，各處理葡萄果實(shí)MDA含量隨時(shí)間呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。與CK相比，處理后第1天處理A和B的果實(shí)MDA含量均有所下降，處理后第3天CK下降，與處理A、Buu顯著差異。處理后第14天至果實(shí)成熟采收時(shí)，各處理果實(shí)MDA含量與CK相比均有所下降，其中處理A果實(shí)MDA含量在果實(shí)成熟采收時(shí)顯著降低。

2.2 噴施EBR對(duì)葡萄果實(shí)外在品質(zhì)的影響

根據(jù)表1可知，各處理粒質(zhì)量大小為A＞C＞B=CK，其中處理A的果實(shí)粒質(zhì)量顯著高于CK8.09%。各處理縱徑與CK相比均不存在顯著差異。處理B的果實(shí)橫徑與CK之間均無顯著區(qū)別，處理A的果實(shí)橫徑顯著高于CK，處理C的果實(shí)橫徑顯著低于CK。各處理果形指數(shù)與CK均不存在顯著差異，且均大于1，表明果實(shí)的縱徑生長速度大于橫徑。隨著EBR濃度的增加，‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)硬度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，且各處理組與CK間均存在顯著差異。

表1 噴施不同濃度EBR處理對(duì)果實(shí)外觀品質(zhì)的影響Table 1 Effects of different concentrations of EBR on berry external quality

2.3 噴施EBR對(duì)葡萄果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的影響

如表2所示，各處理可溶性固形物含量大小為B＞C＞CK＞A，處理B和C的果實(shí)可溶性固形物含量相比CK分別提高3.95%、1.11%。處理A和B可在一定程度上降低果實(shí)可滴定酸含量，但與CK均不存在顯著差異。處理B的果實(shí)固酸比顯著大于CK。各處理可溶性糖含量大小為B＞A＞C＞CK，其中處理A和B的可溶性糖含量顯著高于CK 5.01%、7.67%。各處理果實(shí)Vc含量與CK相比差異不顯著；果實(shí)可溶性蛋白含量與CK相比均存在顯著差異，并隨著EBR濃度的增加逐漸升高。綜上，處理B即0.6 mg·L-1EBR能夠顯著提高果實(shí)可溶性固形物含量，降低果實(shí)酸度，提高固酸比，同時(shí)顯著增加果實(shí)可溶性糖和可溶性蛋白含量。

表2 不同濃度EBR處理對(duì)‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的影響Table 2 Effects of different concentrations of EBR on internal quality of 'Shine Muscat' grape

2.4 噴施EBR對(duì)葡萄果實(shí)香氣種類和含量的影響

不同濃度EBR處理的‘陽光玫瑰’葡萄果肉中共檢測(cè)出香氣物質(zhì)6類，其中萜烯類5種、醇類10種、醛類9種、酮類3種、酯類2種和其他物質(zhì)8種，共計(jì)37種。醇類和醛類物質(zhì)是‘陽光玫瑰’葡萄果肉中的主要香氣成分。

由表3可知，香氣物質(zhì)總含量從高到低依次為CK＞B＞C＞A。4個(gè)處理均檢出的香氣成分有芳樟醇、(+)-α-松油醇2種萜烯類；正戊醇、正己醇、1-辛烯-3-醇3種醇類；乙醛、戊醛、己醛、2-己烯醛、(E)-2-庚烯醛、壬醛6種醛類；乙酸乙酯1種酯類；2,4-二叔丁基苯酚、鄰二甲苯、乙基苯、三氯甲烷4種其它類物質(zhì)，共有16種共有香氣物質(zhì)。在萜烯類物質(zhì)中，各處理中具有玫瑰香味及漿果味的芳樟醇的含量分別為0.93、0.49、1.05、1.00 ng·g-1。同時(shí)，僅CK具有甜的玫瑰花氣息的香葉醇。

表3 不同濃度EBR處理對(duì)‘陽光玫瑰’葡萄香氣成分種類及含量的影響Table 3 Effects of different concentrations of EBR on the types and contents of aroma components of 'Shine Muscat' grape

‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)中主要的芳香化合物是醇類物質(zhì)。其中以具有青草味及蘋果香味的己醇含量最高，正己醇的含量從高到低依次為A＞B＞C＞CK。第二大類芳香化合物是醛類物質(zhì)，其中又以具有青草氣及蘋果香氣的己醛含量最高，與CK相比，處理B和C均能增加己醛物質(zhì)含量。具有柑橘香的癸醛為CK所獨(dú)有的香氣成分，具有花香的苯乙醛為處理C的獨(dú)有的香氣成分。果實(shí)香氣中酮類、酯類和其他類物質(zhì)含量較少。4個(gè)處理中均具有草莓香味的乙酸乙酯，其中具有青甜香的香葉基丙酮僅在處理C中檢測(cè)到。各處理都檢測(cè)到具有特殊芳香味的2,4-二叔丁基苯酚，且CK中含量最高。

3 討論與小結(jié)

油菜素內(nèi)酯是一種新型植物內(nèi)源激素，是公認(rèn)的活性較高的廣譜、無毒、高效的植物生長激素，對(duì)植物生長發(fā)育起調(diào)節(jié)作用[20]。有研究表明，久保桃果實(shí)采后用5 μmol·L-1油菜素內(nèi)酯浸泡10 min，可以提高果實(shí)的SOD、POD、APX活性，并且會(huì)降低MDA含量，進(jìn)一步提高果實(shí)總抗氧化能力[21]。本研究結(jié)果表明，噴施不同濃度的EBR能夠增強(qiáng)采收前葡萄果實(shí)中SOD、POD、CAT抗氧化酶活性，降低果實(shí)中MDA含量，與前人結(jié)果基本一致。劉妍[22]研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)色期前對(duì)‘美樂’葡萄進(jìn)行EBR處理，可顯著提高果實(shí)橫縱徑和粒質(zhì)量；王愛玲等[23]對(duì)‘火焰無核’葡萄全樹噴施不同濃度的油菜素內(nèi)酯，結(jié)果表明，0.2、0.4、0.8 mg·L-1BR均能夠提高果實(shí)硬度。本試驗(yàn)中0.2 mg·L-1EBR和0.6 mg·L-1EBR處理能夠促進(jìn)果實(shí)縱橫徑的增加，改變果形指數(shù)，可能是EBR在果實(shí)細(xì)胞分裂和生長上起促進(jìn)作用，并且各處理在一定程度上能夠提高果實(shí)粒質(zhì)量和硬度。

在葡萄果實(shí)生長期，噴施EBR可影響果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)。馮曉雪[24]發(fā)現(xiàn)，對(duì)‘紅地球’葡萄全樹噴施0.2～0.8 mg·L-1BR可提高果實(shí)可溶性固形物和Vc含量，0.2、0.4 mg·L-1BR可降低可滴定酸含量，提高固酸比。孫嘉茂等[25]發(fā)現(xiàn)，在蘋果果實(shí)采前混合噴施茉莉酸甲酯（MeJA）與EBR可延緩果實(shí)可滴定酸以及抗壞血酸含量的下降，減緩內(nèi)在營養(yǎng)物質(zhì)消耗。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，0.6、1.0 mg·L-1EBR能夠有效提高果實(shí)可溶性固形物含量，同時(shí)0.2、0.6 mg·L-1EBR均能夠降低可滴定酸含量，提高固酸比，這與馮曉雪[24]在‘紅地球’葡萄上的結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)中，在葡萄生長期進(jìn)行葉面噴施EBR處理，果實(shí)的可溶性糖、Vc和可溶性蛋白含量有不同程度的提升，相似的結(jié)論在‘火焰無核’‘紫脆無核’葡萄中也有體現(xiàn)[23-24]。

香氣是衡量果實(shí)風(fēng)味的重要感官指標(biāo)之一。本試驗(yàn)‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)中香氣物質(zhì)有6大類共37種。芳樟醇因?yàn)殚撝递^低，且具有玫瑰香味，被認(rèn)為是‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)中重要的香氣物質(zhì)[25]。本試驗(yàn)中，施用EBR的3個(gè)處理果實(shí)中萜烯類物質(zhì)含量低于對(duì)照，這與張暉[28]對(duì)釀酒葡萄‘赤霞珠’的研究結(jié)果一致，表明噴施外源激素EBR對(duì)葡萄果實(shí)中萜烯類化合物形成沒有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)中主要香氣物質(zhì)是醇類和醛類，醇類物質(zhì)有10種，以3-己烯-1-醇和正己醇為主；醛類物質(zhì)有9種，以己醛為主。同時(shí)具有甜的玫瑰花氣息的香葉醇和具有柑橘香的癸醛僅存在于對(duì)照中，具有花香的苯乙醛和具有青甜香的香葉基丙酮僅存在于1.0 mg·L-1處理，這說明不同濃度的EBR對(duì)‘陽光玫瑰’葡萄香氣影響不同。張暉[28]對(duì)‘赤霞珠’葡萄的研究表明，EBR處理能夠顯著增加葡萄果實(shí)中的香氣成分總量，但本試驗(yàn)中施用EBR并未增加果實(shí)中香氣物質(zhì)含量，這可能與葡萄品種和土壤、產(chǎn)地等環(huán)境因素有關(guān)。

綜上所述，噴施不同濃度EBR對(duì)‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)品質(zhì)有促進(jìn)作用，但對(duì)葡萄果實(shí)中香氣物質(zhì)含量增加并沒有促進(jìn)作用。其中3種濃度EBR在一定程度上均能提高葡萄果實(shí)SOD、POD、CAT活性，并降低果實(shí)MDA含量。0.2、0.6 mg·L-1EBR可提高果實(shí)縱徑與橫徑，降低果實(shí)中可滴定酸含量，提高固酸比；0.6、1.0 mg·L-1EBR可提高果實(shí)可溶性固形物含量，并且0.2、0.6、1.0 mg·L-1EBR均可增加果實(shí)硬度，提高可溶性蛋白含量。綜合果實(shí)外在品質(zhì)、內(nèi)在品質(zhì)及生產(chǎn)成本，生產(chǎn)上可以從果實(shí)幼果期開始進(jìn)行多次葉噴0.6 mg·L-1的EBR，以提高果實(shí)品質(zhì)。