褚茜茜 王 暉 馬世紅 王小龍 艾志龍

1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院普外科，上海 200031；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，上海 200032

隨著甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）和橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）發(fā)病率的上升[1]，PTC 并發(fā)HT 在臨床上也逐漸增多。目前國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)試圖從病因、免疫學(xué)等多個(gè)檢測(cè)手段深入探索兩者之間的聯(lián)系[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)PTC 常伴有不同程度的甲狀腺炎的表現(xiàn)，HT 中的某些免疫炎癥因子可能對(duì)PTC 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移起到一定的限制作用[4-5]，也有研究揭示HT 中有大量的T 細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等浸潤(rùn)，這些細(xì)胞中既有能分泌并破壞甲狀腺正常組織形成非典型性增生結(jié)節(jié)的細(xì)胞因子，又有能促進(jìn)正常組織癌變的細(xì)胞因子[6-7]。然而臨床各執(zhí)己見(jiàn)，對(duì)于兩者之間關(guān)系的闡述至今都缺乏足夠的循證。本研究通過(guò)免疫組化的方法比較白介素-6（interleukin-6，IL-6）在PTC 合并HT 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及陰性患者在年齡、性別、腫瘤大小、包膜有無(wú)侵犯、臨床分期，以及正常甲狀腺組織、癌旁HT 組織、癌組織等方面的異同，初步探討IL-6 在HT 及PTC 中的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院（我院）2019 年11 月至2021 年10 月住院行甲狀腺手術(shù)患者80 例，所有入組患者臨床資料的收集均得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。其中40 例為PTC 合并HT 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（A 組），男8 例，女32 例，年齡21 ～58 歲，平均（38.33±4.15）歲，平均病程5.28 年，根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）分期[8]方法：年齡≤55 歲者17 例，＞55 歲者23 例；腫瘤大小≤2 cm 者26 例，＞2 cm者14例；包膜有侵犯者26例，無(wú)侵犯者14例；TNM 臨床分期Ⅰ～Ⅱ期27 例，Ⅲ～Ⅳ期13 例。另40 例為PTC 合并HT 無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（B 組），男7 例，女33 例，年齡19 ～59 歲，平均（39.13±4.09）歲，平均病程4.88 年，根據(jù)AJCC 分期方法：年齡≤55 歲者18 例，＞55 歲者22 例；腫瘤大小≤2 cm 者27 例，＞2 cm者13 例；包膜有侵犯者24 例，無(wú)侵犯者16 例；TNM 臨床分期Ⅰ～Ⅱ期37 例，Ⅲ～Ⅳ期3 例。所有患者術(shù)前均無(wú)放療或化療史。兩組患者一般資料（性別、年齡、病程、腫瘤大小、包膜有無(wú)侵犯、臨床分期）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），具有可比性。

1.2 方法

采用免疫組化ElivisionTM Plus 法檢測(cè)患者正常甲狀腺組織、癌旁HT 組織、癌組織標(biāo)本IL-6 的表達(dá)。鼠抗人IL-6 購(gòu)自Abcam 公司，所有標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 厚度連續(xù)切片，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明做常規(guī)HE 染色及免疫組化染色，切片脫蠟水化，高溫抗原修復(fù)兩次，3% H2O2孵育，阻斷劑阻斷，加入一抗（濃度1 ∶200），4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育30 min，DAB 顯色、脫水、透明、封片，觀察。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

隨機(jī)選擇5 個(gè)以上高倍鏡視野，若胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)淡黃色至棕褐色的顆粒物質(zhì)，則為標(biāo)記為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率，按照陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分，＜5%計(jì)為0 分，5%～25%計(jì)為1 分，26% ～50% 計(jì) 為2 分，51% ～75% 計(jì) 為3 分，＞75%計(jì)為4 分；顯色強(qiáng)度對(duì)照色卡，以大多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的顏色進(jìn)行計(jì)分，未顯色計(jì)為0 分，淡黃色計(jì)為1 分，棕黃色計(jì)為2 分，棕褐色計(jì)為3 分，將陽(yáng)性細(xì)胞百分率和顯色強(qiáng)度兩者的計(jì)分相加，0 ～2 分為陰性（-），≥3 分為陽(yáng)性（+）[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，每?jī)山M間試驗(yàn)結(jié)果差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)、Fisher 確切概率法（雙側(cè)）檢驗(yàn)。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果

IL-6 免疫組化染色陽(yáng)性主要在細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中，呈淡黃色至棕褐色的顆粒狀染色，兩組患者的正常甲狀腺上皮組織，IL-6 呈弱陽(yáng)性染色，表達(dá)分布在細(xì)胞膜中，A 組的表達(dá)陽(yáng)性率為5.00%（2/40），B 組的表達(dá)陽(yáng)性率為5.00%（2/40）（圖1A、2A）；IL-6 在癌旁HT 組織中的表達(dá)分布在細(xì)胞漿中（圖1B、2B），呈陽(yáng)性染色（淡黃色至棕黃色），A 組的表達(dá)陽(yáng)性率為75.00%（30/40），B 組的表達(dá)陽(yáng)性率為52.50%（21/40），A 組癌旁HT 組織IL-6 表達(dá)高于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.381，P=0.036）；IL-6 在癌組織中的表達(dá)分布在細(xì)胞漿中（圖1C、2C），呈陽(yáng)性染色（棕黃色至棕褐色），細(xì)胞間質(zhì)未見(jiàn)陽(yáng)性染色，A 組的表達(dá)陽(yáng)性率為95.00%（38/40），B 組的表達(dá)陽(yáng)性率為80.00%（32/40），A組癌組織IL-6 表達(dá)高于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.275，P=0.012）。

圖1 免疫組化檢測(cè)A 組患者IL-6 蛋白表達(dá)（40×）

圖2 免疫組化檢測(cè)B 組患者IL-6 蛋白表達(dá)（40×）

2.2 兩組IL-6表達(dá)與臨床病理指標(biāo)關(guān)系

IL-6 在PTC 合并HT 的癌組織中的表達(dá)與患者的性別和年齡無(wú)關(guān)（P＞ 0.05），與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)（P＜ 0.05），見(jiàn)表1。IL-6在兩組患者的癌旁HT 組織中的表達(dá)陽(yáng)性率有明顯差異，A 組高于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；IL-6 在兩組患者的癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率有明顯差異，A 組高于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表2。

表1 IL-6在PTC合并HT患者甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性率比較

表2 IL-6在A、B組患者不同組織中表達(dá)水平的比較

3 討論

PTC 是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生卻涉及很多機(jī)制，其中細(xì)胞因子使得免疫功能紊亂而致病的機(jī)制一直受到學(xué)者的關(guān)注。IL-6 是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子亞型之一，其作為一種多效性細(xì)胞因子，參與機(jī)體內(nèi)多種疾病發(fā)生過(guò)程，有證據(jù)表明，IL-6 在過(guò)敏性蕁麻疹、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病等疾病中水平明顯升高；在亞急性甲狀腺炎、Graves’病、胺碘酮誘發(fā)的甲狀腺毒癥等自身免疫性甲狀腺疾病中也顯著升高。很多學(xué)者通過(guò)比較甲狀腺內(nèi)靜脈血和外周靜脈血IL-6 含量，證實(shí)內(nèi)分泌細(xì)胞會(huì)分泌和合成IL-6[11]，有研究發(fā)現(xiàn)HT 的女性血清中IL-6 水平有所增加，IL-6可以調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞的分化，在甲狀腺疾病中表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化因子蛋白-1 在濾泡上皮細(xì)胞中產(chǎn)生，其參與多種內(nèi)分泌疾病的發(fā)生發(fā)展[10]，在與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度及甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá)呈正相關(guān)。段宇等[11]還發(fā)現(xiàn)甲狀腺表面含有IL-6等細(xì)胞因子受體，此類受體可通過(guò)抗原抗體復(fù)合物的形式，由gp130 介導(dǎo)傳遞信號(hào)，證明該信號(hào)通路與甲狀腺癌相關(guān)，說(shuō)明IL-6 促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，亞急性甲狀腺炎、Graves’病和甲狀腺功能亢進(jìn)患者外周血中IL-6 含量均有異常變化，有學(xué)者在對(duì)自身免疫性甲狀腺疾病進(jìn)行IL-6 mRNA 表達(dá)的測(cè)定時(shí)還發(fā)現(xiàn)濾泡細(xì)胞中有表達(dá)IL-6 mRNA 的陽(yáng)性細(xì)胞，且IL-6 mRNA 表達(dá)較強(qiáng)的細(xì)胞與免疫細(xì)胞聚集的部位恰好是甲狀腺病理?yè)p傷程度較嚴(yán)重的部分，提示IL-6 mRNA 的表達(dá)與病理?yè)p傷和免疫細(xì)胞活化之間有正相關(guān)性聯(lián)系。以上觀點(diǎn)說(shuō)明，在正常生理?xiàng)l件下甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生少量IL-6，但在腫瘤及炎癥刺激下，濾泡細(xì)胞受淋巴細(xì)胞及其他調(diào)節(jié)因子的影響，可以異常產(chǎn)生IL-6。

本研究應(yīng)用免疫組化方法對(duì)PTC 合并HT 的80 例患者的病理切片進(jìn)行了表達(dá)水平的檢測(cè)，結(jié)果顯示IL-6 在正常甲狀腺組織少量表達(dá)，與之前學(xué)者觀點(diǎn)一致[12]，在癌旁HT 組織中的表達(dá)水平較正常甲狀腺組織明顯增高，染色呈淡黃至棕黃色，在癌組織中的表達(dá)水平更高，染色呈棕黃至棕褐色，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的IL-6 水平較淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者高，說(shuō)明IL-6 可能促進(jìn)了PTC 及HT 的發(fā)生發(fā)展，對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也有促進(jìn)作用，但其具體在HT 與PTC 之間的相關(guān)性，不能證實(shí)。本研究對(duì)患者性別、年齡、腫瘤大小、包膜有無(wú)侵犯、臨床分級(jí)進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)IL-6 的表達(dá)與年齡和性別無(wú)關(guān)，其腫瘤大小、包膜有無(wú)侵犯、臨床分期等方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），說(shuō)明IL-6 促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，并且對(duì)腫瘤侵犯也有促進(jìn)作用，其與臨床分期有正相關(guān)性。

IL-6 調(diào)節(jié)甲狀腺的機(jī)制尚不明確，由于其可通過(guò)自分泌和旁分泌等方式趨化和激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞、B 細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等，抑制垂體分泌促甲狀腺激素，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)包括甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞發(fā)育，加重自身免疫系統(tǒng)紊亂，故有人提出，IL-6 對(duì)甲狀腺的效應(yīng)，可能是通過(guò)中樞調(diào)節(jié)而發(fā)揮核心作用的細(xì)胞因子之一[13]。然而，又有學(xué)者闡述，IL-6 不減少垂體分泌促甲狀腺激素及其mRNA 的含量，也不影響促甲狀腺素釋放激素的分泌，其只是誘導(dǎo)B 細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生IgG 等抗體，抑制部分甲狀腺細(xì)胞的分化功能[14]，因此，推斷IL-6 作為一種促炎癥因子，可能是通過(guò)某反應(yīng)通路，創(chuàng)造一個(gè)潛在微環(huán)境，影響甲狀腺細(xì)胞本身，達(dá)到調(diào)節(jié)目的，此觀點(diǎn)與上述觀點(diǎn)明顯沖突，具體原因待進(jìn)一步研究。國(guó)外有研究表明[15]，甲狀腺細(xì)胞表面含有IL-6 受體，此受體可以以lL-6R/SlL-6R 的形式存在于血液循環(huán)中，當(dāng)IL-6/IL-6R 或IL-6/SIL-6R 復(fù)合物形成后，可通過(guò)膜信號(hào)蛋白gpl30 介導(dǎo)，可引起IL-6 的信號(hào)傳遞，與國(guó)內(nèi)學(xué)者觀點(diǎn)類似。但Yamazaki 等[16]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞僅表達(dá)微量的IL-6R mRNA 基因，細(xì)胞液中含量更低，也就是說(shuō)IL-6 的信號(hào)傳導(dǎo)并不依賴于膜信號(hào)蛋白gpl30 介導(dǎo)的信號(hào)通路。目前，越來(lái)越多的學(xué)者投入IL-6 等炎癥因子的深入研究中，然而對(duì)腫瘤相關(guān)的炎癥誘導(dǎo)及細(xì)胞免疫卻是眾說(shuō)紛紜，對(duì)于IL-6 調(diào)節(jié)甲狀腺的機(jī)制均缺乏足夠的證據(jù)。

綜上所述，本研究初步探討IL-6 在PTC 合并HT 及淋巴轉(zhuǎn)移中的表達(dá)及臨床意義，為進(jìn)一步了解其信號(hào)通路在免疫性甲狀腺疾病及甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用提供基礎(chǔ)，為甲狀腺免疫性疾病及腫瘤的基因發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及尋找與兩者相關(guān)性的新基因和精準(zhǔn)治療提供新思路。